兔体外循环对胃泌素及其受体的影响
兔体外循环对胃泌素及其受体的影响
徐鹏 易定华
摘 要：目的 研究体外循环(CPB)过程中胃泌素及胃泌素受体的释放对胃液pH值 的影响. 方法 采用兔CPB模型，分别测定CPB过程中胃液的pH值，胃液及血清 中胃泌素质量浓度,并通过原 位杂交的方法检测胃泌素受体mRNA在胃肠道粘膜中的表达. 结果 CPB过程 中胃液的pH值(2.21±0.22)与血液的pH值(7.40±0.15)呈明显相关性(P<0.01),而且 胃 液的pH值随CPB时间增加，CPB组(2.21±0.22)较对照组明显降低(5.30±0.17,P<0. 0 1). 胃液及血清中胃泌素质量浓度随体外循环时间延长较对照组明显增高. 胃泌素受体mRNA 的表 达量(0.43±0.04)%随CPB时间增加较对照组明显增加(0.27±0.08)%，(P<0.01). 结 论 CPB过程中随时间延长，胃液及血清中胃泌素浓度增高，胃液pH值降低及胃泌素 受体mRNA的表达量增高使胃粘膜处于高酸环境中，是CPB术后发生胃肠道并发症的潜在的危 险因素.
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关键词:兔；体外循环；胃泌素；受体；原位杂交
0 引言
胃泌素是重要的胃肠道内分泌激素[1]，主要作用于壁细胞上的胃泌素受体， 调节胃酸 分泌，同时对胃粘膜和壁细胞有营养作用，胃泌素中以胃窦胃泌素分泌细胞产生的17肽(G 17)活性最强，近年来研究[2]认为胃酸分泌失调是引起应激性溃疡的重要 因素之 一. 我们通 过对体外循环(CPB)过程中胃窦组织胃泌素、胃泌素受体、胃窦G细胞、胃液及血清胃泌素的 测定，探讨了体外循环过程中胃泌素产生和分布特点，及其在胃肠道并发症中所起的作用, 为预防体外循环(CPB)手术后胃肠道并发症的发生提供了实验资料.
1 材料和方法
1.1 兔体外循环模型的建立及分组 实验兔术前禁食水6 h，戊巴比妥钠麻醉 (35 mg.kg-1，ip)，切开气管插 管，小动物呼吸机辅助呼吸，股动脉插管测压，胸骨正中切口开胸，3 mg.kg-1肝素 化后，分别 于右颈总动脉、右心房和左心房插入动脉泵管、腔静脉引流管和左心房引流管，连接小型CP B机. 采用体外循环温度为28℃～32℃. 中度血液稀释(HCT：0.20～0.24),中流量(70 ～110 mL.kg-1.min-1),平均动脉压维持在8～12 kPa. 总转流时间 为180 min，其中主动脉阻断60 min，辅助循环时间120 min. 手术对照组动物行单纯麻醉开 胸180 min后留取组织标本. 家兔24只(体质量2 kg左右)由本校实验动物中心提供,雌雄不 拘 ,随机分成CPB组及对照组，每组12只，分别在CPB时间后0，30，60，90，120及180 min取血 及胃液，离心后分装液氮中保存待测.
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1.2 方法
1.2.1 胃泌素受体的RNA变化及定位 取兔胃，沿胃大弯剪开,生理盐水冲洗胃内容 物，钝刀刮取胃窦部粘膜，置冰冻管中液氮保存. CCKB-R cDNA探针由本校神经生物研究 所 张旭惠赠，探针质量浓度40 mg.L-1. 随机引物法地高辛标记CCKB-R cDNA, (地高辛标记检测试剂盒由德国宝灵曼公司提供).
1.2.2 原位杂交 参照Ohro方法[3]略有改进,按下列步骤进行： 组织标本冰冻切片40 g.L-1多聚甲醛固定5 min，梯度乙醇水化，10.2 mL.L-1 盐酸洗20 min，水洗，蛋白酶K(1 g.L-1)37℃消化3 0 min；0.02 g.L-1甘氨酸洗2×5 min；0.025 g.L-1三乙醇胺洗10 min；P BS洗10 min，湿盒内 37℃预杂交4 h，42℃杂交20 h；冲洗后NBT显色，甲基绿复染，透明封片，光镜下观察，照 相.
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2 结果
2.1 胃液pH值随体外循环时间的变化 随体外循环时间延长，胃液中pH 值较对照组明显降低(P<0.01,Fig 1).
2.2 血清胃泌素质量浓度的改变 随体外循环时间延长， 胃液及血清中的胃泌素浓度较对照组明显增高(Fig2,3).
图 1 体外循环胃液pH值的变化
Fig 1 pH changes in gastric juice during CPB
aP<0.05 vs control.
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图 2 体外循环胃液中胃泌素质量浓度的变化
Fig 2 Changes of gastrin mass concentration in gastric juice during CPB
bP<0.05 vs control.
图 3 体外循环血清胃泌素质量浓度的变化
Fig 3 Changes of gastrin mass concentration in plasma during CPB
cP<0.05 vs control.
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2.3 胃窦粘膜CCKB-R mRNA表达 采用原位杂交的方法， 检测CCKB-R mRNA的表达，发现体外循环组的胃泌素受体mRNA的相对表达量较对照组明显 增高(P<0.01,Fig 4).
图 4 体外循环胃泌素受体mRNA的相对含量
Fig 4 Comperative content of CCK-B receptor during CPB
aP<0.05 vs control.
3 讨论
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体外循环心脏手术后消化道并发症的发病率为0.6%～2%，但死亡率却高达67%～70% [4]. 随着 体外循环及手术技术的提高，重症、复杂手术的逐年增多，体外循环时间越来越长，消化道 并发症越来越受到重视. 体外循环术后消化道并发症以应激性溃疡为多. 应激因素作用于中枢神经系统和胃肠道系统 ，通过神经内分泌系统和消化道系统相互作用而产生胃粘膜病变，具体表现为致病因素对胃 粘膜的破坏作用和胃粘膜屏障保护作用平衡失调，最终导致应激性溃疡的形式. [H+] 的存在是应激性胃溃疡发生的必要条件[5]，其证据有①实验动物和临床患者在应 激状态下，胃液 中[H+]浓度增加，pH值降低. ②应用抗酸剂可预防和治疗应激性溃疡. ③迷走神经兴奋 可直接 作用壁细胞或通过G细胞释放胃泌素,而产生大量胃酸，迷走神经切断后可降低胃酸分泌,减 少应激性溃疡的发病率.
我们的实验结果表明， 体外循环开始胃液中pH值呈下降趋势，并在pH 2.1状态下维持相 当长的时间，同时我们对局部胃肠道组织作光镜检查,发现局部胃肠道组织 粘膜明显水肿、间质出血，血气分析表明呈代谢性酸中毒状态，血浆pH值和胃液中pH呈明显 的相关性，通过放射性免疫分析的方法检测血清及胃液中胃泌素的浓度表明，体外循环过程 中胃泌素释放量增加(Fig 2，3). 这种胃泌素的释放量与pH值呈显著的负相关(P<0.01 )，即胃泌素释放增多，胃液pH值下降. 既往国外学者均通过粘膜内pH计来检测粘膜的酸碱 状况[6-8]，即pHi值. pHi值相对于胃液的pH值具有精确度高、误差小的特点， 本实验的结果的胃液pH值变化与文献报道粘膜内pHi值呈一致的下降趋势.
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近年来胃肠肽的细胞分子生物学研究迅速发展[9,10]，包括胃肠肽及其受体基因的 分子克隆、基因表达的调控、受体后信息传递、受体激动剂和拮抗剂的研究等，例如利用分 子杂交技术可 研究胃肠肽及其受体在胃肠道的分布，利用对受体或酶mRNA水平的检测可进行胃肠肽生理作 用、受体调节机制对细胞增殖的自分泌调节作用等分子生理学研究，通过分子水平阐明受体 结构与功能的关系，可进一步了解胃肠肽受体的分型和生理意义. 本实验中应用原位杂交的 方法对胃泌素受体的mRNA检测结果显示，体外循环过程中胃泌素受体mRNA的表达量与血清胃 泌素释放同时增高，并且明显高于对照组(P<0.01),结果表明，胃窦部G细胞分泌的 胃泌素 作用壁细胞上的胃泌素受体，通过受体后的信号传导，导致了胃酸释放量的增多，粘膜内及 胃液中pH值下降.
作者简介：徐鹏(1964-), 男(汉族)，黑龙江省哈尔滨市人. 外科学心血 管外科博士 ，主治医师，讲师，已发表文章3篇. Tel.(029)3375312
, 百拇医药
徐鹏(第四军医大学西京医院心血管外科中心, 陕西 西安 710033)
易定华(第四军医大学西京医院心血管外科中心, 陕西 西安 710033)
参考文献：
[1] 周 吕. 胃肠生理学-基础与临床[M]. 北京:科学出版社,1991 :101-104.
[2] Anna-Leena K, Ruuska T, Karikoski et al. A randomized, contr olled st udy of prophylactic ranitidine in preventing stress-induced gastric mucosal les ions in neonatal intensive care unit patients[J]. Crit Care Med, 1997;25(2 ):346-351.
, 百拇医药
[3] Ohro I, Finotto S, Marshall J et al. Graanulocyte/macrophage colony-stimulat ing factor gene expression by eosinn-ophils in nasal polyposis [J]. Am J Res Cell Mol Biol, 1991; 5(5):505-509.
[4] Ohri SK, Desai JB, Gaer JAR et al. Intraabdominal complicatio n after cardiopulmonary bypass[J]. Ann Thorac Surg, 1991; 52(4):826-831.
[5] Riddington DW, Venkatesh B, Bovine CM et al. Intestinal perme ability , gastric intramucosal pH and systemic endotoxemia in patients undergoing cardio pulmonary bypass [J]. JAMA,1996; 275 (13): 1007-1012.
, 百拇医药
[6] Andersen LW, Landow L, Beak L et al. Association between gast ric intramucosa l pH and splanchnic endotoxin, antibody to endotoxin, and tumor necrosis factor -α concentration in patients undergoing cardiopulmonary bypass[J]. J Cri t Care Med, 1993; 21(2): 210-217.
[7] Jullien AR, Andrer DS. Effect of cardiopulmonary bypass on gastr oin testinal perfusion and function[J]. J Ann Thorac Surg, 1994; 57(2):371-375 .
[8] Cook DJ, Laine LA, Gugatt GH et al. Nosocomial pneumonia and the role of gastric pH: Ameta-analysis[J]. Chest,1991;100(1):7-11.
[9] 陈元方. 胃肠激素概述[J]. 中华消化杂志, 1996;16(1):45-47.
[10] 朱文玉. 几种胃肠激素的研究进展[J].中华消化杂志, 1996;16(2):97-99., http://www.100md.com
徐鹏 易定华
摘 要：目的 研究体外循环(CPB)过程中胃泌素及胃泌素受体的释放对胃液pH值 的影响. 方法 采用兔CPB模型，分别测定CPB过程中胃液的pH值，胃液及血清 中胃泌素质量浓度,并通过原 位杂交的方法检测胃泌素受体mRNA在胃肠道粘膜中的表达. 结果 CPB过程 中胃液的pH值(2.21±0.22)与血液的pH值(7.40±0.15)呈明显相关性(P<0.01),而且 胃 液的pH值随CPB时间增加，CPB组(2.21±0.22)较对照组明显降低(5.30±0.17,P<0. 0 1). 胃液及血清中胃泌素质量浓度随体外循环时间延长较对照组明显增高. 胃泌素受体mRNA 的表 达量(0.43±0.04)%随CPB时间增加较对照组明显增加(0.27±0.08)%，(P<0.01). 结 论 CPB过程中随时间延长，胃液及血清中胃泌素浓度增高，胃液pH值降低及胃泌素 受体mRNA的表达量增高使胃粘膜处于高酸环境中，是CPB术后发生胃肠道并发症的潜在的危 险因素.
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关键词:兔；体外循环；胃泌素；受体；原位杂交
0 引言
胃泌素是重要的胃肠道内分泌激素[1]，主要作用于壁细胞上的胃泌素受体， 调节胃酸 分泌，同时对胃粘膜和壁细胞有营养作用，胃泌素中以胃窦胃泌素分泌细胞产生的17肽(G 17)活性最强，近年来研究[2]认为胃酸分泌失调是引起应激性溃疡的重要 因素之 一. 我们通 过对体外循环(CPB)过程中胃窦组织胃泌素、胃泌素受体、胃窦G细胞、胃液及血清胃泌素的 测定，探讨了体外循环过程中胃泌素产生和分布特点，及其在胃肠道并发症中所起的作用, 为预防体外循环(CPB)手术后胃肠道并发症的发生提供了实验资料.
1 材料和方法
1.1 兔体外循环模型的建立及分组 实验兔术前禁食水6 h，戊巴比妥钠麻醉 (35 mg.kg-1，ip)，切开气管插 管，小动物呼吸机辅助呼吸，股动脉插管测压，胸骨正中切口开胸，3 mg.kg-1肝素 化后，分别 于右颈总动脉、右心房和左心房插入动脉泵管、腔静脉引流管和左心房引流管，连接小型CP B机. 采用体外循环温度为28℃～32℃. 中度血液稀释(HCT：0.20～0.24),中流量(70 ～110 mL.kg-1.min-1),平均动脉压维持在8～12 kPa. 总转流时间 为180 min，其中主动脉阻断60 min，辅助循环时间120 min. 手术对照组动物行单纯麻醉开 胸180 min后留取组织标本. 家兔24只(体质量2 kg左右)由本校实验动物中心提供,雌雄不 拘 ,随机分成CPB组及对照组，每组12只，分别在CPB时间后0，30，60，90，120及180 min取血 及胃液，离心后分装液氮中保存待测.
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1.2 方法
1.2.1 胃泌素受体的RNA变化及定位 取兔胃，沿胃大弯剪开,生理盐水冲洗胃内容 物，钝刀刮取胃窦部粘膜，置冰冻管中液氮保存. CCKB-R cDNA探针由本校神经生物研究 所 张旭惠赠，探针质量浓度40 mg.L-1. 随机引物法地高辛标记CCKB-R cDNA, (地高辛标记检测试剂盒由德国宝灵曼公司提供).
1.2.2 原位杂交 参照Ohro方法[3]略有改进,按下列步骤进行： 组织标本冰冻切片40 g.L-1多聚甲醛固定5 min，梯度乙醇水化，10.2 mL.L-1 盐酸洗20 min，水洗，蛋白酶K(1 g.L-1)37℃消化3 0 min；0.02 g.L-1甘氨酸洗2×5 min；0.025 g.L-1三乙醇胺洗10 min；P BS洗10 min，湿盒内 37℃预杂交4 h，42℃杂交20 h；冲洗后NBT显色，甲基绿复染，透明封片，光镜下观察，照 相.
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2 结果
2.1 胃液pH值随体外循环时间的变化 随体外循环时间延长，胃液中pH 值较对照组明显降低(P<0.01,Fig 1).
2.2 血清胃泌素质量浓度的改变 随体外循环时间延长， 胃液及血清中的胃泌素浓度较对照组明显增高(Fig2,3).
图 1 体外循环胃液pH值的变化
Fig 1 pH changes in gastric juice during CPB
aP<0.05 vs control.
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图 2 体外循环胃液中胃泌素质量浓度的变化
Fig 2 Changes of gastrin mass concentration in gastric juice during CPB
bP<0.05 vs control.
图 3 体外循环血清胃泌素质量浓度的变化
Fig 3 Changes of gastrin mass concentration in plasma during CPB
cP<0.05 vs control.
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2.3 胃窦粘膜CCKB-R mRNA表达 采用原位杂交的方法， 检测CCKB-R mRNA的表达，发现体外循环组的胃泌素受体mRNA的相对表达量较对照组明显 增高(P<0.01,Fig 4).
图 4 体外循环胃泌素受体mRNA的相对含量
Fig 4 Comperative content of CCK-B receptor during CPB
aP<0.05 vs control.
3 讨论
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体外循环心脏手术后消化道并发症的发病率为0.6%～2%，但死亡率却高达67%～70% [4]. 随着 体外循环及手术技术的提高，重症、复杂手术的逐年增多，体外循环时间越来越长，消化道 并发症越来越受到重视. 体外循环术后消化道并发症以应激性溃疡为多. 应激因素作用于中枢神经系统和胃肠道系统 ，通过神经内分泌系统和消化道系统相互作用而产生胃粘膜病变，具体表现为致病因素对胃 粘膜的破坏作用和胃粘膜屏障保护作用平衡失调，最终导致应激性溃疡的形式. [H+] 的存在是应激性胃溃疡发生的必要条件[5]，其证据有①实验动物和临床患者在应 激状态下，胃液 中[H+]浓度增加，pH值降低. ②应用抗酸剂可预防和治疗应激性溃疡. ③迷走神经兴奋 可直接 作用壁细胞或通过G细胞释放胃泌素,而产生大量胃酸，迷走神经切断后可降低胃酸分泌,减 少应激性溃疡的发病率.
我们的实验结果表明， 体外循环开始胃液中pH值呈下降趋势，并在pH 2.1状态下维持相 当长的时间，同时我们对局部胃肠道组织作光镜检查,发现局部胃肠道组织 粘膜明显水肿、间质出血，血气分析表明呈代谢性酸中毒状态，血浆pH值和胃液中pH呈明显 的相关性，通过放射性免疫分析的方法检测血清及胃液中胃泌素的浓度表明，体外循环过程 中胃泌素释放量增加(Fig 2，3). 这种胃泌素的释放量与pH值呈显著的负相关(P<0.01 )，即胃泌素释放增多，胃液pH值下降. 既往国外学者均通过粘膜内pH计来检测粘膜的酸碱 状况[6-8]，即pHi值. pHi值相对于胃液的pH值具有精确度高、误差小的特点， 本实验的结果的胃液pH值变化与文献报道粘膜内pHi值呈一致的下降趋势.
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近年来胃肠肽的细胞分子生物学研究迅速发展[9,10]，包括胃肠肽及其受体基因的 分子克隆、基因表达的调控、受体后信息传递、受体激动剂和拮抗剂的研究等，例如利用分 子杂交技术可 研究胃肠肽及其受体在胃肠道的分布，利用对受体或酶mRNA水平的检测可进行胃肠肽生理作 用、受体调节机制对细胞增殖的自分泌调节作用等分子生理学研究，通过分子水平阐明受体 结构与功能的关系，可进一步了解胃肠肽受体的分型和生理意义. 本实验中应用原位杂交的 方法对胃泌素受体的mRNA检测结果显示，体外循环过程中胃泌素受体mRNA的表达量与血清胃 泌素释放同时增高，并且明显高于对照组(P<0.01),结果表明，胃窦部G细胞分泌的 胃泌素 作用壁细胞上的胃泌素受体，通过受体后的信号传导，导致了胃酸释放量的增多，粘膜内及 胃液中pH值下降.
作者简介：徐鹏(1964-), 男(汉族)，黑龙江省哈尔滨市人. 外科学心血 管外科博士 ，主治医师，讲师，已发表文章3篇. Tel.(029)3375312
, 百拇医药
徐鹏(第四军医大学西京医院心血管外科中心, 陕西 西安 710033)
易定华(第四军医大学西京医院心血管外科中心, 陕西 西安 710033)
参考文献：
[1] 周 吕. 胃肠生理学-基础与临床[M]. 北京:科学出版社,1991 :101-104.
[2] Anna-Leena K, Ruuska T, Karikoski et al. A randomized, contr olled st udy of prophylactic ranitidine in preventing stress-induced gastric mucosal les ions in neonatal intensive care unit patients[J]. Crit Care Med, 1997;25(2 ):346-351.
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[3] Ohro I, Finotto S, Marshall J et al. Graanulocyte/macrophage colony-stimulat ing factor gene expression by eosinn-ophils in nasal polyposis [J]. Am J Res Cell Mol Biol, 1991; 5(5):505-509.
[4] Ohri SK, Desai JB, Gaer JAR et al. Intraabdominal complicatio n after cardiopulmonary bypass[J]. Ann Thorac Surg, 1991; 52(4):826-831.
[5] Riddington DW, Venkatesh B, Bovine CM et al. Intestinal perme ability , gastric intramucosal pH and systemic endotoxemia in patients undergoing cardio pulmonary bypass [J]. JAMA,1996; 275 (13): 1007-1012.
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[7] Jullien AR, Andrer DS. Effect of cardiopulmonary bypass on gastr oin testinal perfusion and function[J]. J Ann Thorac Surg, 1994; 57(2):371-375 .
[8] Cook DJ, Laine LA, Gugatt GH et al. Nosocomial pneumonia and the role of gastric pH: Ameta-analysis[J]. Chest,1991;100(1):7-11.
[9] 陈元方. 胃肠激素概述[J]. 中华消化杂志, 1996;16(1):45-47.
[10] 朱文玉. 几种胃肠激素的研究进展[J].中华消化杂志, 1996;16(2):97-99., http://www.100md.com