重组SZ51Hu-scuPA融合蛋白的体外溶栓研究
作者：万海英 刘征辉 顾津明 李佩霞 朱明清 阮长耿
单位：万海英 刘征辉 顾津明 李佩霞(215006苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所 血栓与止血研究室)；朱明清 阮长耿(苏州医学院核医学重点实验室)
关键词：活化血小板；单抗；单链尿激酶；导向溶栓剂
江苏医药001012 【摘要】 目的 获得大量人源化抗人活化血小板单抗SZ51Hu和尿激酶原(scuPA)融合蛋白SZ51Hu-scuPA并测定该基因重组抗体导向溶栓剂的导向溶栓性。方法 通过转瓶扩大培养系统获得大量SZ51Hu-scuPA；通过抗体竞争结合实验证明融合蛋白的抗体亲和力；进而与尿激酶进行比较对不同浓度血小板血浆凝块的溶栓研究。结果 该融合蛋白在培养上清中的表达量为5mg/ml；其纤溶活性为39000IU/mg；抗体亲和力是鼠源性单抗的67%；体外溶栓效力较uPA提高4.1～8.4倍。结论 该融合蛋白比uPA具有更高、更快的溶栓效率，是一种高效抗体导向溶栓剂。
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Study on thrombolysis of a recombinant SZ51 Hu-scuPA in vitro
WAN Haiying LIU Zhenghui GU Jinming et al.
(Jiangsu Institute of Hematology，the First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College，Suzhou 215006)
【Abstract】 Objective To compare the thrombolytic properties in vitro between urokinase(uPA) and the recombinant chimeric plasminogen activator SZ51 Hu-scuPA，which was composed of a humanized monoclonal antibody SZ51(SZ51 Hu) specifically against activated human platelet and a single-chain urokinase(scuPA).Methods The fusion protein SZ51 Hu-scuPA was produced from the supernatant of a stable myeloma cell line grown in spinner flask.Its affinity to activated human platelet was obtained by competitive binding of SZ51 Hu-scuPA and murine mAb SZ51；the thrombolytic potency of SZ51 Hu-scuPA was compared with uPA by a system composed of an 125I-fibrin-labeled human plasma clot.Results The concentration of the fusion protein in the supernatant was 5mg/ml.The binding capacity to activated human platelet of purified fusion protein SZ51Hu-scuPA was 67% of the SZ51 M and the fibrinolytic activity was 39，000 IU/mg.In the dissolution of the human plasma clots containing the different concentration of human platelets，the fusion protein SZ51Hu-scuPA was 4.1-8.4 folds more potent than uPA.Conclusion The fusion protein SZ51Hu-scuPA was more competent to dissolve platelet clots than uPA.
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【Key words】 Activated platelets Monoclonal antibody Single-chain urokinase Targeting thrombolysis
我室于1989年研制了国内第一株抗人活化血小板GMP-140单抗SZ-51(SZ-51M)，标记的99mTc-SZ51不仅在实验性狗股动、静脉血栓模型中，而且在人体内血栓显像中都显示了良好的显像效果[1]，证明了其血栓导向能力。与尿激酶的化学偶联产物体外溶栓效率较单用尿激酶提高了3～5倍[2]。本研究对通过基因工程方法获得的分泌重组SZ51Hu-scuPA抗体导向溶栓剂[3]的阳性细胞克隆进行了体外扩大培养，应用亲和层析技术纯化SZ51Hu-scuPA融合蛋白，与uPA对125I标记纤维蛋白原的不同血小板血栓凝块在体外进行了溶栓比较，以期得到一种新型的基因工程抗体导向溶栓剂。
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材料和方法
一、人尿激酶纯品由南京大学制药厂朱长生教授惠赠，比活为155?000IU/mg；人纤维蛋白原购自Sigma公司；重组SZ51Hu-scuPA的SP 2/0细胞株由本室保存。
二、应用GAH IgG-Sepharose4B亲和层析柱纯化SZ51Hu-scuPA重组融合蛋白；相关IgG和相关scuPA抗原定量采用ELISA法；scuPA酶活性单位定量采用纤维蛋白平板法；鼠原性单抗SZ51(SZ-51M)和纤维蛋白原的125I标记 采用Iodogen法；SZ-51Hu-scuPA与SZ51M的抗体竞争结合试验参见文献[4]；纤维蛋白原浓度测定按Kit(Stago公司)说明书进行。
三、细胞扩大培养：最初接种采用集合多个小方瓶培养的细胞，弃上清，以1×105/ml细胞密度接种于转瓶(Bellco公司产品)，培养基为RPMI1640，补加葡萄糖至4.5g/L，置CO2培养箱，37℃培养，速度为20转/分，待细胞停止生长后，继续培养12～24小时，离心收集上清，-70℃储存备用。
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四、不同浓度血小板血浆凝块的血栓制备[5]：取健康供血者新鲜全血(3.8%枸橼酸三钠1∶9抗凝)，分离不同浓度血小板(×105血小板/μl)的血浆(浓度PRP为2.5，PPP为1，R-PPP为12)；分别按下列顺序加入125I-Fg(终浓度500?000cpm/ml)、0.5M CaCl2(终浓度0.05M/ml)、凝血酶(终浓度1U/ml)，混匀后立即吸入内径3.5mm的硅胶管内，37℃静置30分钟，将含有凝块的硅胶管切成1.5cm长的小段(约含0.12ml血浆)，取出不同血小板浓度的血栓凝块，用0.9%NaCl 3ml洗涤2次，弃上清后对血栓做总放射性计数，于每只栓子中加入1ml PPP血浆。
五、体外溶栓[5]：取上述制备的三种血小板浓度的血浆，各分成四组：生理盐水组、尿激酶组、尿激酶加SZ51M等摩尔混合组和SZ51Hu-scuPA融合蛋白组；每组分别加入终浓度10IU、20IU和50IU/ml酶活性单位的溶栓剂1ml，设三个平行管进行溶栓试验。置37℃温箱溶栓1、2、4和24小时，各点分别取出100μl上清做放射性计数。溶栓率＝血浆中放射性计数/溶栓前栓子的总放射性计数×100%。
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结果
一、SZ51Hu-scuPA的纯化：采用GAH IgG-Sepharose 4B亲和层析方法对收集的转瓶1L上清进行纯化得纯品5mg左右。酶活性为39?000IU/mg总蛋白。
二、SZ51Hu-scuPA与鼠源性单抗SZ51(SZ51M)的竞争结合试验：125I标记SZ51M与未标记的融合蛋白SZ51Hu-scuPA或SZ-2(抗血小板膜糖蛋白Ib单抗，不与活化血小板结合)活化血小板保温后，融合蛋白显示出和SZ51M有竞争结合活化血小板的剂量依赖性效应。当125I-SZ51M与血小板的结合率下降了一半，即被加入的融合蛋白抑制了50%，此时融合蛋白IgG的加入量为0.98μg/ml，而125I-SZ51M为0.65μg/ml。
三、体外溶栓效率：在PPP组除了生理盐水始终无变化外，uPA组及uPA与SZ51M等摩尔混合组在溶栓开始4小时后，溶栓效率呈逐渐增高的趋势，而SZ51Hu-scuPA融合蛋白组各点在溶栓的第1小时内即产生较高的溶栓效率，50IU/ml在2小时的溶栓效率比相同剂量的uPA高7.2倍，4小时已接近溶栓完全。PRP血栓溶栓组中uPA剂量为10、20和50IU/ml，各点的溶栓率在溶栓4小时内维持在10%左右，至24小时溶栓率呈梯度增加，最高为77.5%(50IU/ml)。uPA和SZ51M等摩尔混合组的溶栓结果与单用uPA组相似。重组SZ51Hu-scuPA融合蛋白在溶栓1小时的结果显示，10、20IU/ml两点溶栓率分别只有7.4%和10.0%，与前两组相似；但当溶栓单位增加至50IU/ml时，溶栓率迅速增加至44.1%，为uPA同剂量的4.1倍。尽管该剂量在溶栓4小时的溶栓率无明显提高，但低剂量的10、20IU/ml两点时已呈现溶栓增加的趋势，分别达21.0%和39.3%。R-PRP血栓溶栓组中，重组SZ51Hu-scuPA融合蛋白剂量50IU/ml时，溶栓的第1小时即表现出溶栓率开始增高，4小时溶栓率达41.9%；20IU/ml溶栓率40.3%，是uPA组(4.8%)的8.4倍。此时uPA组及uPA与SZ51M等摩尔混合组的溶栓结果与生理盐水组相似，未观察到溶栓迹象。24小时uPA组与uPA与SZ51M等摩尔混合组最高溶栓率只有30%左右，而重组SZ51Hu-scuPA融合蛋白各点均达到100%。
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四、血浆纤维蛋白原浓度：对PPP和PRP血浆凝块溶栓4小时血浆纤维蛋白原浓度的变化进行了测定。各溶栓剂量组(10、20和50IU/ml)在PRP血浆凝块的溶解实验中均未引起纤维蛋白原浓度的下降(2.5±0.2g/L)；在PPP血浆凝块的溶解中，只有浓度为50IU/ml的重组SZ51Hu-scuPA融合蛋白引起纤维蛋白原浓度的下降(0.96g/L)。
讨论
本研究通过转瓶扩大培养、亲和层析获得了SZ51Hu-scuPA纯品，亲和力是鼠源性单抗SZ51M的67%。在溶解三组含不同血小板浓度的人血浆凝块时，SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓效率明显高于单用uPA组的溶栓效率，最高分别达7.4倍(PPP血浆凝块)、4.1倍(PRP血浆凝块)和8.4倍(R-PRP血浆凝块)。随着血栓中血小板浓度的增高，尽管SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓效率也有所下降，但uPA组下降更为明显，尤其在溶解R-PRP血栓凝块时，uPA组最高剂量点(50IU/ml)在4小时仍未观察到溶栓迹象，溶栓率与生理盐水组相似，而相同剂量SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓率此时已达41.9%。uPA与SZ51M等摩尔混合组的溶栓结果与uPA组无明显差异。结果表明，由于SZ51Hu-scuPA嵌合分子中抗活化血小板单抗SZ51导向血栓的作用，嵌合分子可明显提高溶栓效率，同时证实活化血小板确实是影响溶栓效率的重要因素。
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纤维蛋白原浓度测定表明，SZ51Hu-scuPA嵌合分子在提高溶栓效率的同时，基本没有出现纤维蛋白原过度降解致浓度下降的情况。只在剂量达50IU/ml、溶解PPP血浆凝块时出现纤维蛋白原浓度降低至0.96g/L的情况。可能与在该剂量时溶栓速度快、效率高有关，溶栓的第1小时溶栓率已达61.8%，第2小时83.9%，而我们检测纤维蛋白原浓度是在溶栓开始后4小时，血栓溶解后释放至血浆中被激活的纤溶酶在此之前已开始降解纤维蛋白原，导致浓度下降的缘故。由于本研究中，比较溶栓效率时采用的活性单位较低，在溶栓4小时检测纤维蛋白原浓度时uPA各剂量点尚不足以大量的激活纤溶酶，因此除了产生较低的溶栓率外，也未引起纤维蛋白原浓度的下降。本研究将为抗体导向溶栓剂的进一步临床研究提供可靠的实验依据。
基金项目：国家“863”高技术科学发展计划基金(102-09-03-02)
参考文献
1，Wu JC，Hc GR，Wu GX，et al.Radioimmunoimaging of experimental arterial and venous thrombi in dogs with 99mTc-labelled monoclonal anti-activated platelet antibody SZ51.NuCl Med Commun，1993，14：1088-1092.
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2，杜令鸟，余瑞荣，华子春，等.抗人活化血小板单克隆抗体与尿激酶杂合分子的纤溶作用.中国科学(B辑)，1993，23：32-37.
3，刘征辉，万海英，王斌，等.重组抗体-尿激酶导向溶栓剂的基因构建及表达.生物化学与生物物理学报，1998，30：601-606.
4，Fraker PJ，Speck LC.Protein and cell membrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide，1，3，4，6-tetrachloro-3a，6a-dipheni-glycoluril.Diphenigly-coluril.Biochem Biophys Res Commun，1978，80：849-857.
5，Runge MS, BodeC, Matsueda GR, et al. Conjugation to an antifibrin monoclonal antibody enhances the fibrinoly tic potency of tissue plasminogen acfivaton in victro. Biochemistry, 1988, 27:1153-1157.
收稿：1999-04-09
修回：1999-08-24, 百拇医药
单位：万海英 刘征辉 顾津明 李佩霞(215006苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所 血栓与止血研究室)；朱明清 阮长耿(苏州医学院核医学重点实验室)
关键词：活化血小板；单抗；单链尿激酶；导向溶栓剂
江苏医药001012 【摘要】 目的 获得大量人源化抗人活化血小板单抗SZ51Hu和尿激酶原(scuPA)融合蛋白SZ51Hu-scuPA并测定该基因重组抗体导向溶栓剂的导向溶栓性。方法 通过转瓶扩大培养系统获得大量SZ51Hu-scuPA；通过抗体竞争结合实验证明融合蛋白的抗体亲和力；进而与尿激酶进行比较对不同浓度血小板血浆凝块的溶栓研究。结果 该融合蛋白在培养上清中的表达量为5mg/ml；其纤溶活性为39000IU/mg；抗体亲和力是鼠源性单抗的67%；体外溶栓效力较uPA提高4.1～8.4倍。结论 该融合蛋白比uPA具有更高、更快的溶栓效率，是一种高效抗体导向溶栓剂。
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Study on thrombolysis of a recombinant SZ51 Hu-scuPA in vitro
WAN Haiying LIU Zhenghui GU Jinming et al.
(Jiangsu Institute of Hematology，the First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College，Suzhou 215006)
【Abstract】 Objective To compare the thrombolytic properties in vitro between urokinase(uPA) and the recombinant chimeric plasminogen activator SZ51 Hu-scuPA，which was composed of a humanized monoclonal antibody SZ51(SZ51 Hu) specifically against activated human platelet and a single-chain urokinase(scuPA).Methods The fusion protein SZ51 Hu-scuPA was produced from the supernatant of a stable myeloma cell line grown in spinner flask.Its affinity to activated human platelet was obtained by competitive binding of SZ51 Hu-scuPA and murine mAb SZ51；the thrombolytic potency of SZ51 Hu-scuPA was compared with uPA by a system composed of an 125I-fibrin-labeled human plasma clot.Results The concentration of the fusion protein in the supernatant was 5mg/ml.The binding capacity to activated human platelet of purified fusion protein SZ51Hu-scuPA was 67% of the SZ51 M and the fibrinolytic activity was 39，000 IU/mg.In the dissolution of the human plasma clots containing the different concentration of human platelets，the fusion protein SZ51Hu-scuPA was 4.1-8.4 folds more potent than uPA.Conclusion The fusion protein SZ51Hu-scuPA was more competent to dissolve platelet clots than uPA.
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【Key words】 Activated platelets Monoclonal antibody Single-chain urokinase Targeting thrombolysis
我室于1989年研制了国内第一株抗人活化血小板GMP-140单抗SZ-51(SZ-51M)，标记的99mTc-SZ51不仅在实验性狗股动、静脉血栓模型中，而且在人体内血栓显像中都显示了良好的显像效果[1]，证明了其血栓导向能力。与尿激酶的化学偶联产物体外溶栓效率较单用尿激酶提高了3～5倍[2]。本研究对通过基因工程方法获得的分泌重组SZ51Hu-scuPA抗体导向溶栓剂[3]的阳性细胞克隆进行了体外扩大培养，应用亲和层析技术纯化SZ51Hu-scuPA融合蛋白，与uPA对125I标记纤维蛋白原的不同血小板血栓凝块在体外进行了溶栓比较，以期得到一种新型的基因工程抗体导向溶栓剂。
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材料和方法
一、人尿激酶纯品由南京大学制药厂朱长生教授惠赠，比活为155?000IU/mg；人纤维蛋白原购自Sigma公司；重组SZ51Hu-scuPA的SP 2/0细胞株由本室保存。
二、应用GAH IgG-Sepharose4B亲和层析柱纯化SZ51Hu-scuPA重组融合蛋白；相关IgG和相关scuPA抗原定量采用ELISA法；scuPA酶活性单位定量采用纤维蛋白平板法；鼠原性单抗SZ51(SZ-51M)和纤维蛋白原的125I标记 采用Iodogen法；SZ-51Hu-scuPA与SZ51M的抗体竞争结合试验参见文献[4]；纤维蛋白原浓度测定按Kit(Stago公司)说明书进行。
三、细胞扩大培养：最初接种采用集合多个小方瓶培养的细胞，弃上清，以1×105/ml细胞密度接种于转瓶(Bellco公司产品)，培养基为RPMI1640，补加葡萄糖至4.5g/L，置CO2培养箱，37℃培养，速度为20转/分，待细胞停止生长后，继续培养12～24小时，离心收集上清，-70℃储存备用。
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四、不同浓度血小板血浆凝块的血栓制备[5]：取健康供血者新鲜全血(3.8%枸橼酸三钠1∶9抗凝)，分离不同浓度血小板(×105血小板/μl)的血浆(浓度PRP为2.5，PPP为1，R-PPP为12)；分别按下列顺序加入125I-Fg(终浓度500?000cpm/ml)、0.5M CaCl2(终浓度0.05M/ml)、凝血酶(终浓度1U/ml)，混匀后立即吸入内径3.5mm的硅胶管内，37℃静置30分钟，将含有凝块的硅胶管切成1.5cm长的小段(约含0.12ml血浆)，取出不同血小板浓度的血栓凝块，用0.9%NaCl 3ml洗涤2次，弃上清后对血栓做总放射性计数，于每只栓子中加入1ml PPP血浆。
五、体外溶栓[5]：取上述制备的三种血小板浓度的血浆，各分成四组：生理盐水组、尿激酶组、尿激酶加SZ51M等摩尔混合组和SZ51Hu-scuPA融合蛋白组；每组分别加入终浓度10IU、20IU和50IU/ml酶活性单位的溶栓剂1ml，设三个平行管进行溶栓试验。置37℃温箱溶栓1、2、4和24小时，各点分别取出100μl上清做放射性计数。溶栓率＝血浆中放射性计数/溶栓前栓子的总放射性计数×100%。
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结果
一、SZ51Hu-scuPA的纯化：采用GAH IgG-Sepharose 4B亲和层析方法对收集的转瓶1L上清进行纯化得纯品5mg左右。酶活性为39?000IU/mg总蛋白。
二、SZ51Hu-scuPA与鼠源性单抗SZ51(SZ51M)的竞争结合试验：125I标记SZ51M与未标记的融合蛋白SZ51Hu-scuPA或SZ-2(抗血小板膜糖蛋白Ib单抗，不与活化血小板结合)活化血小板保温后，融合蛋白显示出和SZ51M有竞争结合活化血小板的剂量依赖性效应。当125I-SZ51M与血小板的结合率下降了一半，即被加入的融合蛋白抑制了50%，此时融合蛋白IgG的加入量为0.98μg/ml，而125I-SZ51M为0.65μg/ml。
三、体外溶栓效率：在PPP组除了生理盐水始终无变化外，uPA组及uPA与SZ51M等摩尔混合组在溶栓开始4小时后，溶栓效率呈逐渐增高的趋势，而SZ51Hu-scuPA融合蛋白组各点在溶栓的第1小时内即产生较高的溶栓效率，50IU/ml在2小时的溶栓效率比相同剂量的uPA高7.2倍，4小时已接近溶栓完全。PRP血栓溶栓组中uPA剂量为10、20和50IU/ml，各点的溶栓率在溶栓4小时内维持在10%左右，至24小时溶栓率呈梯度增加，最高为77.5%(50IU/ml)。uPA和SZ51M等摩尔混合组的溶栓结果与单用uPA组相似。重组SZ51Hu-scuPA融合蛋白在溶栓1小时的结果显示，10、20IU/ml两点溶栓率分别只有7.4%和10.0%，与前两组相似；但当溶栓单位增加至50IU/ml时，溶栓率迅速增加至44.1%，为uPA同剂量的4.1倍。尽管该剂量在溶栓4小时的溶栓率无明显提高，但低剂量的10、20IU/ml两点时已呈现溶栓增加的趋势，分别达21.0%和39.3%。R-PRP血栓溶栓组中，重组SZ51Hu-scuPA融合蛋白剂量50IU/ml时，溶栓的第1小时即表现出溶栓率开始增高，4小时溶栓率达41.9%；20IU/ml溶栓率40.3%，是uPA组(4.8%)的8.4倍。此时uPA组及uPA与SZ51M等摩尔混合组的溶栓结果与生理盐水组相似，未观察到溶栓迹象。24小时uPA组与uPA与SZ51M等摩尔混合组最高溶栓率只有30%左右，而重组SZ51Hu-scuPA融合蛋白各点均达到100%。
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四、血浆纤维蛋白原浓度：对PPP和PRP血浆凝块溶栓4小时血浆纤维蛋白原浓度的变化进行了测定。各溶栓剂量组(10、20和50IU/ml)在PRP血浆凝块的溶解实验中均未引起纤维蛋白原浓度的下降(2.5±0.2g/L)；在PPP血浆凝块的溶解中，只有浓度为50IU/ml的重组SZ51Hu-scuPA融合蛋白引起纤维蛋白原浓度的下降(0.96g/L)。
讨论
本研究通过转瓶扩大培养、亲和层析获得了SZ51Hu-scuPA纯品，亲和力是鼠源性单抗SZ51M的67%。在溶解三组含不同血小板浓度的人血浆凝块时，SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓效率明显高于单用uPA组的溶栓效率，最高分别达7.4倍(PPP血浆凝块)、4.1倍(PRP血浆凝块)和8.4倍(R-PRP血浆凝块)。随着血栓中血小板浓度的增高，尽管SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓效率也有所下降，但uPA组下降更为明显，尤其在溶解R-PRP血栓凝块时，uPA组最高剂量点(50IU/ml)在4小时仍未观察到溶栓迹象，溶栓率与生理盐水组相似，而相同剂量SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓率此时已达41.9%。uPA与SZ51M等摩尔混合组的溶栓结果与uPA组无明显差异。结果表明，由于SZ51Hu-scuPA嵌合分子中抗活化血小板单抗SZ51导向血栓的作用，嵌合分子可明显提高溶栓效率，同时证实活化血小板确实是影响溶栓效率的重要因素。
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基金项目：国家“863”高技术科学发展计划基金(102-09-03-02)
参考文献
1，Wu JC，Hc GR，Wu GX，et al.Radioimmunoimaging of experimental arterial and venous thrombi in dogs with 99mTc-labelled monoclonal anti-activated platelet antibody SZ51.NuCl Med Commun，1993，14：1088-1092.
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2，杜令鸟，余瑞荣，华子春，等.抗人活化血小板单克隆抗体与尿激酶杂合分子的纤溶作用.中国科学(B辑)，1993，23：32-37.
3，刘征辉，万海英，王斌，等.重组抗体-尿激酶导向溶栓剂的基因构建及表达.生物化学与生物物理学报，1998，30：601-606.
4，Fraker PJ，Speck LC.Protein and cell membrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide，1，3，4，6-tetrachloro-3a，6a-dipheni-glycoluril.Diphenigly-coluril.Biochem Biophys Res Commun，1978，80：849-857.
5，Runge MS, BodeC, Matsueda GR, et al. Conjugation to an antifibrin monoclonal antibody enhances the fibrinoly tic potency of tissue plasminogen acfivaton in victro. Biochemistry, 1988, 27:1153-1157.
收稿：1999-04-09
修回：1999-08-24, 百拇医药