不同转移能力肿瘤细胞间转移相关特征的比较研究
不同转移能力肿瘤细胞间转移相关特征的比较研究
沈岩 Vogel I Kalthoff H 于吉人 郑树森
摘 要 目的 进一步明确肿瘤细胞相关生物学特性与肿瘤细胞转移能力间的关系。方法 应用遗传背景相同的3个人结肠癌(HCC)细胞系在裸大鼠体内建立转移模型，通过三维球体培养、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)凋亡细胞和免疫组化等技术，比较分析不同肿瘤细胞间同种细胞凝集力、靶器官定植力、细胞增殖和细胞凋亡现象、癌基因及肿瘤相关抗原表达等生物学特征。结果 高转移细胞具有高靶器官定植力和低同种细胞凝集力；高转移细胞较低转移细胞有更高的细胞增殖指数和更低的凋亡指数 (P<0.05)；在高转移细胞中，表皮生长因子受体(EGFR)和突变型p53的表达高于在低转移细胞中，而肿瘤相关抗原粘蛋白、CA19-9和CEA的表达差异无显著性。结论 肿瘤细胞的同种凝集力、靶器官定植力、肿瘤细胞增殖与凋亡状态、肿瘤细胞EGFR和突变型p53的表达程度与肿瘤细胞的转移能力密切相关。
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主题词：结肠肿瘤；肿瘤转移；细胞凋亡；免疫组织化学
肿瘤转移的发生是导致临床治疗失败的最主要原因，了解转移发生机制有助于探索新的抗转移措施。近年来的研究显示，肿瘤细胞的多种生物学特征，如细胞增殖动力学、分泌基质蛋白酶能力、粘附分子表达等与肿瘤细胞的转移能力密切相关[1，2]，改变肿瘤细胞的转移相关特征则能降低或消除肿瘤细胞的转移能力[3]。因此，明确肿瘤细胞转移相关特征将有助于判断肿瘤预后和筛选新的抗转移治疗模式。我们对遗传背景相同、转移能力不同的肿瘤细胞转移相关特征进行了比较研究，现将结果报告如下。
材料与方法
一、细胞培养
两个具有相同遗传背景的人结肠癌(HCC)细胞系 WiDr、HT-29[4]和HT-29细胞亚系HT-29b[5]置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和L-谷氨酰胺的培养液RPMI 1640中，于37℃、 5% CO2条件下孵育。指数生长期的各细胞系细胞经胰酶(0.05%胰蛋白酶+0.02% EDTA-Na2)消化、磷酸盐缓冲液洗涤、离心、弃上清，用不含血清RPMI 1640液调整细胞浓度至2×107/0.5 ml，供动物体内注射。另外，各细胞系细胞在相同条件下，培养于微孔载玻片上孵育48 h，冷丙酮固定5 min后用于免疫组化分析。
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二、裸大鼠人结肠癌转移模型
建立过程见文献[5]。简述如下：鼠龄4周的雄性Rowett裸大鼠(Hsd：RH-nu/nu，德国Harlan/ Winkemann公司)麻醉后做腹部正中切口，将上述备好的各细胞系悬液0.5 ml缓缓注入各组鼠门静脉系统内。3～4周后剖腹探查，随后间隔2周探查一次。2～3个月后处死裸鼠，其肝、肺、脾、肾及区域淋巴结于不同平面做冰冻切片20张，冷丙酮固定5 min，其中10张行常规HE染色，另 10张用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶 (APAAP)免疫组化[6]，结合单克隆抗体(mAb) KL-1(广谱抗人细胞角蛋白，德国Immunotech公司)检测转移肿瘤细胞。另外，上述各细胞系细胞以2×107/0.5 ml注入不同数量裸大鼠右侧腹壁皮下，每日监测局部肿瘤生长情况。
三、转移相关特征的比较
1.肿瘤细胞增殖力：应用APAAP方法结合mAb MiB-1(德国Dianova公司)检测各细胞系体外生长细胞、皮下肿瘤(sc-Tu)和肝转移灶(Li-Tu)细胞中细胞增殖抗原Ki-67的表达。细胞增殖指数(PI)由随机计算1 000个肿瘤细胞中Ki-67阳性细胞的百分数表示。
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2.肿瘤细胞凋亡：应用dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术和ApoTag试剂盒(Oncor Appligene S71001，德国)及产品提供的检测方法检测各细胞系sc-Tu和Li-Tu内凋亡细胞。细胞凋亡指数(AI)由随机计算1 000个肿瘤细胞中阳性染色细胞构成(明显坏死区内细胞除外)。
3.肿瘤细胞体外凝集力：三维球体培养技术用于比较细胞同种凝集力。取含1×105细胞的各细胞系悬液2 ml，分别种植于孔底覆有2 ml 1%琼脂胶(内含RPMI 1640液)的6孔培养板内孵育(条件同细胞培养)，连续观测细胞凝集现象1周。
4.肿瘤细胞肝内定植力：为确定肿瘤细胞随血流进入肝内后，最初24 h中在肝内的定植能力，WiDr和HT-29细胞2×107/0.5 ml分别注入 6只裸大鼠门静脉系统内，在注射后 4，12，24 h分别处死，每组鼠2只，切取各鼠左、右肝叶相同部位做切片后，应用APAAP结合mAb KL-1检测肿瘤细胞，并在10个低倍镜(×40 )视野计数阳性肿瘤细胞。
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5.肿瘤细胞癌基因、抑癌基因和肿瘤相关抗原的表达：应用APAAP免疫组化方法结合mAb CB11、225、Do-7、Ra-96(Kalthoff H博士提供)、CA19-9和C1P83检测各细胞系体外生长细胞、sc-Tu和Li-Tu细胞中相应抗原c-erbB-2、表皮生长因子受体(EGFR)、p53、粘蛋白、CA19-9和CEA的表达情况。除Ra-96外，其余mAb购自丹麦Dako公司和德国Dianova公司。抗原表达评价标准：“-”阴性，“±”可疑，“ +”弱阳性，“++”中等阳性，“+++”强阳性。同时随机计算1 000个肿瘤细胞，阳性细胞数以百分比表示。
四、统计学处理
应用χ2、t-test和Kruskal-Wallis test对不同实验数据进行统计学分析。
结果
1.各细胞系细胞裸大鼠体内转移状况：各细胞系细胞裸鼠皮下注射后致瘤率为 100%，但均未产生内脏转移。各细胞系细胞经肠系膜静脉注射后转移情况见表1。WiDr细胞在裸大鼠体内未产生任何转移，而比较母代HT-29细胞，裸鼠接种HT-29b细胞后，肝转移的发生率更高，相同时间内裸鼠有更多的肝转移结节，且有多个脏器累及。多只接种HT-29b细胞的裸鼠肝转移结节呈融合状，并占据50%～60%正常肝组织。
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2.细胞增殖能力：各细胞系细胞、sc-Tu和Li-Tu细胞Ki-67的表达程度见表2。体外生长WiDr细胞和sc-Tu细胞Ki-67的表达均较HT-29细胞和sc-Tu细胞弱，而HT-29b sc-Tu和Li-Tu PI值均显著高于母代HT-29相应肿瘤PI值(P<0.05 )。
3.肿瘤细胞凋亡现象：各细胞系相应sc- Tu和Li-Tu细胞凋亡发生情况见表3。HT-29和HT-29b细胞肝转移灶的AI较相应sc-Tu高(P<0.05)，而HT-29b sc-Tu和Li-Tu较母代HT-29相应肿瘤的AI更低(P<0.05)。
表5 各mAb相关抗原在各细胞系及相应肿瘤内的表达(APAAP法)
细胞系及肿瘤
c-erbB-2
EGFR
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p53
Mucin
CA19-9
CEA
强度
%
强度
%
强度
%
强度
%
强度
%
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强度
%
WiDr
+
92
+
87
+
95
+++
45
+++
52
+++
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60
WiDr sc-Tu
-
-
+
62
+++
60
+++
63
+++
45
HT-29
, http://www.100md.com
+
87
+/++
95
+/++
95
+++
60
+++
50
+++
47
HT-29 sc-Tu
, http://www.100md.com
-
-
+/++
68
+++
62
+++
60
+++
40
HT-29 Li-Tu
-
-
, 百拇医药 +/++
70
+++
65
+++
58
+++
65
HT-29b
+
93
++
95
++
, http://www.100md.com
95
+++
35
+++
65
+++
58
HT-29b sc-Tu
-
-
++
80
+++
, http://www.100md.com
65
+++
60
++
35
HT-29b Li-Tu
-
-
++
85
+++
60
+++
, 百拇医药
56
+++
56
表1 各细胞系细胞经肠系膜静脉注射后在裸大鼠
体内的转移情况
细胞系
鼠
数
肝
肺
其他部位
平均肝
转移灶
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鼠数
%
鼠数
%
鼠数
%
WiDr
8
0
0*
0
0*
0
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0*
0
HT-29
14
7
50
2
14
1
7
4.2(1～7)
HT-29b
10
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6
60
4
40
5
50**
8.2(2～20)
*WiDr与HT-29或HT-29b比较，P<0.01；**HT-29与HT-29b比较，P<0.01表2 各细胞系sc-Tu及Li-Tu内Ki-67表达
细胞系
sc-Tu
Li-Tu
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P值
WiDr
60.0±4.1*△
-
HT-29
68.7±10.7△
60.3±13.8**
>0.05
HT-29b
79.2±6.8△
79.0±4.2
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>0.05
HT-29b sc-Tu比较，P<0.05；△各细胞系sc-Tu间相互比较，P<0.05；**HT-29b Li-Tu比较，P<0.05表3 各细胞系sc-Tu及Li-Tu内AI
细胞系
sc-Tu
Li-Tu
P值
WiDr
21.5±6.5
-
HT-29
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25.0±8.3*
42.6±9.9**
<0.05
HT-29b
14.8±6.5
35.0±8.9
<0.05
*HT-29b sc-Tu比较，P<0.05；** HT-29b Li-Tu比较，P>0.05
4.肿瘤细胞体外凝集力：三维球体培养显示，最初4 h内各细胞系细胞间的同种凝集能力无明显差别，小部分细胞凝集成3～10个细胞构成的细胞簇，显微镜下能清楚辨认细胞簇中单细胞轮廓。随后越来越多的WiDr细胞彼此凝聚，形成大小不等的细胞球体，球体内细胞相当致密，难以辨认单细胞形态。而大多数HT-29和HT-29b细胞仍保持单细胞状态，尽管部分HT-29细胞凝集成5～30个细胞构成的细胞簇，但细胞凝集较松弛，能清楚辨认出单细胞轮廓。HT-29b细胞的凝集细胞较母代HT-29细胞少，1周后WiDr细胞彼此凝集成数个较大的细胞团，而HT-29和HT-29b细胞无明显变化。
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5.肿瘤细胞肝内定植力：肿瘤细胞进入肝内后，在最初24 h内其数量显著减少，注射后12 h仅有极少量的WiDr细胞能在肝内检测到，24 h时肝内已检测不到WiDr细胞，而仍有一定数量的HT-29细胞在注射后12 h和24 h时在肝实质内检测到(表4)。
表4 肿瘤细胞经肠系膜静脉注射24 h内肝内检测情况
细胞系
肿瘤细胞数(个/mm3肝组织)
4 h
12 h
24 h
WiDr
37.4
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0.86
0
HT-29
35.0
7.7
5.8
6.癌基因、抑癌基因和肿瘤相关抗原的表达：各细胞系体外生长细胞、sc-Tu和Li-Tu细胞癌基因(c-erbB-2、EGFR )、抑癌基因(p53 )、肿瘤相关抗原(粘蛋白、CA19-9、CEA )的表达情况见表5。EGFR和突变型p53的表达在体外生长WiDr细胞中最弱，而HT-29b细胞最强。而且在HT-29b肿瘤中，表达突变型p53蛋白的细胞数也较其他细胞系多。肿瘤相关抗原在各细胞系细胞和肿瘤内的表达程度和表达模式，无明显差异。
讨论
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肿瘤转移的发生取决于肿瘤细胞特性、宿主特性及二者的相互作用。肿瘤细胞独特的转移能力，是成功转移过程中最主要的决定因素之一[7]。近年来的研究显示，肿瘤细胞的多种生物学特征可能与肿瘤细胞的恶性行为和转移能力密切相关[1，2]。为此，我们有选择地对具有相同遗传背景的两个HCC细胞系WiDr和HT-29，及从HT-29裸大鼠肝转移灶筛选获得的亚系HT-29b细胞的转移相关特征进行了比较研究[4，5]。
本实验在裸大鼠体内证实了上述3个细胞系细胞具有不同的转移能力。体外三维球体培养表明，肿瘤细胞的同种凝集能力与转移能力呈负相关，高转移细胞具有低的同种细胞凝集力，Abe等[8]也有同样的观察报道。细胞的低同种凝集力有利于该细胞脱离周围细胞、游走并侵入脉管内。细胞间的同种凝集力大小可能与肿瘤细胞表面粘附分子的表达有关，但有待于进一步研究。我们也观察到高转移细胞HT-29较低转移细胞WiDr在靶器官中具有更强的定植能力。进入血液的肿瘤细胞如果不能及时侵入靶器官实质内，其最终将被机体的防御机制和血流的物理学特性所破坏，导致转移失败[9]。强定植力使肿瘤细胞能迅速在靶器官内停留，继而侵入实质内，有利于肿瘤细胞存活，形成转移灶。本实验显示，注射HT-29细胞12 h时已有一些肿瘤细胞侵入肝实质内，至24 h时绝大多数细胞都侵入肝实质内；而WiDr细胞12 h时基本上在肝内血管内。有研究显示，细胞EGFR和突变型p53的表达具有调节细胞粘附分子表达、基质蛋白酶分泌及诱导血管再生等作用[10-12]。本实验中，HT-29b细胞EGFR和突变型p53的表达最强，而WiDr细胞表达最弱，这或许是高转移细胞具有强靶器官定植力的一个原因。注射HT-29细胞12 h后，其在肝内的数目似较稳定，此时肝内仅能检测到极少数WiDr细胞，提示肿瘤细胞进入靶器官后头12 h是能否发生成功转移的一个关键时段。
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本实验结果表明，HT-29b肿瘤中PI较母代HT-29高，AI则低；而WiDr肿瘤具有最低的PI，差异具有显著性(P<0.05 )。高PI和低AI将使肿瘤细胞迅速扩增而使肿瘤体积不断增大，其内部压力不断增加，促使肿瘤细胞侵入邻近组织及周围脉管内，发生侵袭性生长或转移。因此，高PI和低AI与肿瘤细胞的恶性行为呈正相关。此外，我们还注意到HT-29和HT-29b细胞的肝转移灶的AI均显著高于其相应皮下肿瘤的AI(P<0.05 )，这可能与肝内较皮下有更多的NK细胞和枯否氏细胞有关。这些细胞通过细胞毒作用或产生TGF-β1、TNF等细胞因子，诱导肿瘤细胞凋亡，这也是同一时间内皮下肿瘤较肝内转移灶生长快的一个原因。
在本实验模型中，肿瘤相关抗原粘蛋白、CA 19-9、CEA的表达不是影响肿瘤细胞转移能力的主要因素。肿瘤细胞的同种细胞凝集力、靶器官定植力、肿瘤细胞增殖与凋亡状态、肿瘤细胞 EGFR和突变型 p53的表达程度与肿瘤细胞的转移能力密切相关，肿瘤细胞的转移能力是受多因素支配的。
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作者单位：沈岩(310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院普外科)
于吉人(310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院普外科)
郑树森(310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院普外科)
Vogel I, Kalthoff H(Klinik fur Allgemeine Chirurgie und Thoraxchirurgie der CAU zu Kiel. Forschungsgr. Molekulare Onkologie, Deutshland)
参考文献
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沈岩 Vogel I Kalthoff H 于吉人 郑树森
摘 要 目的 进一步明确肿瘤细胞相关生物学特性与肿瘤细胞转移能力间的关系。方法 应用遗传背景相同的3个人结肠癌(HCC)细胞系在裸大鼠体内建立转移模型，通过三维球体培养、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)凋亡细胞和免疫组化等技术，比较分析不同肿瘤细胞间同种细胞凝集力、靶器官定植力、细胞增殖和细胞凋亡现象、癌基因及肿瘤相关抗原表达等生物学特征。结果 高转移细胞具有高靶器官定植力和低同种细胞凝集力；高转移细胞较低转移细胞有更高的细胞增殖指数和更低的凋亡指数 (P<0.05)；在高转移细胞中，表皮生长因子受体(EGFR)和突变型p53的表达高于在低转移细胞中，而肿瘤相关抗原粘蛋白、CA19-9和CEA的表达差异无显著性。结论 肿瘤细胞的同种凝集力、靶器官定植力、肿瘤细胞增殖与凋亡状态、肿瘤细胞EGFR和突变型p53的表达程度与肿瘤细胞的转移能力密切相关。
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主题词：结肠肿瘤；肿瘤转移；细胞凋亡；免疫组织化学
肿瘤转移的发生是导致临床治疗失败的最主要原因，了解转移发生机制有助于探索新的抗转移措施。近年来的研究显示，肿瘤细胞的多种生物学特征，如细胞增殖动力学、分泌基质蛋白酶能力、粘附分子表达等与肿瘤细胞的转移能力密切相关[1，2]，改变肿瘤细胞的转移相关特征则能降低或消除肿瘤细胞的转移能力[3]。因此，明确肿瘤细胞转移相关特征将有助于判断肿瘤预后和筛选新的抗转移治疗模式。我们对遗传背景相同、转移能力不同的肿瘤细胞转移相关特征进行了比较研究，现将结果报告如下。
材料与方法
一、细胞培养
两个具有相同遗传背景的人结肠癌(HCC)细胞系 WiDr、HT-29[4]和HT-29细胞亚系HT-29b[5]置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和L-谷氨酰胺的培养液RPMI 1640中，于37℃、 5% CO2条件下孵育。指数生长期的各细胞系细胞经胰酶(0.05%胰蛋白酶+0.02% EDTA-Na2)消化、磷酸盐缓冲液洗涤、离心、弃上清，用不含血清RPMI 1640液调整细胞浓度至2×107/0.5 ml，供动物体内注射。另外，各细胞系细胞在相同条件下，培养于微孔载玻片上孵育48 h，冷丙酮固定5 min后用于免疫组化分析。
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二、裸大鼠人结肠癌转移模型
建立过程见文献[5]。简述如下：鼠龄4周的雄性Rowett裸大鼠(Hsd：RH-nu/nu，德国Harlan/ Winkemann公司)麻醉后做腹部正中切口，将上述备好的各细胞系悬液0.5 ml缓缓注入各组鼠门静脉系统内。3～4周后剖腹探查，随后间隔2周探查一次。2～3个月后处死裸鼠，其肝、肺、脾、肾及区域淋巴结于不同平面做冰冻切片20张，冷丙酮固定5 min，其中10张行常规HE染色，另 10张用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶 (APAAP)免疫组化[6]，结合单克隆抗体(mAb) KL-1(广谱抗人细胞角蛋白，德国Immunotech公司)检测转移肿瘤细胞。另外，上述各细胞系细胞以2×107/0.5 ml注入不同数量裸大鼠右侧腹壁皮下，每日监测局部肿瘤生长情况。
三、转移相关特征的比较
1.肿瘤细胞增殖力：应用APAAP方法结合mAb MiB-1(德国Dianova公司)检测各细胞系体外生长细胞、皮下肿瘤(sc-Tu)和肝转移灶(Li-Tu)细胞中细胞增殖抗原Ki-67的表达。细胞增殖指数(PI)由随机计算1 000个肿瘤细胞中Ki-67阳性细胞的百分数表示。
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2.肿瘤细胞凋亡：应用dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术和ApoTag试剂盒(Oncor Appligene S71001，德国)及产品提供的检测方法检测各细胞系sc-Tu和Li-Tu内凋亡细胞。细胞凋亡指数(AI)由随机计算1 000个肿瘤细胞中阳性染色细胞构成(明显坏死区内细胞除外)。
3.肿瘤细胞体外凝集力：三维球体培养技术用于比较细胞同种凝集力。取含1×105细胞的各细胞系悬液2 ml，分别种植于孔底覆有2 ml 1%琼脂胶(内含RPMI 1640液)的6孔培养板内孵育(条件同细胞培养)，连续观测细胞凝集现象1周。
4.肿瘤细胞肝内定植力：为确定肿瘤细胞随血流进入肝内后，最初24 h中在肝内的定植能力，WiDr和HT-29细胞2×107/0.5 ml分别注入 6只裸大鼠门静脉系统内，在注射后 4，12，24 h分别处死，每组鼠2只，切取各鼠左、右肝叶相同部位做切片后，应用APAAP结合mAb KL-1检测肿瘤细胞，并在10个低倍镜(×40 )视野计数阳性肿瘤细胞。
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5.肿瘤细胞癌基因、抑癌基因和肿瘤相关抗原的表达：应用APAAP免疫组化方法结合mAb CB11、225、Do-7、Ra-96(Kalthoff H博士提供)、CA19-9和C1P83检测各细胞系体外生长细胞、sc-Tu和Li-Tu细胞中相应抗原c-erbB-2、表皮生长因子受体(EGFR)、p53、粘蛋白、CA19-9和CEA的表达情况。除Ra-96外，其余mAb购自丹麦Dako公司和德国Dianova公司。抗原表达评价标准：“-”阴性，“±”可疑，“ +”弱阳性，“++”中等阳性，“+++”强阳性。同时随机计算1 000个肿瘤细胞，阳性细胞数以百分比表示。
四、统计学处理
应用χ2、t-test和Kruskal-Wallis test对不同实验数据进行统计学分析。
结果
1.各细胞系细胞裸大鼠体内转移状况：各细胞系细胞裸鼠皮下注射后致瘤率为 100%，但均未产生内脏转移。各细胞系细胞经肠系膜静脉注射后转移情况见表1。WiDr细胞在裸大鼠体内未产生任何转移，而比较母代HT-29细胞，裸鼠接种HT-29b细胞后，肝转移的发生率更高，相同时间内裸鼠有更多的肝转移结节，且有多个脏器累及。多只接种HT-29b细胞的裸鼠肝转移结节呈融合状，并占据50%～60%正常肝组织。
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2.细胞增殖能力：各细胞系细胞、sc-Tu和Li-Tu细胞Ki-67的表达程度见表2。体外生长WiDr细胞和sc-Tu细胞Ki-67的表达均较HT-29细胞和sc-Tu细胞弱，而HT-29b sc-Tu和Li-Tu PI值均显著高于母代HT-29相应肿瘤PI值(P<0.05 )。
3.肿瘤细胞凋亡现象：各细胞系相应sc- Tu和Li-Tu细胞凋亡发生情况见表3。HT-29和HT-29b细胞肝转移灶的AI较相应sc-Tu高(P<0.05)，而HT-29b sc-Tu和Li-Tu较母代HT-29相应肿瘤的AI更低(P<0.05)。
表5 各mAb相关抗原在各细胞系及相应肿瘤内的表达(APAAP法)
细胞系及肿瘤
c-erbB-2
EGFR
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p53
Mucin
CA19-9
CEA
强度
%
强度
%
强度
%
强度
%
强度
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强度
%
WiDr
+
92
+
87
+
95
+++
45
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52
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60
WiDr sc-Tu
-
-
+
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HT-29
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HT-29 sc-Tu
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-
-
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68
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62
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60
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40
HT-29 Li-Tu
-
-
, 百拇医药 +/++
70
+++
65
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58
+++
65
HT-29b
+
93
++
95
++
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95
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35
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65
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58
HT-29b sc-Tu
-
-
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80
+++
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65
+++
60
++
35
HT-29b Li-Tu
-
-
++
85
+++
60
+++
, 百拇医药
56
+++
56
表1 各细胞系细胞经肠系膜静脉注射后在裸大鼠
体内的转移情况
细胞系
鼠
数
肝
肺
其他部位
平均肝
转移灶
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鼠数
%
鼠数
%
鼠数
%
WiDr
8
0
0*
0
0*
0
, http://www.100md.com
0*
0
HT-29
14
7
50
2
14
1
7
4.2(1～7)
HT-29b
10
, 百拇医药
6
60
4
40
5
50**
8.2(2～20)
*WiDr与HT-29或HT-29b比较，P<0.01；**HT-29与HT-29b比较，P<0.01表2 各细胞系sc-Tu及Li-Tu内Ki-67表达
细胞系
sc-Tu
Li-Tu
, 百拇医药
P值
WiDr
60.0±4.1*△
-
HT-29
68.7±10.7△
60.3±13.8**
>0.05
HT-29b
79.2±6.8△
79.0±4.2
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>0.05
HT-29b sc-Tu比较，P<0.05；△各细胞系sc-Tu间相互比较，P<0.05；**HT-29b Li-Tu比较，P<0.05表3 各细胞系sc-Tu及Li-Tu内AI
细胞系
sc-Tu
Li-Tu
P值
WiDr
21.5±6.5
-
HT-29
, 百拇医药
25.0±8.3*
42.6±9.9**
<0.05
HT-29b
14.8±6.5
35.0±8.9
<0.05
*HT-29b sc-Tu比较，P<0.05；** HT-29b Li-Tu比较，P>0.05
4.肿瘤细胞体外凝集力：三维球体培养显示，最初4 h内各细胞系细胞间的同种凝集能力无明显差别，小部分细胞凝集成3～10个细胞构成的细胞簇，显微镜下能清楚辨认细胞簇中单细胞轮廓。随后越来越多的WiDr细胞彼此凝聚，形成大小不等的细胞球体，球体内细胞相当致密，难以辨认单细胞形态。而大多数HT-29和HT-29b细胞仍保持单细胞状态，尽管部分HT-29细胞凝集成5～30个细胞构成的细胞簇，但细胞凝集较松弛，能清楚辨认出单细胞轮廓。HT-29b细胞的凝集细胞较母代HT-29细胞少，1周后WiDr细胞彼此凝集成数个较大的细胞团，而HT-29和HT-29b细胞无明显变化。
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5.肿瘤细胞肝内定植力：肿瘤细胞进入肝内后，在最初24 h内其数量显著减少，注射后12 h仅有极少量的WiDr细胞能在肝内检测到，24 h时肝内已检测不到WiDr细胞，而仍有一定数量的HT-29细胞在注射后12 h和24 h时在肝实质内检测到(表4)。
表4 肿瘤细胞经肠系膜静脉注射24 h内肝内检测情况
细胞系
肿瘤细胞数(个/mm3肝组织)
4 h
12 h
24 h
WiDr
37.4
, 百拇医药
0.86
0
HT-29
35.0
7.7
5.8
6.癌基因、抑癌基因和肿瘤相关抗原的表达：各细胞系体外生长细胞、sc-Tu和Li-Tu细胞癌基因(c-erbB-2、EGFR )、抑癌基因(p53 )、肿瘤相关抗原(粘蛋白、CA19-9、CEA )的表达情况见表5。EGFR和突变型p53的表达在体外生长WiDr细胞中最弱，而HT-29b细胞最强。而且在HT-29b肿瘤中，表达突变型p53蛋白的细胞数也较其他细胞系多。肿瘤相关抗原在各细胞系细胞和肿瘤内的表达程度和表达模式，无明显差异。
讨论
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肿瘤转移的发生取决于肿瘤细胞特性、宿主特性及二者的相互作用。肿瘤细胞独特的转移能力，是成功转移过程中最主要的决定因素之一[7]。近年来的研究显示，肿瘤细胞的多种生物学特征可能与肿瘤细胞的恶性行为和转移能力密切相关[1，2]。为此，我们有选择地对具有相同遗传背景的两个HCC细胞系WiDr和HT-29，及从HT-29裸大鼠肝转移灶筛选获得的亚系HT-29b细胞的转移相关特征进行了比较研究[4，5]。
本实验在裸大鼠体内证实了上述3个细胞系细胞具有不同的转移能力。体外三维球体培养表明，肿瘤细胞的同种凝集能力与转移能力呈负相关，高转移细胞具有低的同种细胞凝集力，Abe等[8]也有同样的观察报道。细胞的低同种凝集力有利于该细胞脱离周围细胞、游走并侵入脉管内。细胞间的同种凝集力大小可能与肿瘤细胞表面粘附分子的表达有关，但有待于进一步研究。我们也观察到高转移细胞HT-29较低转移细胞WiDr在靶器官中具有更强的定植能力。进入血液的肿瘤细胞如果不能及时侵入靶器官实质内，其最终将被机体的防御机制和血流的物理学特性所破坏，导致转移失败[9]。强定植力使肿瘤细胞能迅速在靶器官内停留，继而侵入实质内，有利于肿瘤细胞存活，形成转移灶。本实验显示，注射HT-29细胞12 h时已有一些肿瘤细胞侵入肝实质内，至24 h时绝大多数细胞都侵入肝实质内；而WiDr细胞12 h时基本上在肝内血管内。有研究显示，细胞EGFR和突变型p53的表达具有调节细胞粘附分子表达、基质蛋白酶分泌及诱导血管再生等作用[10-12]。本实验中，HT-29b细胞EGFR和突变型p53的表达最强，而WiDr细胞表达最弱，这或许是高转移细胞具有强靶器官定植力的一个原因。注射HT-29细胞12 h后，其在肝内的数目似较稳定，此时肝内仅能检测到极少数WiDr细胞，提示肿瘤细胞进入靶器官后头12 h是能否发生成功转移的一个关键时段。
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本实验结果表明，HT-29b肿瘤中PI较母代HT-29高，AI则低；而WiDr肿瘤具有最低的PI，差异具有显著性(P<0.05 )。高PI和低AI将使肿瘤细胞迅速扩增而使肿瘤体积不断增大，其内部压力不断增加，促使肿瘤细胞侵入邻近组织及周围脉管内，发生侵袭性生长或转移。因此，高PI和低AI与肿瘤细胞的恶性行为呈正相关。此外，我们还注意到HT-29和HT-29b细胞的肝转移灶的AI均显著高于其相应皮下肿瘤的AI(P<0.05 )，这可能与肝内较皮下有更多的NK细胞和枯否氏细胞有关。这些细胞通过细胞毒作用或产生TGF-β1、TNF等细胞因子，诱导肿瘤细胞凋亡，这也是同一时间内皮下肿瘤较肝内转移灶生长快的一个原因。
在本实验模型中，肿瘤相关抗原粘蛋白、CA 19-9、CEA的表达不是影响肿瘤细胞转移能力的主要因素。肿瘤细胞的同种细胞凝集力、靶器官定植力、肿瘤细胞增殖与凋亡状态、肿瘤细胞 EGFR和突变型 p53的表达程度与肿瘤细胞的转移能力密切相关，肿瘤细胞的转移能力是受多因素支配的。
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作者单位：沈岩(310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院普外科)
于吉人(310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院普外科)
郑树森(310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院普外科)
Vogel I, Kalthoff H(Klinik fur Allgemeine Chirurgie und Thoraxchirurgie der CAU zu Kiel. Forschungsgr. Molekulare Onkologie, Deutshland)
参考文献
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