重组人粒细胞集落刺激因子对K562细胞凋亡和其细胞毒药物敏感性的影响
作者：黄新智 林洁红 祁明芳
单位：(暨南大学医学院第一附属医院血液科 510630)
关键词：K562细胞系；凋亡；重组人粒细胞集落刺激因子
广东医学001006
【摘要】目的 探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhu G-CSF)对K562细胞凋亡和其细胞毒药物敏感性的影响。方法 采用流式细胞术和MTT法分别测定细胞凋亡和细胞毒药物敏感性。结果 在低血清培养条件下，rhu G-CSF对K562细胞的凋亡有抑制作用，其凋亡百分率与rhu G-CSF浓度呈负线性相关；rhu G-CSF可增加K562细胞对Ara-C的敏感性，而降低其对DNR的敏感性；在Ara-C和DNR联合条件下，rhu G-CSF能增强两药的联合细胞毒毒性，克服了单用DNR条件下，其使DNR对K562细胞毒毒性作用降低的情况。结论 虽然rhu G-CSF并不降低 DNR和Ara-C对K562细胞的联合细胞毒毒性，但当其和化疗药物同时使用治疗髓系白血病患者时，仍应慎重。
, 百拇医药
Effect of human recombinant granulocyte-clony stimulating factor on apoptosis of K562 cell and its sensitivity to cytotoxic agents
Huang Xinzhi,Lin Jiehong,Qi Mingfang
(General Internal Medicine,First Affiliated Hospital,Jinan University Medical College,Guangzhou 510630)
【Abstract】Objective To investigate the effect of human recombinant granulocyte-clony stimulating factor (rhu G-CSF) on the apoptosis of K562 cell and its sensitivity to cytotoxic agents.Methods Cell apoptosis and sensitivity of cytotoxic agents were analyzed by flow cytometry and MTT assay respectively.Results At lower serum concentration,the rhu G-CSF had an inhibitory effect on the apoptosis of K562 cell in a negative dose dependent manner.rhu G-CSF enhanced the sensitivity of K562 cell to Ara-C while decreased its sensitivity to daunorubicin.rhu G-CSF enhanced the combinant cytotoxicity of Ara-C and daunorubicin to K562 cells.Conclusion rhu G-CSF can enhance the combined cytotoxicity of Ara-C and daunorubicin to K562 cells.
, 百拇医药
【Key words】K562 cell line Apoptosis Human recombined Granulocyte-clony stimulating factor
目前，以柔红霉素(DNR)为主要代表的蒽环类药物与阿糖胞苷联合化疗仍为急性髓系白血病的标准化疗方案。体外研究已证实，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等造血细胞生长因子可以通过动员处于G0期的髓系白血病细胞进入S期，提高白血病细胞对细胞周期特异性药物阿糖胞苷的敏感性，从而克服其细胞周期动力性耐药[1]。尽管如此，有关造血细胞生长因子是否有抑制白血病细胞凋亡作用，降低其对细胞周期非特异性药物的敏感性，是临床工作者所关心的问题。本文就重组人粒细胞集落刺激因子(rhu G-CSF)对K562细胞凋亡和其细胞毒药物敏感性的影响进行了初步研究，现报道如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 细胞系及其培养 K562人慢性粒细胞细胞系由协和医科大学、中科院血液病研究所杨纯正教授馈赠。用10% 新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所，批号980407)的RPMI 1640(Gibco Lab，批号430-1800)培养基，在37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养，视细胞生长情况，每2～3 d传代一次。
1.2 细胞凋亡测定[2] K562细胞,用2%培养基配成1×106/ml的细胞悬液,接种到培养板(Coring，美国)上,每孔1 ml。按实验要求,加入终浓度分别为 12.5，25，50，100 ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子(中外制药，批号M5A11),以无重组人粒细胞集落刺激因子为空白对照。每个浓度组设3个平行孔。培养48 h，收集各组细胞，用4℃无钙镁PBS离心洗涤2次，70%乙醇固定2 h后，加入15 mg/ml 的RNase A(Gibco Lab，美国)50 μl和5 mg/ml PI(Gibco Lab，美国)450 μl，混匀，4℃作用30 min后，用流式细胞仪(Becton Dickson，美国)测定各组细胞群的凋亡率。
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1.3 K562细胞毒药物敏感性测定
1.3.1 实验分组 共分8组：①K562+Ara-C；②K562+Ara-C+rhu G-CSF；③K562+DNR；④K562+DNR+rhu G-CSF；⑤K562+Ara-C+DNR；⑥K562+Ara-C+DNR+rhu G-CSF；⑦K562+rhu G-CSF；⑧K562组。
1.3.2 实验方法 K562细胞,用2%培养基配成细胞悬液，接种到培养板上，使每孔含1×104个细胞，180 μl。按实验分组要求，加入Ara-C，DNR，rhu G-CSF或无血清RPMI 1640 到培养体系中,使终体积为200 μl。对单用Ara-C或DNR组，其终浓度均为0.312 5 μg/ml,而二者联合时,其终浓度均为0.078 μg/ml(以上浓度根据Ara-C或DNR对 K562之IC50所定)；rhu G-CSF终浓度为50 ng/ml。每个浓度组设10个平行孔。培养48 h，收集各组K562细胞，MTT法测定540 nm吸光度值A540，细胞活力大小用A540值表示[3]。1.4 统计学方法 对所有数据用SPSS 7.5行线性相关性检验和两个样本均数的t检验。
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2 结果
2.1 rhu G-CSF可抑制K562细胞的凋亡 在低血清培养条件下，rhu G-CSF对K562细胞的凋亡有抑制作用，其凋亡百分率与rhu G-CSF呈负线性相关(r=-0.948， P=0.014),量效关系明显。见图1。
图1 rhu G-CSF对K562细胞凋亡率的影响
2.2 rhu G-CSF对K562 细胞Ara-C 和 DNR敏感性的影响 rhu G-CSF可增加K562细胞对Ara-C的敏感性，降低DNR对其细胞毒毒性作用；在Ara-C和DNR联合条件下，rhu G-CSF能增强两药的联合细胞毒毒性，克服了单用DNR条件下，其使DNR对K562细胞毒毒性作用降低的情况。见表1。
表1 rhu G-CSF对K562 细胞Ara-C 和 DNR敏感性的影响 组别
, http://www.100md.com
实验条件
n(平均
行孔数)
A540值
(
±s)
P值
1
Ara-C
10
1.101±0.060
0.000 2(与组2比较)
, http://www.100md.com
2
Ara-C+rhu G-CSF
10
0.964±0.093
3
DNR
10
1.096±0.167
0.042 6(与组4比较)
4
DNR+rhu G-CSF
10
, http://www.100md.com
1.249±0.222
5
Ara-C+DNR
10
1.140±0.123
0.009 4(与组6比较)
6
Ara-C+DNR+rhu G-CSF
10
1.008±0.105
7
rhu G-CSF
, http://www.100md.com
10
2.033±0.162
0.626 5(与组8比较)
8
对照
10
1.998±0.173
3 讨论
髓系白血病细胞细胞动力学耐药的出现是影响临床疗效的原因之一[1]。造血细胞生长因子如粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及G-CSF，因其能动员静止期髓系白血病细胞进入细胞分裂周期，在体外实验条件下，能增加其对细胞分裂S期特意性药物Ara-C的敏感性[3]，临床工作者希望它们在化疗前或与化疗方案同时应用时，能增加急性髓系白血病的疗效。但是，已经进行的数个多中心研究结果表明，除个别报道似乎能增加患者的无病生存外，绝大多数临床研究都未获得治疗效果[4]。且有一研究发现，GM-CSF对急性髓系白血病患者的预后有负面影响[5]。造成以上临床研究结果不一致的原因，除了应考虑患者的多样性和急性髓系白血病细胞生物学特征的异质性外，白血病细胞凋亡障碍所致耐药出现的可能性也不能忽略。已有研究发现，干细胞因子(SCF)能部分抑制细胞毒药物Ara-C和DNR所致的髓系白血病细胞的凋亡，降低其细胞毒作用[6]。因DNR的细胞毒性作用与促使白血病细胞凋亡有关[6]，故本研究中，rhu G-CSF对K562细胞低血清培养条件下凋亡的抑制作用，可能是导致DNR对K562细胞毒作用降低的原因。显然，有关rhu G-CSF抑制K562细胞凋亡的机制，如是否通过影响bcl-2的表达或其他途径，还有待更深入的研究加以阐明；同样，有关其对原代培养的髓系白血病细胞是否有以上作用还需证实。尽管如此，本初步研究结果提示，虽然rhu G-CSF并不降低 DNR和Ara-C对K562细胞的联合细胞毒毒性，但当其和化疗药物同时使用治疗髓系白血病患者时，仍应慎重。
, 百拇医药
参考文献
1，Bernstein SH.Growth factors in the management of adult acute leukemia.Hematol Oncol Clin Nor Am,1993,7(1):255
2，Hasper HJ,Weghorst RM,Richel DJ,et al.A new four-color flow cytometric assay to detect apoptosis in lymphocyte subsets of cultured peripheral blood cells.Cytometry，2000,40(2):167
3，Marks DC,Bebov L,Davey MW,et al.The MTT cell viablity assay for cytotoxicity testing inmultidrug-resistant human leukemia cells.Leukemia Res,1992,10:1165
, http://www.100md.com
4，Qi MF,Li YQ,Yu ZF.Overcoming cytokinetic resistance of acute myeloid leukemia with hematopoietic growth factors.J Exp Hematol,1999,7(2):81
5，Estey E,Thall PF,Kantarjian H,et al.Treatment of newly diagnosed acute myelogenous leukemia with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) before and during continuous-infusion high-dose Ara-C+daunorubicin:comparision to patients treated without GM-CSF.Blood,1992,79(9):2246
6，Hassan HT,Zander A.Stem cell factor as a survival and growth factor in human normal and malignant hematopoiesis.Acta Haematol，1996,95(3～4):257
(收稿日期：2000-06-23), 百拇医药
单位：(暨南大学医学院第一附属医院血液科 510630)
关键词：K562细胞系；凋亡；重组人粒细胞集落刺激因子
广东医学001006
【摘要】目的 探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhu G-CSF)对K562细胞凋亡和其细胞毒药物敏感性的影响。方法 采用流式细胞术和MTT法分别测定细胞凋亡和细胞毒药物敏感性。结果 在低血清培养条件下，rhu G-CSF对K562细胞的凋亡有抑制作用，其凋亡百分率与rhu G-CSF浓度呈负线性相关；rhu G-CSF可增加K562细胞对Ara-C的敏感性，而降低其对DNR的敏感性；在Ara-C和DNR联合条件下，rhu G-CSF能增强两药的联合细胞毒毒性，克服了单用DNR条件下，其使DNR对K562细胞毒毒性作用降低的情况。结论 虽然rhu G-CSF并不降低 DNR和Ara-C对K562细胞的联合细胞毒毒性，但当其和化疗药物同时使用治疗髓系白血病患者时，仍应慎重。
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Effect of human recombinant granulocyte-clony stimulating factor on apoptosis of K562 cell and its sensitivity to cytotoxic agents
Huang Xinzhi,Lin Jiehong,Qi Mingfang
(General Internal Medicine,First Affiliated Hospital,Jinan University Medical College,Guangzhou 510630)
【Abstract】Objective To investigate the effect of human recombinant granulocyte-clony stimulating factor (rhu G-CSF) on the apoptosis of K562 cell and its sensitivity to cytotoxic agents.Methods Cell apoptosis and sensitivity of cytotoxic agents were analyzed by flow cytometry and MTT assay respectively.Results At lower serum concentration,the rhu G-CSF had an inhibitory effect on the apoptosis of K562 cell in a negative dose dependent manner.rhu G-CSF enhanced the sensitivity of K562 cell to Ara-C while decreased its sensitivity to daunorubicin.rhu G-CSF enhanced the combinant cytotoxicity of Ara-C and daunorubicin to K562 cells.Conclusion rhu G-CSF can enhance the combined cytotoxicity of Ara-C and daunorubicin to K562 cells.
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【Key words】K562 cell line Apoptosis Human recombined Granulocyte-clony stimulating factor
目前，以柔红霉素(DNR)为主要代表的蒽环类药物与阿糖胞苷联合化疗仍为急性髓系白血病的标准化疗方案。体外研究已证实，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等造血细胞生长因子可以通过动员处于G0期的髓系白血病细胞进入S期，提高白血病细胞对细胞周期特异性药物阿糖胞苷的敏感性，从而克服其细胞周期动力性耐药[1]。尽管如此，有关造血细胞生长因子是否有抑制白血病细胞凋亡作用，降低其对细胞周期非特异性药物的敏感性，是临床工作者所关心的问题。本文就重组人粒细胞集落刺激因子(rhu G-CSF)对K562细胞凋亡和其细胞毒药物敏感性的影响进行了初步研究，现报道如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 细胞系及其培养 K562人慢性粒细胞细胞系由协和医科大学、中科院血液病研究所杨纯正教授馈赠。用10% 新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所，批号980407)的RPMI 1640(Gibco Lab，批号430-1800)培养基，在37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养，视细胞生长情况，每2～3 d传代一次。
1.2 细胞凋亡测定[2] K562细胞,用2%培养基配成1×106/ml的细胞悬液,接种到培养板(Coring，美国)上,每孔1 ml。按实验要求,加入终浓度分别为 12.5，25，50，100 ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子(中外制药，批号M5A11),以无重组人粒细胞集落刺激因子为空白对照。每个浓度组设3个平行孔。培养48 h，收集各组细胞，用4℃无钙镁PBS离心洗涤2次，70%乙醇固定2 h后，加入15 mg/ml 的RNase A(Gibco Lab，美国)50 μl和5 mg/ml PI(Gibco Lab，美国)450 μl，混匀，4℃作用30 min后，用流式细胞仪(Becton Dickson，美国)测定各组细胞群的凋亡率。
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1.3 K562细胞毒药物敏感性测定
1.3.1 实验分组 共分8组：①K562+Ara-C；②K562+Ara-C+rhu G-CSF；③K562+DNR；④K562+DNR+rhu G-CSF；⑤K562+Ara-C+DNR；⑥K562+Ara-C+DNR+rhu G-CSF；⑦K562+rhu G-CSF；⑧K562组。
1.3.2 实验方法 K562细胞,用2%培养基配成细胞悬液，接种到培养板上，使每孔含1×104个细胞，180 μl。按实验分组要求，加入Ara-C，DNR，rhu G-CSF或无血清RPMI 1640 到培养体系中,使终体积为200 μl。对单用Ara-C或DNR组，其终浓度均为0.312 5 μg/ml,而二者联合时,其终浓度均为0.078 μg/ml(以上浓度根据Ara-C或DNR对 K562之IC50所定)；rhu G-CSF终浓度为50 ng/ml。每个浓度组设10个平行孔。培养48 h，收集各组K562细胞，MTT法测定540 nm吸光度值A540，细胞活力大小用A540值表示[3]。1.4 统计学方法 对所有数据用SPSS 7.5行线性相关性检验和两个样本均数的t检验。
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2 结果
2.1 rhu G-CSF可抑制K562细胞的凋亡 在低血清培养条件下，rhu G-CSF对K562细胞的凋亡有抑制作用，其凋亡百分率与rhu G-CSF呈负线性相关(r=-0.948， P=0.014),量效关系明显。见图1。
图1 rhu G-CSF对K562细胞凋亡率的影响
2.2 rhu G-CSF对K562 细胞Ara-C 和 DNR敏感性的影响 rhu G-CSF可增加K562细胞对Ara-C的敏感性，降低DNR对其细胞毒毒性作用；在Ara-C和DNR联合条件下，rhu G-CSF能增强两药的联合细胞毒毒性，克服了单用DNR条件下，其使DNR对K562细胞毒毒性作用降低的情况。见表1。
表1 rhu G-CSF对K562 细胞Ara-C 和 DNR敏感性的影响 组别
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实验条件
n(平均
行孔数)
A540值
(
±s)P值
1
Ara-C
10
1.101±0.060
0.000 2(与组2比较)
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2
Ara-C+rhu G-CSF
10
0.964±0.093
3
DNR
10
1.096±0.167
0.042 6(与组4比较)
4
DNR+rhu G-CSF
10
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1.249±0.222
5
Ara-C+DNR
10
1.140±0.123
0.009 4(与组6比较)
6
Ara-C+DNR+rhu G-CSF
10
1.008±0.105
7
rhu G-CSF
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10
2.033±0.162
0.626 5(与组8比较)
8
对照
10
1.998±0.173
3 讨论
髓系白血病细胞细胞动力学耐药的出现是影响临床疗效的原因之一[1]。造血细胞生长因子如粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及G-CSF，因其能动员静止期髓系白血病细胞进入细胞分裂周期，在体外实验条件下，能增加其对细胞分裂S期特意性药物Ara-C的敏感性[3]，临床工作者希望它们在化疗前或与化疗方案同时应用时，能增加急性髓系白血病的疗效。但是，已经进行的数个多中心研究结果表明，除个别报道似乎能增加患者的无病生存外，绝大多数临床研究都未获得治疗效果[4]。且有一研究发现，GM-CSF对急性髓系白血病患者的预后有负面影响[5]。造成以上临床研究结果不一致的原因，除了应考虑患者的多样性和急性髓系白血病细胞生物学特征的异质性外，白血病细胞凋亡障碍所致耐药出现的可能性也不能忽略。已有研究发现，干细胞因子(SCF)能部分抑制细胞毒药物Ara-C和DNR所致的髓系白血病细胞的凋亡，降低其细胞毒作用[6]。因DNR的细胞毒性作用与促使白血病细胞凋亡有关[6]，故本研究中，rhu G-CSF对K562细胞低血清培养条件下凋亡的抑制作用，可能是导致DNR对K562细胞毒作用降低的原因。显然，有关rhu G-CSF抑制K562细胞凋亡的机制，如是否通过影响bcl-2的表达或其他途径，还有待更深入的研究加以阐明；同样，有关其对原代培养的髓系白血病细胞是否有以上作用还需证实。尽管如此，本初步研究结果提示，虽然rhu G-CSF并不降低 DNR和Ara-C对K562细胞的联合细胞毒毒性，但当其和化疗药物同时使用治疗髓系白血病患者时，仍应慎重。
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参考文献
1，Bernstein SH.Growth factors in the management of adult acute leukemia.Hematol Oncol Clin Nor Am,1993,7(1):255
2，Hasper HJ,Weghorst RM,Richel DJ,et al.A new four-color flow cytometric assay to detect apoptosis in lymphocyte subsets of cultured peripheral blood cells.Cytometry，2000,40(2):167
3，Marks DC,Bebov L,Davey MW,et al.The MTT cell viablity assay for cytotoxicity testing inmultidrug-resistant human leukemia cells.Leukemia Res,1992,10:1165
, http://www.100md.com
4，Qi MF,Li YQ,Yu ZF.Overcoming cytokinetic resistance of acute myeloid leukemia with hematopoietic growth factors.J Exp Hematol,1999,7(2):81
5，Estey E,Thall PF,Kantarjian H,et al.Treatment of newly diagnosed acute myelogenous leukemia with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) before and during continuous-infusion high-dose Ara-C+daunorubicin:comparision to patients treated without GM-CSF.Blood,1992,79(9):2246
6，Hassan HT,Zander A.Stem cell factor as a survival and growth factor in human normal and malignant hematopoiesis.Acta Haematol，1996,95(3～4):257
(收稿日期：2000-06-23), 百拇医药