血吸虫病肝纤维化的定量方法比较
作者：于忠省 桂希恩 陈德基 骆名其
单位：于忠省(湖北医科大学附二院 武汉 430071；现在山东滨州地区人民医院 256610)；桂希恩 陈德基 骆名其(湖北医科大学附二院 武汉 430071)
关键词：血吸虫病；肝纤维化；定量检测；方法
中国现代医学杂志001011 目的：探索可靠反映血吸虫病肝纤维化的定量方法。方法：将86例晚期血吸虫病患者的肝组织标本，分别做HE、胶原纤维及弹力纤维染色。光镜下对胶原纤维进行半定量计分；用计算机图像分析系统测定全胶原表面密度(SDTC)及全弹力表面密度(SDTE)；用比色法测定肝组织中的胶原含量。结果：肝组织中SDTC与SDTE呈正相关(r=0.76,P<0.001)；SDTC与比色法测得胶原含量呈显著性相关(r=0.78,P<0.001)。以SDTC为标准分组，比较SSS计分及比色法测定的胶原含量，结果组间差异均有显著性(P<0.01)；SDTC与SSS及其各变量的多元逐步回归分析表明对SDTC起主要影响的因素是SSS。结论：计分法、图像分析法及比色法均可用于血吸虫病肝纤维化的定量分析。比色法由于间便易操作，特异性强，重度性好，认为是肝纤维化定量检测的较好方法。
, 百拇医药
分类号 R532.2
A COMPARISON OF THE QUANTITATIVE METHODS OF HEPATIC
FIBROSIS IN PATIENTS WITH SCHISTOSOMIASIS
Yu Zhongsheng
(The People's Hospital of Binzhou, Binzhou 256610)
Gui Xi'en，Chen Deji，Luo Mingqi
(The Second Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071)
, 百拇医药
[Abstract] Objective: To study reliable methods for the quantitative evaluation of hepatic fibrosis of patients with advanced schistosomiasis (AS). Methods: Liver specimens from 86 patients with AS were stained for HE, collagen and elastin fiber respectively. The histological semi-quantitative scorning system (SSS) was used to the estimation of hepatic fibrosis; the surface densities of total collagen (SDTC) and total elastin (SDTE) were measured by a computerized imagine analysis system; collagen concentration in liver tissue sections were determined by colorimetric method. Results: SDTC and SDTE were significantly related (r=0.76, P<0.001). The result of multiple regression analysis showed that SSS was selected as the best predictor of SDTC. The significant difference was found between groups of SDTC, SSS and collagen content. The collagen content and the SDTC were significantly liner related (r=0.79, P<0.001). Conclusions: The SSS, imaging analysis and colorimetric method can all be used in the quantitative analysis of hepatic fibrosis. The colorimetric method is a simple, sensitive, specific and reproducible method. Hence, it is an ideal quantitative method for the measurement of collagen at present.
, 百拇医药
Key words: Schistosomiasis; Hepatic Fibrosis; Semi-quantitative Scorning System
肝纤维化的定量检测对判断纤维化血清标志物的可靠性，对估计病情和预后有重要意义，同时也可为筛选和评价抗纤维化药物的疗效提供依据。目前用于肝纤维定量检测的方法有计算机图像分析法、半定量计分法(SSS)及胶原比色测定法。上述方法已用于肝炎及酒精性肝病纤维化的定量检测，尚未见用于血吸虫病患者的报道。本文对86例晚期血吸虫病患者的肝组织作HE和胶原及弹力纤维染色，以上述三种方法测定肝纤维含量，并对其结果作比较分析。
1 材料与方法
1.1 肝组织来源及其处理
86例临床及病理诊断为巨脾型晚期血吸虫病患者的肝组织标本，脾切除手术时取材，标本以10%福尔马林固定，石蜡包埋连续切片，切片厚约3μm，分别作HE、胶原纤维及弹力纤维染色，每例标本同时切一厚约15μm的切片，放于小试管中，留待比色法测定用。
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1.2 实验方法
胶原纤维用VG氏苦味酸品红染色法染成鲜红色，弹力纤维用Weigert氏法染成蓝黑色。
半定量计分参照Chevallier等[1]的方法评估中央静脉壁(CLV)、窦边间隙(PS)、汇管区(PT)纤维含量及纤维隔数目(NS)与宽度(WS)，总分SSS=CLV+PS+PT+2(NS×WS)。
用IBAS-200型图像分析仪测定全胶原表面密度(SDTC)及全弹力表面密度(SDTE)，分别用其占分析的表面面积的百分比表示，在计算机图像分析系统自动进行。
比色法参照Leon等[2]描述的方法进行。
1.3 统计学处理
直线相关和直线回归分析，方差分析及多元逐步回归分析，用SPSS软件包完成。
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2 结果
2.1 一般观察
86例肝组织标本HE染色观察，均有血吸虫虫卵沉积，伴有不同程度的肝纤维化，呈典型的干线型特征。弹力纤维及胶原纤维染色可见两者均明显增生，增生部分基本一致，主要位于汇管区和纤维隔。中央静脉壁(CLV)及窦边间隙(PS)内均有不同程度的胶原纤维增生，PS增生常位于CLV周围[1～7]。
2.2 血吸虫病肝纤维化SDTC与SDTE的关系
特殊组织染色使胶原纤维与弹力纤维分别呈鲜红色和蓝黑色，与切片其他成分对比清楚，使计算机系统能准确识别，自动测量其表面面积和全部切片面积并计算出各自的面积百分比(见附图)。测得的全胶原表面密度SDTC均值为11.0±6.31与全弹力表面密度(SDTE)用直线相关分析发现两者呈正相关(r=0.76,P<0.001)。
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2.3 以图像分析法测定结果为标准，按<4%，≥4%及≥8%分为三组，并与SSS计分及比色法测定胶原含量比较表1 图像分析、SSS及比色法对血吸虫病肝纤维化的定量检测结果 (
±s) 分组
例数
SDTC(%)
SSS(计分)
比色法(OD值)
A
33
1.99±1.07
4.76±1.39
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0.19±0.10
B
30
5.86±0.93
10.83±2.35
0.44±0.10
C
23
11.05±3.10
16.35±2.19
0.58±0.12
A∶B
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P<0.01
P<0.01
P<0.01
B∶C
P<0.01
P<0.01
P<0.01
C∶A
P<0.01
P<0.01
P<0.01
2.4 SSS与图像分析测得的SDTC的相关性
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图像分析测得的SDTC与计分测得的PS、PT、NS及WS呈正相关。多元逐步回归分析结果见表2。在显著性水准a=0.01及多变量共存的条件下，对SDTC起主要影响因素的是各变量之总合〔SSS=CLV+PS+PT+2(NS×WS)〕。表2 影响SDTC的逐步回归结果 变量
回归系数
回归系数标准误
标准回归系数
t
P
SSS
0.5675
0.0672
0.7141
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8.448
0.000
截距
-1.0717
0.4005
-2.676
0.009
2.5 比色法与图像分析比较
将比色法测得的胶原含量与图像分析测得的SDTC进行比较，两者呈显著性相关(r=0.79,P<0.001)，见附图。
附图 直线相关分析比较比色法测得的胶原含量(OD)与图像分析测得的SDTC，两者呈显著性相关(r=0.79,P<0.001)
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3 讨论
血吸虫病肝纤维化导致门脉高压，患者的临床表现及预后与肝纤维化的程度有关。准确的定量对于判断病情和估计预后有重要意义，同时也将为筛选和评价抗肝纤维化药物的疗效提供依据。
肝纤维的主要成分是胶原纤维，但也有部分属于弹力纤维及网状纤维。严家春[3]等对慢性乙肝肝组织学的观察发现，胶原纤维增生约需用1～3个月，弹力纤维的出现约需5～6个月。血吸虫病肝纤维化是主动性纤维化，发病早期即有大量的胶原纤维合成[4]。本研究比较晚期血吸虫病肝组织胶原纤维与弹力纤维的含量，结果发现两者均增加且呈正比。提示晚期血吸虫病患者病程较长，多种纤维增生，可能给肝组织病变的逆转及抗纤维化的治疗带来困难。
形态学计量(Morphometry)指应用图像测试技术对生物组织的形态及结果进行定量分析。图像分析被认为是形态学计量的金标准，且批内分析差异很小[5]。但由于仪器比较昂贵，检测费用较高，且需要训练有素的计算机操作者，使其应用受到一定的限制。
, 百拇医药
1994年Chevallier[1]等对200例各种原因的慢性肝病患者的肝组织标本行胶原纤维染色后，用SSS对胶原纤维计分并与图像分析测得的SDTC比较，二者呈显著相关。本研究对86例血吸虫病肝纤维化患者的肝组织标本做胶原纤维染色，按照SSS系统对肝组织标本的纤维化计分，与图像分析测得的全胶原表面密度(SDTC)进行比较，结果表明二者呈显著性相关(r=0.82,P<0.001)。SSS将纤维化沉积部位与半定量计分结合起来，因此能较准确地反映肝纤维化程度，是目前半定量计分系统中较实用的一种。但由于为半定量方法，易受主观因素的影响，其准确度受到限制。
比色法基本原理是：天狼猩红和亮绿能分别有选择地与肝组织标本中的胶原蛋白及非胶原蛋白成份特异地结合，与组织成份结合的这两种染料又能在0.1N NaOH甲醇液溶中同时脱色。Junqueira[6]等证实与胶原纤维结合的天狼猩红的OD值可以反映胶原纤维的量。Leon[2]等证实比色法与羟脯氨酸分析法及微量克氏定氮法分别测定肝、肾、肺等组织胶原蛋白及总蛋白的含量，两种方法测得的胶原含量结果一致。Jimenez[7]等对38例不同肝病的肝穿标本用上述方法染色后，测定胶原百分含量，与图像测得的SDTC比较，两者呈显著性相关。本研究对86例血吸虫病肝纤维化标本进行检测，取得了相似的结果。说明比色法适用于血吸虫肝病变的胶原纤维定量测定，且易操作，特异性强，敏感性高，同一标本可以重复操作，洗脱后的标本也可用于其他化学方法的测定，是肝纤维化定量检测的较好方法。
, 百拇医药
参考文献
1，Chevallier M,Guerret S,Chossegros P,et al.A histological semi quantitative scoring system for evaluation of hepatic fibrosis in needle liver biopsy specimens:comparison with morphometric studies Hepatology,1994;20(2):349～355
2，Leon AL,Rojkind M.A simple micromethod for colagen and total protein determiantion in formlin-fixed paraffin-embeded sections.J Histochem Cytochem,1985;33(8):737～743
, http://www.100md.com
3，严家春，王洪培，刘健虎.慢性乙型肝穿组织学随访观察.临床与实验病理学杂志，1990；6(3)：178～180
4，刘约翰，赵慰先主编.寄生虫临床免疫学.第9版.重庆：重庆出版社，1993：205～226
5，Rubio CA,Poruitt A.Quantitiation of fibrosis in liver biopsies.Anal Quant Cytol Histol,1998;10:107～109
6，Junqueira LCU,Bignolas G,Brentani RR.A simple and sensitive method for the quantitative estimation of collagen.Anal Biochem,1979;94:96～99
7，Jimenez W,Pares A,Ceballeria J,et al.Measuremant of fibrosis in needle liver biopsies:evaluation of a colorimetric method.Hepatology,1985;5:815～821
(1999-12-12收稿), http://www.100md.com
单位：于忠省(湖北医科大学附二院 武汉 430071；现在山东滨州地区人民医院 256610)；桂希恩 陈德基 骆名其(湖北医科大学附二院 武汉 430071)
关键词：血吸虫病；肝纤维化；定量检测；方法
中国现代医学杂志001011 目的：探索可靠反映血吸虫病肝纤维化的定量方法。方法：将86例晚期血吸虫病患者的肝组织标本，分别做HE、胶原纤维及弹力纤维染色。光镜下对胶原纤维进行半定量计分；用计算机图像分析系统测定全胶原表面密度(SDTC)及全弹力表面密度(SDTE)；用比色法测定肝组织中的胶原含量。结果：肝组织中SDTC与SDTE呈正相关(r=0.76,P<0.001)；SDTC与比色法测得胶原含量呈显著性相关(r=0.78,P<0.001)。以SDTC为标准分组，比较SSS计分及比色法测定的胶原含量，结果组间差异均有显著性(P<0.01)；SDTC与SSS及其各变量的多元逐步回归分析表明对SDTC起主要影响的因素是SSS。结论：计分法、图像分析法及比色法均可用于血吸虫病肝纤维化的定量分析。比色法由于间便易操作，特异性强，重度性好，认为是肝纤维化定量检测的较好方法。
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分类号 R532.2
A COMPARISON OF THE QUANTITATIVE METHODS OF HEPATIC
FIBROSIS IN PATIENTS WITH SCHISTOSOMIASIS
Yu Zhongsheng
(The People's Hospital of Binzhou, Binzhou 256610)
Gui Xi'en，Chen Deji，Luo Mingqi
(The Second Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071)
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[Abstract] Objective: To study reliable methods for the quantitative evaluation of hepatic fibrosis of patients with advanced schistosomiasis (AS). Methods: Liver specimens from 86 patients with AS were stained for HE, collagen and elastin fiber respectively. The histological semi-quantitative scorning system (SSS) was used to the estimation of hepatic fibrosis; the surface densities of total collagen (SDTC) and total elastin (SDTE) were measured by a computerized imagine analysis system; collagen concentration in liver tissue sections were determined by colorimetric method. Results: SDTC and SDTE were significantly related (r=0.76, P<0.001). The result of multiple regression analysis showed that SSS was selected as the best predictor of SDTC. The significant difference was found between groups of SDTC, SSS and collagen content. The collagen content and the SDTC were significantly liner related (r=0.79, P<0.001). Conclusions: The SSS, imaging analysis and colorimetric method can all be used in the quantitative analysis of hepatic fibrosis. The colorimetric method is a simple, sensitive, specific and reproducible method. Hence, it is an ideal quantitative method for the measurement of collagen at present.
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Key words: Schistosomiasis; Hepatic Fibrosis; Semi-quantitative Scorning System
肝纤维化的定量检测对判断纤维化血清标志物的可靠性，对估计病情和预后有重要意义，同时也可为筛选和评价抗纤维化药物的疗效提供依据。目前用于肝纤维定量检测的方法有计算机图像分析法、半定量计分法(SSS)及胶原比色测定法。上述方法已用于肝炎及酒精性肝病纤维化的定量检测，尚未见用于血吸虫病患者的报道。本文对86例晚期血吸虫病患者的肝组织作HE和胶原及弹力纤维染色，以上述三种方法测定肝纤维含量，并对其结果作比较分析。
1 材料与方法
1.1 肝组织来源及其处理
86例临床及病理诊断为巨脾型晚期血吸虫病患者的肝组织标本，脾切除手术时取材，标本以10%福尔马林固定，石蜡包埋连续切片，切片厚约3μm，分别作HE、胶原纤维及弹力纤维染色，每例标本同时切一厚约15μm的切片，放于小试管中，留待比色法测定用。
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1.2 实验方法
胶原纤维用VG氏苦味酸品红染色法染成鲜红色，弹力纤维用Weigert氏法染成蓝黑色。
半定量计分参照Chevallier等[1]的方法评估中央静脉壁(CLV)、窦边间隙(PS)、汇管区(PT)纤维含量及纤维隔数目(NS)与宽度(WS)，总分SSS=CLV+PS+PT+2(NS×WS)。
用IBAS-200型图像分析仪测定全胶原表面密度(SDTC)及全弹力表面密度(SDTE)，分别用其占分析的表面面积的百分比表示，在计算机图像分析系统自动进行。
比色法参照Leon等[2]描述的方法进行。
1.3 统计学处理
直线相关和直线回归分析，方差分析及多元逐步回归分析，用SPSS软件包完成。
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2 结果
2.1 一般观察
86例肝组织标本HE染色观察，均有血吸虫虫卵沉积，伴有不同程度的肝纤维化，呈典型的干线型特征。弹力纤维及胶原纤维染色可见两者均明显增生，增生部分基本一致，主要位于汇管区和纤维隔。中央静脉壁(CLV)及窦边间隙(PS)内均有不同程度的胶原纤维增生，PS增生常位于CLV周围[1～7]。
2.2 血吸虫病肝纤维化SDTC与SDTE的关系
特殊组织染色使胶原纤维与弹力纤维分别呈鲜红色和蓝黑色，与切片其他成分对比清楚，使计算机系统能准确识别，自动测量其表面面积和全部切片面积并计算出各自的面积百分比(见附图)。测得的全胶原表面密度SDTC均值为11.0±6.31与全弹力表面密度(SDTE)用直线相关分析发现两者呈正相关(r=0.76,P<0.001)。
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2.3 以图像分析法测定结果为标准，按<4%，≥4%及≥8%分为三组，并与SSS计分及比色法测定胶原含量比较表1 图像分析、SSS及比色法对血吸虫病肝纤维化的定量检测结果 (
±s) 分组例数
SDTC(%)
SSS(计分)
比色法(OD值)
A
33
1.99±1.07
4.76±1.39
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0.19±0.10
B
30
5.86±0.93
10.83±2.35
0.44±0.10
C
23
11.05±3.10
16.35±2.19
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A∶B
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P<0.01
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B∶C
P<0.01
P<0.01
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C∶A
P<0.01
P<0.01
P<0.01
2.4 SSS与图像分析测得的SDTC的相关性
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图像分析测得的SDTC与计分测得的PS、PT、NS及WS呈正相关。多元逐步回归分析结果见表2。在显著性水准a=0.01及多变量共存的条件下，对SDTC起主要影响因素的是各变量之总合〔SSS=CLV+PS+PT+2(NS×WS)〕。表2 影响SDTC的逐步回归结果 变量
回归系数
回归系数标准误
标准回归系数
t
P
SSS
0.5675
0.0672
0.7141
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8.448
0.000
截距
-1.0717
0.4005
-2.676
0.009
2.5 比色法与图像分析比较
将比色法测得的胶原含量与图像分析测得的SDTC进行比较，两者呈显著性相关(r=0.79,P<0.001)，见附图。
附图 直线相关分析比较比色法测得的胶原含量(OD)与图像分析测得的SDTC，两者呈显著性相关(r=0.79,P<0.001)
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3 讨论
血吸虫病肝纤维化导致门脉高压，患者的临床表现及预后与肝纤维化的程度有关。准确的定量对于判断病情和估计预后有重要意义，同时也将为筛选和评价抗肝纤维化药物的疗效提供依据。
肝纤维的主要成分是胶原纤维，但也有部分属于弹力纤维及网状纤维。严家春[3]等对慢性乙肝肝组织学的观察发现，胶原纤维增生约需用1～3个月，弹力纤维的出现约需5～6个月。血吸虫病肝纤维化是主动性纤维化，发病早期即有大量的胶原纤维合成[4]。本研究比较晚期血吸虫病肝组织胶原纤维与弹力纤维的含量，结果发现两者均增加且呈正比。提示晚期血吸虫病患者病程较长，多种纤维增生，可能给肝组织病变的逆转及抗纤维化的治疗带来困难。
形态学计量(Morphometry)指应用图像测试技术对生物组织的形态及结果进行定量分析。图像分析被认为是形态学计量的金标准，且批内分析差异很小[5]。但由于仪器比较昂贵，检测费用较高，且需要训练有素的计算机操作者，使其应用受到一定的限制。
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1994年Chevallier[1]等对200例各种原因的慢性肝病患者的肝组织标本行胶原纤维染色后，用SSS对胶原纤维计分并与图像分析测得的SDTC比较，二者呈显著相关。本研究对86例血吸虫病肝纤维化患者的肝组织标本做胶原纤维染色，按照SSS系统对肝组织标本的纤维化计分，与图像分析测得的全胶原表面密度(SDTC)进行比较，结果表明二者呈显著性相关(r=0.82,P<0.001)。SSS将纤维化沉积部位与半定量计分结合起来，因此能较准确地反映肝纤维化程度，是目前半定量计分系统中较实用的一种。但由于为半定量方法，易受主观因素的影响，其准确度受到限制。
比色法基本原理是：天狼猩红和亮绿能分别有选择地与肝组织标本中的胶原蛋白及非胶原蛋白成份特异地结合，与组织成份结合的这两种染料又能在0.1N NaOH甲醇液溶中同时脱色。Junqueira[6]等证实与胶原纤维结合的天狼猩红的OD值可以反映胶原纤维的量。Leon[2]等证实比色法与羟脯氨酸分析法及微量克氏定氮法分别测定肝、肾、肺等组织胶原蛋白及总蛋白的含量，两种方法测得的胶原含量结果一致。Jimenez[7]等对38例不同肝病的肝穿标本用上述方法染色后，测定胶原百分含量，与图像测得的SDTC比较，两者呈显著性相关。本研究对86例血吸虫病肝纤维化标本进行检测，取得了相似的结果。说明比色法适用于血吸虫肝病变的胶原纤维定量测定，且易操作，特异性强，敏感性高，同一标本可以重复操作，洗脱后的标本也可用于其他化学方法的测定，是肝纤维化定量检测的较好方法。
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参考文献
1，Chevallier M,Guerret S,Chossegros P,et al.A histological semi quantitative scoring system for evaluation of hepatic fibrosis in needle liver biopsy specimens:comparison with morphometric studies Hepatology,1994;20(2):349～355
2，Leon AL,Rojkind M.A simple micromethod for colagen and total protein determiantion in formlin-fixed paraffin-embeded sections.J Histochem Cytochem,1985;33(8):737～743
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3，严家春，王洪培，刘健虎.慢性乙型肝穿组织学随访观察.临床与实验病理学杂志，1990；6(3)：178～180
4，刘约翰，赵慰先主编.寄生虫临床免疫学.第9版.重庆：重庆出版社，1993：205～226
5，Rubio CA,Poruitt A.Quantitiation of fibrosis in liver biopsies.Anal Quant Cytol Histol,1998;10:107～109
6，Junqueira LCU,Bignolas G,Brentani RR.A simple and sensitive method for the quantitative estimation of collagen.Anal Biochem,1979;94:96～99
7，Jimenez W,Pares A,Ceballeria J,et al.Measuremant of fibrosis in needle liver biopsies:evaluation of a colorimetric method.Hepatology,1985;5:815～821
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