醒神丸对老年性痴呆动物模型脑内自由基清除力的影响
作者：周亚滨 杨华升 肖洪彬
单位：(黑龙江中医药大学 哈尔滨 150040)
关键词：醒神丸；老年性痴呆；SAM-P/8小鼠；氧自由基
浙江中西医结合杂志001008 摘要 目的：观察醒神丸的补肾活血、豁痰开窍作用及对老年性痴呆动物模型的脑内自由基清除能力的影响。方法：通过对老年性痴呆(Alzheimer′s disease,AD)动物模型(SAM-P/8小鼠)脑组织匀浆中SOD、MDA含量进行测定，观察醒神丸的脑内自由基消除能力。结果：该药能明显提高老年性痴呆动物模型(SAM-P/8小鼠)脑组织的SOD含量，降低MDA活性。结论：提示该药能通过提高SOD含量，降低MDA活性，防治老年性痴呆。
1 材料与方法
1.1 实验材料 实验动物为日本快速老化痴呆小白鼠SAM-P/8，7月龄，体重25～30g，雄性，由天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供。7月龄雄性昆明种小鼠，体重30～35g；2月龄雄性昆明种小鼠，体重25～30g；由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。醒神丸，由黄芪、赤芍、川芎、当归、丹参、熟地、山萸肉、石菖蒲、胆南星、牛膝、甘草等20味中药组成。将药物提取加工成粉末，每克粉末含生药2.25克。由黑龙江中医药大学第一附属医院制剂室提供。脑复康片，东北制药总厂生产，批号：9810103。主要试剂：SOD测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。MDA测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。主要仪器：恒温水浴箱，低温高速离心机，722型光栅分光光度计。
, http://www.100md.com
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组 将7月龄SAM-P/8小鼠24只随机分为醒神丸组、脑复康组、模型组，每组各8只。随机选取7月龄雄性昆明种小鼠8只作为普通老年组；随机选取2月龄雄性昆明种小鼠8只作为青年对照组。
1.2.2 给药方法 将中药粉末加蒸馏水配制成混悬液，浓度为8.89%，按2.67g/kg体重灌胃。脑复康按2%浓度将脑复康片加蒸馏水配成混悬液，按0.4g/kg体重灌胃。普通老年组及青年对照组灌等容量蒸馏水。各组每日灌药1次，连续灌药30天。
1.2.3 病理形态学检查 实验期满，断头取脑生理盐水冲洗，沿矢状缝切开，左半球称重后加9倍生理盐水制备匀浆，右半球用10%甲醛固定，石腊包埋，HE染色，光镜下观察病理形态学变化。
1.2.4 SOD测定方法 原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O-2)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度[1]。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基(O-2)有专一性的抑制作用，使形成的亚硝盐减少，比色时测定管的吸光度低于对照管吸光度，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。测定方法：按试剂盒说明书提供的方法进行测定。计算：①酶的定义：每ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位。②公式：SOD活力(nu/ml)=(对照管吸光度-测定管吸光度)/(对照管吸光度)÷50%×稀释倍数
, 百拇医药
1.2.5 MDA测定方法 原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)结合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。测定方法：按试剂盒说明书提供的方法进行测定。计算：测定样品丙二醛含量(nmol/ml)
=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(对照管吸光度-标准空白管吸光度)×
10nmol/ml×样品稀释倍数
2 实验结果
2.1 病理形态学变化 青年对照组脑组织浦金野氏细胞完整，神经元细胞正常；普通老年组可见有大脑皮层胶质细胞增多，并见有神经元细胞疏松区，胶质纤维增生，浦金野氏细胞脱失；模型组大脑皮层处有胶质细胞增生、聚集和结节形成，并有软化灶，神经细胞脱失，形成疏松区，其间可见有少量胶质细胞；脑复康组可见狭窄的神经细胞疏松区和较稀疏的浦金野氏细胞，大脑皮层可见有少量的胶质细胞和胶原纤维；醒神丸组大脑皮层内大部分未见明显病理改变，仅见少量胶质纤维形成的疏松区，但明显变小、变窄，神经元细胞、浦金野氏细胞排列完整，大脑皮层未见有软化灶。
, http://www.100md.com
2.2 醒神丸对SAM-P/8小鼠脑组织SOD水平的影响 醒神丸组及脑复康组脑组织SOD水平均明显升高，与模型组比较P<0.05。醒神丸组与脑复康组脑组织SOD水平比较，无显著性差异(P>0.05)，见表1。
表1 各组小鼠脑组织SOD含量水平比较(
±s) 组 别
n/只
SOD/(nu/ml)
醒神丸组
8
238.2125±29.6337*
脑复康组
, 百拇医药
8
239.2875±22.3470*
模型组
8
205.2637±24.5588
普通老年组
8
200.2125±26.1177
青年对照组
8
229.5125±24.3960*
, http://www.100md.com 与模型组比较*P<0.05
2.3 醒神丸对SAM-P/8小鼠脑组织MDA水平的影响 醒神丸组及脑复康组脑组织MDA水平均明显降低，与模型组比较有显著性差异，P<0.01。醒神丸组与脑复康组比较，脑组织MDA水平无显著性差异，P>0.05。模型组与青年对照组比较，脑组织MDA水平明显升高，有显著性差异，P<0.01，见表2。
表2 各组小鼠脑组织MDA活性水平比较(±s) 组 别
n/只
MDA/(nu/ml)
醒神丸组
8
, http://www.100md.com 36.3925±7.0202**
脑复康组
8
37.7612±9.9490**
模型组
8
93.4975±16.4482
普通老年组
8
80.9912±8.2668
青年对照组
8
, 百拇医药
17.1650±4.1286**
与模型组比较**P<0.013 讨 论
SAM系Senescene Accelerated Mouse的缩写，意为快速老化小白鼠，是日本京都大学竹田俊男教授开发的一种较理想的自然快速老化动物模型，具有寿命短、老化快、老化病理改变典型等特点。SAM-P/8为SAM中一个品系，以痴呆为其主要特征。本研究结果表明，SAM-P/8小鼠脑组织自由基清除能力降低，可见明显的脑组织病理形态学改变，说明SAM-P/8是一个理想的AD模型。本文结果表明，醒神丸具有明显提高SAM-P/8小鼠脑内自由基清除能力的作用，能明显升高SAM-P/8小鼠脑内SOD活性，降低脑内MDA含量，从而使脑内的自由基减少[2]。说明醒神丸提高机体清除及、或抑制自由基对脑的损害作用，可能为该药有效防治AD的作用机制之一。从病理形态学的改变来看，醒神丸对SAM-P/8小鼠脑组织损伤有明显的保护作用，仅见有少量胶质纤维形成，其它细胞排列均正常，其作用明显优于脑复康。显示以补肾活血、豁痰开窍法组方而成的中药醒神丸，对老年性痴呆有一定的防治作用。
参考文献
1，徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1994.660
2，盛树立.老年性痴呆：从分子生物学到临床诊治.北京：科学技术文献出版社，1997.17(7)：393
收稿日期：2000-03-30, 百拇医药
单位：(黑龙江中医药大学 哈尔滨 150040)
关键词：醒神丸；老年性痴呆；SAM-P/8小鼠；氧自由基
浙江中西医结合杂志001008 摘要 目的：观察醒神丸的补肾活血、豁痰开窍作用及对老年性痴呆动物模型的脑内自由基清除能力的影响。方法：通过对老年性痴呆(Alzheimer′s disease,AD)动物模型(SAM-P/8小鼠)脑组织匀浆中SOD、MDA含量进行测定，观察醒神丸的脑内自由基消除能力。结果：该药能明显提高老年性痴呆动物模型(SAM-P/8小鼠)脑组织的SOD含量，降低MDA活性。结论：提示该药能通过提高SOD含量，降低MDA活性，防治老年性痴呆。
1 材料与方法
1.1 实验材料 实验动物为日本快速老化痴呆小白鼠SAM-P/8，7月龄，体重25～30g，雄性，由天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供。7月龄雄性昆明种小鼠，体重30～35g；2月龄雄性昆明种小鼠，体重25～30g；由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。醒神丸，由黄芪、赤芍、川芎、当归、丹参、熟地、山萸肉、石菖蒲、胆南星、牛膝、甘草等20味中药组成。将药物提取加工成粉末，每克粉末含生药2.25克。由黑龙江中医药大学第一附属医院制剂室提供。脑复康片，东北制药总厂生产，批号：9810103。主要试剂：SOD测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。MDA测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。主要仪器：恒温水浴箱，低温高速离心机，722型光栅分光光度计。
, http://www.100md.com
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组 将7月龄SAM-P/8小鼠24只随机分为醒神丸组、脑复康组、模型组，每组各8只。随机选取7月龄雄性昆明种小鼠8只作为普通老年组；随机选取2月龄雄性昆明种小鼠8只作为青年对照组。
1.2.2 给药方法 将中药粉末加蒸馏水配制成混悬液，浓度为8.89%，按2.67g/kg体重灌胃。脑复康按2%浓度将脑复康片加蒸馏水配成混悬液，按0.4g/kg体重灌胃。普通老年组及青年对照组灌等容量蒸馏水。各组每日灌药1次，连续灌药30天。
1.2.3 病理形态学检查 实验期满，断头取脑生理盐水冲洗，沿矢状缝切开，左半球称重后加9倍生理盐水制备匀浆，右半球用10%甲醛固定，石腊包埋，HE染色，光镜下观察病理形态学变化。
1.2.4 SOD测定方法 原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O-2)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度[1]。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基(O-2)有专一性的抑制作用，使形成的亚硝盐减少，比色时测定管的吸光度低于对照管吸光度，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。测定方法：按试剂盒说明书提供的方法进行测定。计算：①酶的定义：每ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位。②公式：SOD活力(nu/ml)=(对照管吸光度-测定管吸光度)/(对照管吸光度)÷50%×稀释倍数
, 百拇医药
1.2.5 MDA测定方法 原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)结合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。测定方法：按试剂盒说明书提供的方法进行测定。计算：测定样品丙二醛含量(nmol/ml)
=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(对照管吸光度-标准空白管吸光度)×
10nmol/ml×样品稀释倍数
2 实验结果
2.1 病理形态学变化 青年对照组脑组织浦金野氏细胞完整，神经元细胞正常；普通老年组可见有大脑皮层胶质细胞增多，并见有神经元细胞疏松区，胶质纤维增生，浦金野氏细胞脱失；模型组大脑皮层处有胶质细胞增生、聚集和结节形成，并有软化灶，神经细胞脱失，形成疏松区，其间可见有少量胶质细胞；脑复康组可见狭窄的神经细胞疏松区和较稀疏的浦金野氏细胞，大脑皮层可见有少量的胶质细胞和胶原纤维；醒神丸组大脑皮层内大部分未见明显病理改变，仅见少量胶质纤维形成的疏松区，但明显变小、变窄，神经元细胞、浦金野氏细胞排列完整，大脑皮层未见有软化灶。
, http://www.100md.com
2.2 醒神丸对SAM-P/8小鼠脑组织SOD水平的影响 醒神丸组及脑复康组脑组织SOD水平均明显升高，与模型组比较P<0.05。醒神丸组与脑复康组脑组织SOD水平比较，无显著性差异(P>0.05)，见表1。
表1 各组小鼠脑组织SOD含量水平比较(
±s) 组 别n/只
SOD/(nu/ml)
醒神丸组
8
238.2125±29.6337*
脑复康组
, 百拇医药
8
239.2875±22.3470*
模型组
8
205.2637±24.5588
普通老年组
8
200.2125±26.1177
青年对照组
8
229.5125±24.3960*
, http://www.100md.com 与模型组比较*P<0.05
2.3 醒神丸对SAM-P/8小鼠脑组织MDA水平的影响 醒神丸组及脑复康组脑组织MDA水平均明显降低，与模型组比较有显著性差异，P<0.01。醒神丸组与脑复康组比较，脑组织MDA水平无显著性差异，P>0.05。模型组与青年对照组比较，脑组织MDA水平明显升高，有显著性差异，P<0.01，见表2。
表2 各组小鼠脑组织MDA活性水平比较(
±s) 组 别n/只
MDA/(nu/ml)
醒神丸组
8
, http://www.100md.com 36.3925±7.0202**
脑复康组
8
37.7612±9.9490**
模型组
8
93.4975±16.4482
普通老年组
8
80.9912±8.2668
青年对照组
8
, 百拇医药
17.1650±4.1286**
与模型组比较**P<0.013 讨 论
SAM系Senescene Accelerated Mouse的缩写，意为快速老化小白鼠，是日本京都大学竹田俊男教授开发的一种较理想的自然快速老化动物模型，具有寿命短、老化快、老化病理改变典型等特点。SAM-P/8为SAM中一个品系，以痴呆为其主要特征。本研究结果表明，SAM-P/8小鼠脑组织自由基清除能力降低，可见明显的脑组织病理形态学改变，说明SAM-P/8是一个理想的AD模型。本文结果表明，醒神丸具有明显提高SAM-P/8小鼠脑内自由基清除能力的作用，能明显升高SAM-P/8小鼠脑内SOD活性，降低脑内MDA含量，从而使脑内的自由基减少[2]。说明醒神丸提高机体清除及、或抑制自由基对脑的损害作用，可能为该药有效防治AD的作用机制之一。从病理形态学的改变来看，醒神丸对SAM-P/8小鼠脑组织损伤有明显的保护作用，仅见有少量胶质纤维形成，其它细胞排列均正常，其作用明显优于脑复康。显示以补肾活血、豁痰开窍法组方而成的中药醒神丸，对老年性痴呆有一定的防治作用。
参考文献
1，徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1994.660
2，盛树立.老年性痴呆：从分子生物学到临床诊治.北京：科学技术文献出版社，1997.17(7)：393
收稿日期：2000-03-30, 百拇医药