MDM2在食管鳞癌中的表达和意义
作者：李小东 戎铁华 傅剑华 龙浩
单位：510060 广州市，中山医科大学肿瘤医院胸科
关键词：癌，鳞状细胞；食管肿瘤；癌基因
实用医学杂志001013 摘 要 目的：探讨癌基因MDM2在食管鳞癌中的表达和意义。方法：采用免疫组织化学链菌素亲生物素蛋白过氧化物酶连接法(SP法)检测MDM2在食管鳞癌中的表达，将检测结果与临床资料进行统计学分析。结果：MDM2蛋白阳性率为41.4%，与食管鳞癌细胞学分级呈负相关(P<0.05)，与食管鳞癌TNM分期呈负相关(P<0.05)。结论：MDM2蛋白表达可作为食管鳞癌细胞学分级和TNM分期的参考指标之一，可能和预后有关。
有关癌基因MDM2在软组织肉瘤和骨肉瘤中表达的研究较为多见，而MDM2基因在食管鳞癌中的表达以及MDM2基因和食管鳞癌TNM分期及细胞学分级的关系，目前国内研究不多。本文拟探讨MDM2在食管鳞癌中的表达和意义。
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1 资料与方法
1.1 病例选择 收集我院1998～1999年施行手术治疗的部分食管鳞癌病例共70例。年龄36～72岁，平均57岁；男43例，女27例。根据细胞学分级，Ⅰ级16例，Ⅱ级34例，Ⅲ级20例。根据1997年UICC食管癌TNM分期标准，Ⅰ期5例，ⅡA期12例，ⅡB期18例，Ⅲ期30例，Ⅳ期5例。
1.2 实验方法 对食管鳞癌组织进行MDM2蛋白检测，采用链菌素亲生物素蛋白过氧化物酶连接法(SP法)。实验步骤：(1)切片，将存档的病理标本蜡块，每例各制作2张厚5 μ m的切片，1张常规HE染色，1张作MDM2蛋白检测。(2)将玻片置于60℃的烤箱中烤片2 h。(3)二甲苯脱蜡3次，每次5 min。(4)酒精脱二甲苯，95%酒精5 min×2次，70%酒精5 min×2次，50%酒精5 min×2次。(5)水化：蒸馏水Ⅰ,5 min，蒸馏水Ⅱ，5 min，蒸馏水Ⅲ，5 min。(6)3%H2O2室温10 min，目的是清除内源性过氧化酶。(7)将需做MDM2蛋白检测的切片置于枸橼酸钠缓冲液(pH=6.0)，用微波处理10 min，目的是使MDM2蛋白的抗原性恢复。(8)蒸馏水洗5 min×2次，PBS 5 min×3次。(9)加入10%非免疫血清孵育10 min，目的是清除非特异染色。(10)倾去多余血清，滴加一抗。抗MDM2浓度为1∶400，4℃在冰箱过夜。(11)PBS液洗5 min×2次。(12)滴加二抗，在室温下作用30 min。(13)PBS液洗5 min×2次。(14)滴加SP溶液，在室温下作用30 min。(15)DAB显色、复染，常规脱水透明封片。MDM2蛋白免疫组化检测分别以Santa Cruz和DAKO公司提供的阳性片作为阳性对照，均以PBS液替代一抗作为阴性对照。
, 百拇医药
MDM2免疫组化染色结果：MDM2蛋白定位于细胞核，呈细颗粒状，少数肿瘤细胞浆和细胞膜呈弱阳性。计数细胞核阳性细胞，阳性细胞数≥10%定为阳性。
1.3 统计方法 采用pearson χ2检验。
2 结果
2.1 MDM2蛋白阳性表达率 70例食管鳞癌中MDM2蛋白阳性表达者29例(41.4%)。
2.2 MDM2蛋白表达与食管鳞癌分级的关系 70例食管鳞癌，其中Ⅰ级16例，MDM2阳性表达者11例(68.8%)；Ⅱ级34例，MDM2阳性表达者14例(41.2%)；Ⅲ级20例，MDM2阳性表达者4例(20.0%)。MDM2蛋白阳性率在Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级间比较，差异有显著意义，且MDM2蛋白阳性率和分级存在负相关。见表1。
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表1 MDM2蛋白表达与食管鳞癌分级的关系(例) 分级
MDM2蛋白表达
总计
+
-
Ⅰ
11
5
16
Ⅱ
14
20
, 百拇医药 34
Ⅲ
4
16
20
总计
29
41
70
注：χ2＝8.708，P＝0.013，r=0.351，P＝0.003
2.3 MDM2蛋白的表达与食管鳞癌TNM分期的关系 70例食管鳞癌，根据UICC 1997分期，其中Ⅰ期5例，MDM2阳性表达者4例(4/5)；ⅡA期12例，MDM2阳性表达者9例(75.0%)；ⅡB期18例，MDM2阳性表达者7例(38.9%)；Ⅲ期30例，MDM2阳性表达者8例(26.7%)；Ⅳ期5例，MDM2阳性表达者1例(1/5)。MDM2蛋白阳性率在各TNM分期间比较，差异有显著意义，且MDM2蛋白阳性率和TNM分期存在负相关。见表2。
, 百拇医药
表2 MDM2蛋白表达与食管鳞癌TNM分期的关系(例) TNM
分期
MDM2蛋白表达
总计
+
-
Ⅰ
4
1
5
ⅡA
9
, 百拇医药
3
12
ⅡB
7
11
19
Ⅲ
8
22
30
Ⅳ
1
4
5
, 百拇医药
总计
29
41
70
注：χ2＝12.327，P＝0.015；r＝-0.399，P＝0.001
3 讨论
MDM2作为一种癌基因，最初是从一种可致癌的小鼠成纤维细胞中发现的。1992年Oliner等[1]用小鼠MDM2 cDNA为探针，从人基因库中筛选出了人的MDM2基因。目前已经发现至少7种MDM2-mRNA和5种MDM2蛋白(P 90，P 85，P 76，P 74，P 57)，在5种MDM2蛋白中，P 90和P 57与肿瘤细胞的发生和增殖关系较为密切[7]。
, 百拇医药
Momand等[3]报道包括28种肿瘤在内的3 889例肿瘤患者中，MDM2表达率为7%，其中包括19种肿瘤存在MDM2表达。在软组织肉瘤和骨肉瘤中MDM2表达率分别为20%和16%。李挺等[4]报道肉瘤组织中MDM2表达率为38.8%，赖日权等[5]报道横纹肌肉瘤组织MDM2表达率甚至高达77.4%。除此之外，在急性白血病、膀胱癌和乳腺癌组织中也有MDM2表达的报道。
有关MDM2蛋白在食管鳞癌中表达的研究，目前尚不多见。赵仲生等[6]的研究结果表明：MDM2蛋白的阳性表达率为42.6%，在细胞分级中，Ⅰ级为76.9%，Ⅱ级为50.0%，Ⅲ级为13.0%。Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级之间差异有显著意义。而在临床病理分期中(根据国内1991年标准)，Ⅰ期为53.3%，Ⅱ期为51.7%，Ⅲ期为25%，Ⅳ期为21%，Ⅰ，Ⅱ期与Ⅲ，Ⅳ期差异有显著意义。表明MDM2蛋白在高分化细胞和早期食管癌(Ⅰ，Ⅱ期)表达较高，而在低分化癌细胞和晚期食管癌(Ⅲ，Ⅳ)中表达较低。Laian等[7]报道在浅表性期膀胱移行癌病例中，有62.5%表达MDM2蛋白，而侵犯肌层的膀胱移行细胞癌仅24%表达MDM2蛋白。上述研究结果与本研究结果类似。本实验结果MDM2蛋白阳性率为41.4%，与食管鳞癌细胞学分级呈负相关(P＝0.003)，与食管鳞癌TNM分期呈负相关(P＝0.001)，表明MDM2表达状况与食管鳞癌的生物学行为有关，可作为食管鳞癌的病理分期和预后的参考指标之一。
, 百拇医药
参考文献
1，Oliner JD,Kinlzer KW,Meltzer DS,et al. Amplification of a gene encoding a p 53 associated protein in human sarcomas. Nature,1992,358(6381):80～83.
2，Gorgoulis VG,Ioumpourlis V,Rassidakis GE,et al. A molecular and immunohistochemical study of the MDM2 protein isoforms and p 53 gene product in bronchogenic carcinoma. J Pathol,1996,180(2):129～137.
3，Momand J,Jung D,Wilczynski S,et al. The MDM2 gene amplification database. Nucleeic Acids Res,1998，26(15)：3453～3459.
, 百拇医药
4，李挺，张波，罗杰，等. 癌基因MDM2和抑癌基因p 53在肉瘤组织中的变化及相关性. 临床与实验病理学杂志，1998，14(4)：347～349.
5，赖日权，王卓才，折晓宁，等. 横纹肌肉瘤p 53，MDM2基因及p 53，p21，p185蛋白表达检测比较. 癌症，1998，17(5)：343～345.
6，赵仲生，张，梅，徐文娟. p 53蛋白和MDM2蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达意义. 实用癌症杂志，1998，13(3)：201～203.
7，Lianes P,Orlow I,Zhang ZF,et al. Altered patterns of MDM2 and p 53 expression in human bladder cancer. J Natl Cancer Inst,1994，86(17)：1325.
(收稿日期：2000-05-08), 百拇医药
单位：510060 广州市，中山医科大学肿瘤医院胸科
关键词：癌，鳞状细胞；食管肿瘤；癌基因
实用医学杂志001013 摘 要 目的：探讨癌基因MDM2在食管鳞癌中的表达和意义。方法：采用免疫组织化学链菌素亲生物素蛋白过氧化物酶连接法(SP法)检测MDM2在食管鳞癌中的表达，将检测结果与临床资料进行统计学分析。结果：MDM2蛋白阳性率为41.4%，与食管鳞癌细胞学分级呈负相关(P<0.05)，与食管鳞癌TNM分期呈负相关(P<0.05)。结论：MDM2蛋白表达可作为食管鳞癌细胞学分级和TNM分期的参考指标之一，可能和预后有关。
有关癌基因MDM2在软组织肉瘤和骨肉瘤中表达的研究较为多见，而MDM2基因在食管鳞癌中的表达以及MDM2基因和食管鳞癌TNM分期及细胞学分级的关系，目前国内研究不多。本文拟探讨MDM2在食管鳞癌中的表达和意义。
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1 资料与方法
1.1 病例选择 收集我院1998～1999年施行手术治疗的部分食管鳞癌病例共70例。年龄36～72岁，平均57岁；男43例，女27例。根据细胞学分级，Ⅰ级16例，Ⅱ级34例，Ⅲ级20例。根据1997年UICC食管癌TNM分期标准，Ⅰ期5例，ⅡA期12例，ⅡB期18例，Ⅲ期30例，Ⅳ期5例。
1.2 实验方法 对食管鳞癌组织进行MDM2蛋白检测，采用链菌素亲生物素蛋白过氧化物酶连接法(SP法)。实验步骤：(1)切片，将存档的病理标本蜡块，每例各制作2张厚5 μ m的切片，1张常规HE染色，1张作MDM2蛋白检测。(2)将玻片置于60℃的烤箱中烤片2 h。(3)二甲苯脱蜡3次，每次5 min。(4)酒精脱二甲苯，95%酒精5 min×2次，70%酒精5 min×2次，50%酒精5 min×2次。(5)水化：蒸馏水Ⅰ,5 min，蒸馏水Ⅱ，5 min，蒸馏水Ⅲ，5 min。(6)3%H2O2室温10 min，目的是清除内源性过氧化酶。(7)将需做MDM2蛋白检测的切片置于枸橼酸钠缓冲液(pH=6.0)，用微波处理10 min，目的是使MDM2蛋白的抗原性恢复。(8)蒸馏水洗5 min×2次，PBS 5 min×3次。(9)加入10%非免疫血清孵育10 min，目的是清除非特异染色。(10)倾去多余血清，滴加一抗。抗MDM2浓度为1∶400，4℃在冰箱过夜。(11)PBS液洗5 min×2次。(12)滴加二抗，在室温下作用30 min。(13)PBS液洗5 min×2次。(14)滴加SP溶液，在室温下作用30 min。(15)DAB显色、复染，常规脱水透明封片。MDM2蛋白免疫组化检测分别以Santa Cruz和DAKO公司提供的阳性片作为阳性对照，均以PBS液替代一抗作为阴性对照。
, 百拇医药
MDM2免疫组化染色结果：MDM2蛋白定位于细胞核，呈细颗粒状，少数肿瘤细胞浆和细胞膜呈弱阳性。计数细胞核阳性细胞，阳性细胞数≥10%定为阳性。
1.3 统计方法 采用pearson χ2检验。
2 结果
2.1 MDM2蛋白阳性表达率 70例食管鳞癌中MDM2蛋白阳性表达者29例(41.4%)。
2.2 MDM2蛋白表达与食管鳞癌分级的关系 70例食管鳞癌，其中Ⅰ级16例，MDM2阳性表达者11例(68.8%)；Ⅱ级34例，MDM2阳性表达者14例(41.2%)；Ⅲ级20例，MDM2阳性表达者4例(20.0%)。MDM2蛋白阳性率在Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级间比较，差异有显著意义，且MDM2蛋白阳性率和分级存在负相关。见表1。
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表1 MDM2蛋白表达与食管鳞癌分级的关系(例) 分级
MDM2蛋白表达
总计
+
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Ⅰ
11
5
16
Ⅱ
14
20
, 百拇医药 34
Ⅲ
4
16
20
总计
29
41
70
注：χ2＝8.708，P＝0.013，r=0.351，P＝0.003
2.3 MDM2蛋白的表达与食管鳞癌TNM分期的关系 70例食管鳞癌，根据UICC 1997分期，其中Ⅰ期5例，MDM2阳性表达者4例(4/5)；ⅡA期12例，MDM2阳性表达者9例(75.0%)；ⅡB期18例，MDM2阳性表达者7例(38.9%)；Ⅲ期30例，MDM2阳性表达者8例(26.7%)；Ⅳ期5例，MDM2阳性表达者1例(1/5)。MDM2蛋白阳性率在各TNM分期间比较，差异有显著意义，且MDM2蛋白阳性率和TNM分期存在负相关。见表2。
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表2 MDM2蛋白表达与食管鳞癌TNM分期的关系(例) TNM
分期
MDM2蛋白表达
总计
+
-
Ⅰ
4
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ⅡA
9
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3
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ⅡB
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Ⅲ
8
22
30
Ⅳ
1
4
5
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总计
29
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注：χ2＝12.327，P＝0.015；r＝-0.399，P＝0.001
3 讨论
MDM2作为一种癌基因，最初是从一种可致癌的小鼠成纤维细胞中发现的。1992年Oliner等[1]用小鼠MDM2 cDNA为探针，从人基因库中筛选出了人的MDM2基因。目前已经发现至少7种MDM2-mRNA和5种MDM2蛋白(P 90，P 85，P 76，P 74，P 57)，在5种MDM2蛋白中，P 90和P 57与肿瘤细胞的发生和增殖关系较为密切[7]。
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Momand等[3]报道包括28种肿瘤在内的3 889例肿瘤患者中，MDM2表达率为7%，其中包括19种肿瘤存在MDM2表达。在软组织肉瘤和骨肉瘤中MDM2表达率分别为20%和16%。李挺等[4]报道肉瘤组织中MDM2表达率为38.8%，赖日权等[5]报道横纹肌肉瘤组织MDM2表达率甚至高达77.4%。除此之外，在急性白血病、膀胱癌和乳腺癌组织中也有MDM2表达的报道。
有关MDM2蛋白在食管鳞癌中表达的研究，目前尚不多见。赵仲生等[6]的研究结果表明：MDM2蛋白的阳性表达率为42.6%，在细胞分级中，Ⅰ级为76.9%，Ⅱ级为50.0%，Ⅲ级为13.0%。Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级之间差异有显著意义。而在临床病理分期中(根据国内1991年标准)，Ⅰ期为53.3%，Ⅱ期为51.7%，Ⅲ期为25%，Ⅳ期为21%，Ⅰ，Ⅱ期与Ⅲ，Ⅳ期差异有显著意义。表明MDM2蛋白在高分化细胞和早期食管癌(Ⅰ，Ⅱ期)表达较高，而在低分化癌细胞和晚期食管癌(Ⅲ，Ⅳ)中表达较低。Laian等[7]报道在浅表性期膀胱移行癌病例中，有62.5%表达MDM2蛋白，而侵犯肌层的膀胱移行细胞癌仅24%表达MDM2蛋白。上述研究结果与本研究结果类似。本实验结果MDM2蛋白阳性率为41.4%，与食管鳞癌细胞学分级呈负相关(P＝0.003)，与食管鳞癌TNM分期呈负相关(P＝0.001)，表明MDM2表达状况与食管鳞癌的生物学行为有关，可作为食管鳞癌的病理分期和预后的参考指标之一。
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参考文献
1，Oliner JD,Kinlzer KW,Meltzer DS,et al. Amplification of a gene encoding a p 53 associated protein in human sarcomas. Nature,1992,358(6381):80～83.
2，Gorgoulis VG,Ioumpourlis V,Rassidakis GE,et al. A molecular and immunohistochemical study of the MDM2 protein isoforms and p 53 gene product in bronchogenic carcinoma. J Pathol,1996,180(2):129～137.
3，Momand J,Jung D,Wilczynski S,et al. The MDM2 gene amplification database. Nucleeic Acids Res,1998，26(15)：3453～3459.
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4，李挺，张波，罗杰，等. 癌基因MDM2和抑癌基因p 53在肉瘤组织中的变化及相关性. 临床与实验病理学杂志，1998，14(4)：347～349.
5，赖日权，王卓才，折晓宁，等. 横纹肌肉瘤p 53，MDM2基因及p 53，p21，p185蛋白表达检测比较. 癌症，1998，17(5)：343～345.
6，赵仲生，张，梅，徐文娟. p 53蛋白和MDM2蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达意义. 实用癌症杂志，1998，13(3)：201～203.
7，Lianes P,Orlow I,Zhang ZF,et al. Altered patterns of MDM2 and p 53 expression in human bladder cancer. J Natl Cancer Inst,1994，86(17)：1325.
(收稿日期：2000-05-08), 百拇医药