血管内皮生长因子及其受体在食管癌中的表达和临床意义
作者：王海东 王明荣 景涛 杨康 杨军民
单位：第三军医大学附属西南医院胸心血管外科 重庆 400038
关键词：食管癌；血管生成；临床意义
中国现代医学杂志001007 为探讨食管癌血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(Flt、KDR)、血管生成与食管癌临床病理特点的关系，采用免疫组织化学技术，检测了50例人食管癌组织VEGF、Flt、KDR蛋白表达和微血管密度(MVD)。分析VEGF、Flt、KDR和MVD及其与食管癌组织学分型、浸润深度、生长方式、淋巴结转移和预后的关系。结果显示：VEGF及Flt、KDR阳性者MVD值显著高于阴性者，VEGF、Flt、KDR及MVD与食管癌浸润深度、淋巴结转移密切相关，并最终决定患者的预后。而与组织学分型、生长方式无关。因此认为：VEGF、Flt、KDR与食管癌的血管生成密切相关，对其生长和浸润转移起促进作用，VEGF、Flt、KDR可以作为反映食管癌生物学行为的指标之一。
, http://www.100md.com
分类号 R735.1
THE CLINICAL SIGNIFICANCE AND EXPRESSION OF
VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR AND
IT'S RECEPTOR IN ESOPHAGEAL CARCINOMA
Wang Haidong，Wang Mingrong，Jing Tao，Yang Kang，Yang Junmin
(The Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery, Southwest Hospital,the Third Militry Medical University, Chongqing 400038)
, 百拇医药
Abstract: To investigate the clinical significance and expression of vascular endothelial growth factor and it's receptor in esophageal carcinoma. Angiogenesis was assessed by the microvessel density (MVD), and protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), fms-like tyrosine kinase (Flt), kinase insert domain-containing receptor (KDR) using immunohistochemical staining. Paraffin-embedded specimens from 50 patients with esophageal cancer who undergone mastectomy from 1994 to 1995 were studied. VEGF, Flt KDP and MVD expression were analyzed together with their relation to histological type, depth of invasion, growth pattern, lymph node metastasis and distant metastasis. The results show MVD was significantly higher in esophageal carcinoma VEGF, Flt, KDP-positive than in negative group (P<0.01). The protein expression of VEGF, Flt, KDR, MVD positively correlated with depth of invasion (P<0.05), lymph node metastasis (P<0.01), and prognosis. But their relation to the histological types and growth pattern of esophageal carcinoma was not significant. So we concluded that VEGF, Flt, KDR and MVD is highly related to angiogenesis and promotes growth, invasion and metastasis of esophageal carcinoma. The expression of VEGF, Flt, KDR and MVD is one of the predictors for the biological behavior of esophageal carcinoma.
, 百拇医药
Key words: Esophageal Carcinoma; Angiogenesis; Clinical Significance
我们采用免疫组织化学技术，检测了人食管癌组织血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(Flt、KDR)蛋白和微血管密度(MVD)的表达，分析VEGF、Flt、KDR和MVD的关系，及其与临床指标之间的关系，从而揭示VEGF、Flt、KDR在食管癌发生发展中的意义。
1 临床资料与方法
1.1 病例与标本
收集1994～1995年期间在我科住院治疗的食管癌患者行食管癌切除术的组织标本50例，冻存于液氮中。常规石蜡包埋切片，切片厚5μm。所有病人术前均未进行放疗和化疗。全组平均年龄56岁(35～78岁)，肿瘤平均直径3.5cm(1～6.7cm)。病理学检查证实为食管癌。并按公认的中晚期食管癌分类法分为：髓质型、蕈伞型、溃疡型、缩窄型、腔内型；癌细胞浸润分为：至粘膜层(M)、粘膜下层(Sm)、固有肌层(Pm)、穿透浆膜层(Se)和穿透浆膜层合并侵袭邻近脏器(Sei)；按Sing法分为膨胀型和浸润型。另取5例正常食管组织作对照。
, 百拇医药
1.2 主要试剂
兔抗人VEGF多抗(Zymed公司)，兔抗人第八因子相关抗原(SANTA CRUZ公司)，兔抗人KDR多抗(SANTA CRUZ公司)，兔抗人Flt多抗(SANTA CRUZ公司)，SABC试剂盒(武汉博士德公司)，DAB染色试剂盒(武汉博士德公司)。
1.3 方法
按SABC试剂盒标准免疫组织化学方法，其中VEGF行石蜡切片抗原微波修复，其余石蜡切片行原酶消化，DAB显色；用已知阳性表达的肺癌切片作为阳性对照组；以0.01mmol PBS代替一抗作阴性对照；一抗工作浓度1∶75。
1.3.1 血管计数和分级 参照蒋晓山[1]等人的方法。任何被第八因子相关抗原染成棕褐色的内皮细胞或内皮细胞团，必须与邻近的微血管、肿瘤细胞以及周围结缔组织成分分界清楚才作为一个微血管计数。光镜下先以放大40或100倍视野选择3个微血管染色最丰富区，然后在200倍视野(物镜20×，目镜10×；0.74mm2/视野)下计数每一热点区中一个视野内的微血管数，取最高值列入分析。
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1.3.2 VEGF、Flt、KDR计数与分级 胞浆中含有棕褐色颗粒的肿瘤细胞或血管内皮细胞被计为阳性细胞，每张切片选三个区在400倍视野下连续计数100个细胞。以组织中阳性细胞比值，将其分为3级：Ⅰ级阳性细胞数0～60%；Ⅱ级阳性细胞数61%～80%；Ⅲ级阳性细胞数>80%。
1.3.3 统计学分析 VEGF、Flt、KDR蛋白表达、MVD计数与各临床病理指标间的关系分别用方差分析、χ2检验、Fisher精确检验进行分析，以P<0.05为显著性差异，P<0.01为非常显著性差异。
2 结果
2.1 VEGF蛋白表达
50例食管癌中有28例VEGF蛋白表达阳性，比例为56%。其表达有明显的异质性，强阳性表达的癌细胞较多位于浸润前缘，个别病例也有少量血管内皮细胞表达，而在正常食管组织未见VEGF阳性表达。
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2.2 Flt、KDR蛋白表达
在所有病例中Flt、KDR蛋白均有表达的有48例，比例为96%。本实验中Flt、KDR蛋白表达主要位于胞浆，少数位于胞膜。Flt、KDR蛋白表达也有明显的异质性，表达部位多位于浸润前缘。在分化程度越低的病例中表达越强。
2.3 MVD计数
食管癌中所有毛细血管、静脉、动脉血管内皮细胞均有第八因子相关抗原表达，而且也有明显的异质性，强阳性表达的内皮细胞多位于浸润前缘，该处微血管较肿瘤中心部位密集。
2.4 VEGF、Flt、KDR蛋白表达与临床病理特点的关系
VEGF、Flt、KDR蛋白表达与肿瘤分化程度高低有密切关系，在分化程度越低的病例中表达越强。提示VEGF、Flt、KDR蛋白表达的高低可能与预后有关。我们还发现这三种蛋白表达的高低与肿瘤细胞浸润的深度有关，在浸润至邻近脏器的病例，VEGF、Flt、KDR蛋白表达明显较浸润至粘膜和粘膜下层的病例高。在膨胀型生长的肿瘤组织中，VEGF、Flt、KDR蛋白表达明显较浸润型生长组织低。而在有淋巴结转移的病例中，VEGF、Flt、KDR蛋白表达明显高于无淋巴结转移的病例(见附表)。
, 百拇医药
附表 VEGF、Flt、KDR蛋白表达和MVD与食管癌临床病理特点的关系 例(%) 指标
例数
VEGF
Flt
KDR
MVD
阳性
P
阳性
P
阳性
P
±s
, http://www.100md.com
P
组织学类型
<0.05
<0.05
<0.01
<0.05
高分化
19
8(42.1)
8(42.1)
9(47.4)
39.3±10.2
低分化
, http://www.100md.com
31
20(64.5)
22(70.9)
19(51.6)
44.2±9.8
浸润深度
<0.01
<0.01
<0.05
<0.01
M、sm
6
2(33.3)
, 百拇医药
2(33.3)
3(50.0)
27.1±1.9
Pm、SS
17
9(52.9)
11(64.7)
10(58.8)
36.4±4.7
Se、Sei
27
21(77.8)
, 百拇医药
19(70.4)
22(81.5)
47.5±7.9
生长方式
<0.01
<0.01
<0.05
<0.05
膨胀型
12
4(33.3)
3(25)
4(33.3)
, 百拇医药
29.8±4.3
浸润型
38
29(76.3)
31(81.6)
27(71.1)
43.8±4.5
淋巴结转移
<0.01
<0.05
<0.01
<0.05
, http://www.100md.com 有
14
12(85.7)
10(71.4)
12(85.7)
51.2±8.4
无
36
13(36.1)
11(30.5)
12(33.3)
27.9±4.1
3 讨论
, 百拇医药
研究表明，VEGF是由各种肿瘤细胞及某些正常细胞产生，通过旁分泌方式特异地作用于表达VEGF的血管内皮细胞，使血管内皮细胞分裂增殖、新生血管形成，并使血管通透性增高，从而促进肿瘤的生长转移[2]。本研究中发现的VEGF和Flt、KDR在肿瘤组织中的表达都有明显的异质性，强阳性表达的细胞多位于肿瘤浸润前缘，说明VEGF和其受体作用部位一致，互相协调作用。另外，食管癌组织VEGF阳性表达者平均MVD值明显高于阴性者，而且肿瘤浸润前缘VEGF蛋白表达较其它部位明显高，微血管密度也较高，说明VEGF蛋白表达与血管生成部位一致。Meada[3]等在胃癌研究中也有类似的结果。
丰富的血管不仅增加了肿瘤细胞进入循环中的机率，而且还可以侵入邻近与毛细血管伴行的淋巴管，或通过淋巴静脉连接进入淋巴管，从而促进淋巴转移[4]。本实验中我们发现，在VEGF、KDR、Flt、第八因子相关抗原表达强阳性的病例，几乎均低分化、浸润生长、伴有淋巴结转移，而在一般阳性的病例中，有些未发现癌细胞明显外侵和淋巴结转移，可能是由于这些病例还处于浸润和转移前期的缘故。这一点与Toi等[5]对乳腺癌的研究结果相近似。因此VEGF、KDR、Flt、第八因子相关抗原表达强阳性可能提示预后不佳。
, 百拇医药
采用抗VEGF抗体或调控VEGF的受体KDR能明显抑制实验性肿瘤的生长和转移[6]，这为临床恶性肿瘤病人的治疗措施提供了一些理论依据。我们的研究发现，56%以上的食管癌患者VEGF及其受体有阳性表达，而且这类病人的转移率高、预后较差。因此，通过检测食管癌患者VEGF及其受体表达并对阳性者进行抗VEGF治疗，对于防止术后转移和复发，提高术后总体生存率可能有一定作用。
参考文献
1，蒋晓山，黄信孚.乳腺癌血管生成与淋巴结转移的关系.中华外科杂志，1997；35(10)：583
2，Senger DR,Van de Water L,Browm LF,et al.Vascular permeability factor in tumor biology.Cancer Metastasis Rew,1993;12:303
, 百拇医药
3，Shimoda N,Togashi H,Terada K,et al.Expression of vascular endothelial growth factor gene and its receptor(flt-1) gene in urinary bladder cancer.Tohoku J Exp Med,1998;185(3):173～184
4，Kraft A,Weindel K,Ohs A,et al.Vascular endothlial growth factor in the sera and effuions of patients with malignant and nonmalignant disease.Cancer,1999;85(3):178～187
5，Toi M,Inada K,Hoshina S,et al.ascular endothelial growth factor and platelet-derived endothelial cell growth factor are frequently coexpressed in highly vascularized human breast cancer.Clin Cancer Res,1995;1(9):961～964
6，Melnyk O,Shuman MA,Kim KJ,et al.Vascular endothelial growth factor promotes tumor dissemination by a machanism distinct from its effect on primary tumor growth.Cancer Res,1996;56:921
(2000-02-18收稿), 百拇医药
单位：第三军医大学附属西南医院胸心血管外科 重庆 400038
关键词：食管癌；血管生成；临床意义
中国现代医学杂志001007 为探讨食管癌血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(Flt、KDR)、血管生成与食管癌临床病理特点的关系，采用免疫组织化学技术，检测了50例人食管癌组织VEGF、Flt、KDR蛋白表达和微血管密度(MVD)。分析VEGF、Flt、KDR和MVD及其与食管癌组织学分型、浸润深度、生长方式、淋巴结转移和预后的关系。结果显示：VEGF及Flt、KDR阳性者MVD值显著高于阴性者，VEGF、Flt、KDR及MVD与食管癌浸润深度、淋巴结转移密切相关，并最终决定患者的预后。而与组织学分型、生长方式无关。因此认为：VEGF、Flt、KDR与食管癌的血管生成密切相关，对其生长和浸润转移起促进作用，VEGF、Flt、KDR可以作为反映食管癌生物学行为的指标之一。
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分类号 R735.1
THE CLINICAL SIGNIFICANCE AND EXPRESSION OF
VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR AND
IT'S RECEPTOR IN ESOPHAGEAL CARCINOMA
Wang Haidong，Wang Mingrong，Jing Tao，Yang Kang，Yang Junmin
(The Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery, Southwest Hospital,the Third Militry Medical University, Chongqing 400038)
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Abstract: To investigate the clinical significance and expression of vascular endothelial growth factor and it's receptor in esophageal carcinoma. Angiogenesis was assessed by the microvessel density (MVD), and protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), fms-like tyrosine kinase (Flt), kinase insert domain-containing receptor (KDR) using immunohistochemical staining. Paraffin-embedded specimens from 50 patients with esophageal cancer who undergone mastectomy from 1994 to 1995 were studied. VEGF, Flt KDP and MVD expression were analyzed together with their relation to histological type, depth of invasion, growth pattern, lymph node metastasis and distant metastasis. The results show MVD was significantly higher in esophageal carcinoma VEGF, Flt, KDP-positive than in negative group (P<0.01). The protein expression of VEGF, Flt, KDR, MVD positively correlated with depth of invasion (P<0.05), lymph node metastasis (P<0.01), and prognosis. But their relation to the histological types and growth pattern of esophageal carcinoma was not significant. So we concluded that VEGF, Flt, KDR and MVD is highly related to angiogenesis and promotes growth, invasion and metastasis of esophageal carcinoma. The expression of VEGF, Flt, KDR and MVD is one of the predictors for the biological behavior of esophageal carcinoma.
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Key words: Esophageal Carcinoma; Angiogenesis; Clinical Significance
我们采用免疫组织化学技术，检测了人食管癌组织血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(Flt、KDR)蛋白和微血管密度(MVD)的表达，分析VEGF、Flt、KDR和MVD的关系，及其与临床指标之间的关系，从而揭示VEGF、Flt、KDR在食管癌发生发展中的意义。
1 临床资料与方法
1.1 病例与标本
收集1994～1995年期间在我科住院治疗的食管癌患者行食管癌切除术的组织标本50例，冻存于液氮中。常规石蜡包埋切片，切片厚5μm。所有病人术前均未进行放疗和化疗。全组平均年龄56岁(35～78岁)，肿瘤平均直径3.5cm(1～6.7cm)。病理学检查证实为食管癌。并按公认的中晚期食管癌分类法分为：髓质型、蕈伞型、溃疡型、缩窄型、腔内型；癌细胞浸润分为：至粘膜层(M)、粘膜下层(Sm)、固有肌层(Pm)、穿透浆膜层(Se)和穿透浆膜层合并侵袭邻近脏器(Sei)；按Sing法分为膨胀型和浸润型。另取5例正常食管组织作对照。
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1.2 主要试剂
兔抗人VEGF多抗(Zymed公司)，兔抗人第八因子相关抗原(SANTA CRUZ公司)，兔抗人KDR多抗(SANTA CRUZ公司)，兔抗人Flt多抗(SANTA CRUZ公司)，SABC试剂盒(武汉博士德公司)，DAB染色试剂盒(武汉博士德公司)。
1.3 方法
按SABC试剂盒标准免疫组织化学方法，其中VEGF行石蜡切片抗原微波修复，其余石蜡切片行原酶消化，DAB显色；用已知阳性表达的肺癌切片作为阳性对照组；以0.01mmol PBS代替一抗作阴性对照；一抗工作浓度1∶75。
1.3.1 血管计数和分级 参照蒋晓山[1]等人的方法。任何被第八因子相关抗原染成棕褐色的内皮细胞或内皮细胞团，必须与邻近的微血管、肿瘤细胞以及周围结缔组织成分分界清楚才作为一个微血管计数。光镜下先以放大40或100倍视野选择3个微血管染色最丰富区，然后在200倍视野(物镜20×，目镜10×；0.74mm2/视野)下计数每一热点区中一个视野内的微血管数，取最高值列入分析。
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1.3.2 VEGF、Flt、KDR计数与分级 胞浆中含有棕褐色颗粒的肿瘤细胞或血管内皮细胞被计为阳性细胞，每张切片选三个区在400倍视野下连续计数100个细胞。以组织中阳性细胞比值，将其分为3级：Ⅰ级阳性细胞数0～60%；Ⅱ级阳性细胞数61%～80%；Ⅲ级阳性细胞数>80%。
1.3.3 统计学分析 VEGF、Flt、KDR蛋白表达、MVD计数与各临床病理指标间的关系分别用方差分析、χ2检验、Fisher精确检验进行分析，以P<0.05为显著性差异，P<0.01为非常显著性差异。
2 结果
2.1 VEGF蛋白表达
50例食管癌中有28例VEGF蛋白表达阳性，比例为56%。其表达有明显的异质性，强阳性表达的癌细胞较多位于浸润前缘，个别病例也有少量血管内皮细胞表达，而在正常食管组织未见VEGF阳性表达。
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2.2 Flt、KDR蛋白表达
在所有病例中Flt、KDR蛋白均有表达的有48例，比例为96%。本实验中Flt、KDR蛋白表达主要位于胞浆，少数位于胞膜。Flt、KDR蛋白表达也有明显的异质性，表达部位多位于浸润前缘。在分化程度越低的病例中表达越强。
2.3 MVD计数
食管癌中所有毛细血管、静脉、动脉血管内皮细胞均有第八因子相关抗原表达，而且也有明显的异质性，强阳性表达的内皮细胞多位于浸润前缘，该处微血管较肿瘤中心部位密集。
2.4 VEGF、Flt、KDR蛋白表达与临床病理特点的关系
VEGF、Flt、KDR蛋白表达与肿瘤分化程度高低有密切关系，在分化程度越低的病例中表达越强。提示VEGF、Flt、KDR蛋白表达的高低可能与预后有关。我们还发现这三种蛋白表达的高低与肿瘤细胞浸润的深度有关，在浸润至邻近脏器的病例，VEGF、Flt、KDR蛋白表达明显较浸润至粘膜和粘膜下层的病例高。在膨胀型生长的肿瘤组织中，VEGF、Flt、KDR蛋白表达明显较浸润型生长组织低。而在有淋巴结转移的病例中，VEGF、Flt、KDR蛋白表达明显高于无淋巴结转移的病例(见附表)。
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附表 VEGF、Flt、KDR蛋白表达和MVD与食管癌临床病理特点的关系 例(%) 指标
例数
VEGF
Flt
KDR
MVD
阳性
P
阳性
P
阳性
P
±s, http://www.100md.com
P
组织学类型
<0.05
<0.05
<0.01
<0.05
高分化
19
8(42.1)
8(42.1)
9(47.4)
39.3±10.2
低分化
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31
20(64.5)
22(70.9)
19(51.6)
44.2±9.8
浸润深度
<0.01
<0.01
<0.05
<0.01
M、sm
6
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3(50.0)
27.1±1.9
Pm、SS
17
9(52.9)
11(64.7)
10(58.8)
36.4±4.7
Se、Sei
27
21(77.8)
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19(70.4)
22(81.5)
47.5±7.9
生长方式
<0.01
<0.01
<0.05
<0.05
膨胀型
12
4(33.3)
3(25)
4(33.3)
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29.8±4.3
浸润型
38
29(76.3)
31(81.6)
27(71.1)
43.8±4.5
淋巴结转移
<0.01
<0.05
<0.01
<0.05
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14
12(85.7)
10(71.4)
12(85.7)
51.2±8.4
无
36
13(36.1)
11(30.5)
12(33.3)
27.9±4.1
3 讨论
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研究表明，VEGF是由各种肿瘤细胞及某些正常细胞产生，通过旁分泌方式特异地作用于表达VEGF的血管内皮细胞，使血管内皮细胞分裂增殖、新生血管形成，并使血管通透性增高，从而促进肿瘤的生长转移[2]。本研究中发现的VEGF和Flt、KDR在肿瘤组织中的表达都有明显的异质性，强阳性表达的细胞多位于肿瘤浸润前缘，说明VEGF和其受体作用部位一致，互相协调作用。另外，食管癌组织VEGF阳性表达者平均MVD值明显高于阴性者，而且肿瘤浸润前缘VEGF蛋白表达较其它部位明显高，微血管密度也较高，说明VEGF蛋白表达与血管生成部位一致。Meada[3]等在胃癌研究中也有类似的结果。
丰富的血管不仅增加了肿瘤细胞进入循环中的机率，而且还可以侵入邻近与毛细血管伴行的淋巴管，或通过淋巴静脉连接进入淋巴管，从而促进淋巴转移[4]。本实验中我们发现，在VEGF、KDR、Flt、第八因子相关抗原表达强阳性的病例，几乎均低分化、浸润生长、伴有淋巴结转移，而在一般阳性的病例中，有些未发现癌细胞明显外侵和淋巴结转移，可能是由于这些病例还处于浸润和转移前期的缘故。这一点与Toi等[5]对乳腺癌的研究结果相近似。因此VEGF、KDR、Flt、第八因子相关抗原表达强阳性可能提示预后不佳。
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采用抗VEGF抗体或调控VEGF的受体KDR能明显抑制实验性肿瘤的生长和转移[6]，这为临床恶性肿瘤病人的治疗措施提供了一些理论依据。我们的研究发现，56%以上的食管癌患者VEGF及其受体有阳性表达，而且这类病人的转移率高、预后较差。因此，通过检测食管癌患者VEGF及其受体表达并对阳性者进行抗VEGF治疗，对于防止术后转移和复发，提高术后总体生存率可能有一定作用。
参考文献
1，蒋晓山，黄信孚.乳腺癌血管生成与淋巴结转移的关系.中华外科杂志，1997；35(10)：583
2，Senger DR,Van de Water L,Browm LF,et al.Vascular permeability factor in tumor biology.Cancer Metastasis Rew,1993;12:303
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3，Shimoda N,Togashi H,Terada K,et al.Expression of vascular endothelial growth factor gene and its receptor(flt-1) gene in urinary bladder cancer.Tohoku J Exp Med,1998;185(3):173～184
4，Kraft A,Weindel K,Ohs A,et al.Vascular endothlial growth factor in the sera and effuions of patients with malignant and nonmalignant disease.Cancer,1999;85(3):178～187
5，Toi M,Inada K,Hoshina S,et al.ascular endothelial growth factor and platelet-derived endothelial cell growth factor are frequently coexpressed in highly vascularized human breast cancer.Clin Cancer Res,1995;1(9):961～964
6，Melnyk O,Shuman MA,Kim KJ,et al.Vascular endothelial growth factor promotes tumor dissemination by a machanism distinct from its effect on primary tumor growth.Cancer Res,1996;56:921
(2000-02-18收稿), 百拇医药