白细胞介素6对急性髓系白血病细胞生长及核因子激活的影响
作者：张纪岩 沈倍奋 黎燕 任蕴芳 孙英勋
单位：100850 北京, 军事医学科学院基础医学研究所
关键词：
中华血液学杂志001015 多年来的研究表明,白细胞介素6(IL-6)可影响多种急性髓系白血病(AML)细胞的生长与分化[1],现在知道，IL-6主要通过JAK-STATs途径(激活的核因子主要是STAT3)和Ras/MAPK/NF-IL6途径将信号转导至核内[2]。我们选择了多个AML细胞系,首先明确了IL-6的效应,然后通过凝胶阻滞电泳(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)的方法分析了IL-6对这些AML细胞核因子(STAT3与NF-IL6)的激活情况。在此基础上，运用STAT3、NF-IL6反义寡核苷酸(AS ODNs)阻断或减弱IL-6在M1细胞中对STAT3与NF-IL6的激活,检测AS ODNs对IL-6诱导的M1细胞生长停止效应的影响。
, http://www.100md.com
材料和方法
1 细胞 M1细胞由本所王嘉玺教授惠赠;U937、K562、R2、KG-1a、TF1细胞由本室保存,其中R2细胞由任蕴芳教授将人IL-6Rα cDNA导入大鼠LT12细胞中建成;两份原代AML细胞(P1、P2)分别来自解放军第三О七医院和北京军区总医院。
2 主要试剂 [α-32P]dATP购自北京亚辉公司，rhIL-6(溶于含1g/L BSA的PBS中)的比活性为107U/mg，lipofectin购自Gibco公司。我们设计的STAT3 AS ODN序列如下，以正义链(S ODN)为对照：
S ODN 5′-AGGATGGCTCAGTGGAACCAGC-3′；
AS ODN 5′-GCTGGTTCCACTGAGCCATCCT-3′。
, 百拇医药
我们采用的NF-IL6 AS ODN序列如下，以S ODN为对照[3]：
S ODN 5′-CCGCGTTCATGCAACGCCTG-3′；
AS ODN 5′-CAGGCGTTGCATGAACGCGG-3′。
上述ODNs均由上海生工公司合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化，全硫代修饰。
我们采用的双链脱氧寡核苷酸探针由本室合成，PAGE纯化(见表1)。
表1 双链脱氧寡核苷酸探针序列[4，5] 探针
检测核因子
核酸序列
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APRE
APRF/STAT3
5′-cgatCTTCTGGGAATTCCTA-3′
3′-GAAGACCCTTAAGGATtagc-5′
ATF/NF-IL6
NF-IL6
5′-ctgaGATGACGTAGTTTTGGCGCT-3′
3′-CTACTGCATCAAAACCGCGAagtc-5′
注：小写字母为我们加入的粘端，目的是进行放射性核素标记3 EMSA 采用Klenow酶补平5′粘端的方法对双链脱氧寡核苷酸探针进行放射性核素标记。然后按照文献[4]方法进行电泳，并放射自显影。
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4 细胞的ODNs处理及增殖检测 按Gibco公司lipofectin试剂盒说明书进行操作，将M1细胞种入96孔板中，每孔5×103个细胞。加入DNA-lipofectin复合物，6h后加入不含抗生素的完全培养基，使寡核苷酸浓度降为初始浓度的1/5。转染24h后加入梯度稀释的rhIL-6，培养72h，加入MTT后再培养4h，以100g/L SDS-0.01mol/L HCl溶解沉淀，测波长570nm处的吸光度(A)值。
结果和讨论
1 rhIL-6对AML细胞生长的影响 rhIL-6可显著抑制R2、M1细胞的生长，对U937细胞的生长也有一定的抑制作用,但不影响K562、KG-1a及2例原代AML细胞的生长，对TF1细胞的生长还有促进作用(图1)。可见，AML细胞对rhIL-6的反应并不一致。
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图1 rhIL-6对AML细胞生长的影响
2 rhIL-6对AML细胞核因子激活的影响 我们以STAT3与NF-IL6为指标，检测了100μg/L rhIL-6作用15min前后AML细胞中JAK-STATs途径与Ras/MAPK/NF-IL6途径的激活情况。在受rhIL-6抑制的M1、R2、U937细胞中，STAT3均有明确而显著的诱导激活，而NF-IL6仅在M1细胞中有诱导激活，说明这3种细胞中JAK-STATs途径的激活占优势，细胞主要表现出JAK-STATs途径转导的效应信息，提示JAK-STATs途径代表负调控信号。在K562细胞中，STAT3与NF-IL6均被诱导激活。在对rhIL-6无反应的KG-1a及2例原代AML细胞中，rhIL-6对STAT3与NF-IL6均无显著诱导作用。在受rhIL-6促进的TF1细胞中，STAT3有微弱的诱导激活，而NF-IL6的诱导激活较为显著，说明Ras/MAPK/NF-IL6途径的激活占优势，细胞主要表现出Ras/MAPK/NF-IL6途径转导的效应信息，提示Ras/MAPK/NF-IL6途径是正调控信号的一部分。在所有检测的细胞中，NF-IL6均有组成型激活(constitutively activated)，而STAT3在R2、K562及1例原代AML细胞中有组成型激活。
, 百拇医药
3 M1细胞中STAT3、NF-IL6 AS ODNs对rhIL-6效应的影响 我们设计的STAT3 AS ODN的靶位点是起始密码子ATG附近的21个核苷酸。特异性分析表明，它与小鼠的其他已知基因无明显同源性。STAT3 AS ODN可明显拮抗rhIL-6对M1细胞中STAT3的激活，其后果为部分拮抗rhIL-6对M1细胞生长的抑制作用，直接证实了JAK-STATs途径(主要是STAT3)是将负调控信号转导至核内。另外，我们注意到在STAT3 AS ODN的作用下, 低剂量IL-6 (0.001～0.100μg/L)对M1细胞的生长有促进作用，说明IL-6在激活JAK-STATs途径(主要是STAT3)转导的负调控信号的同时，也激活正调控信号，但正调控信号的激活在一般情况下被负调控信号的激活遮蔽，STAT3 AS ODN的作用使负调控信号减弱，因而正调控信号的激活便显现出来。
我们采用的NF-IL6 AS ODN的靶位点亦在起始密码子ATG附近，其特异性符合AS ODN设计的要求。NF-IL6 AS ODN可减弱M1细胞中NF-IL6的激活，其后果为加强rhIL-6对M1细胞的抑制，证明了Ras/MAPK/NF-IL6途径转导正调控信号。
, 百拇医药
另外，在我们所采用的剂量下，各种ODNs对M1细胞均无明显的非特异杀伤作用，STAT3、NF-IL6 AS ODNs本身对M1细胞生长亦无明显影响。既然NF-IL6 AS ODN可减弱M1细胞中NF-IL6的组成型激活，那么它为何不影响M1细胞的生长？答案也许在于在M1这样的急性髓系白血病细胞中，生长增强信号是如此强大以致于NF-IL6组成型激活的减弱被完全遮蔽了。这种减弱仅在IL-6作用时才体现出来。
既然JAK-STATs途径代表负调控信号，那么R2、K562及1例原代AML细胞中有STAT3的组成型激活意味着什么呢？我们认为，在肿瘤细胞及病毒转化细胞这样的恶性细胞中也同时存在着负调控信号与正调控信号，只不过负调控信号远较正调控信号弱小，被正调控信号完全遮蔽。在IL-6诱导后，随着JAK-STATs途径与Ras/MAPK/NF-IL6途径的激活，正、负调控信号的相对平衡关系改变，故细胞表现出相应的生物学效应。
参 考 文 献
, 百拇医药
1，Givon T, Slavin S, Haran-Ghera N, et al. Antitumor effects of human recombinant interleukin-6 on acute myeloid leukemia in mice and in cell cultures. Blood, 1992, 79:2392-2398.
2，Akira S. IL-6-regulated transcription factors. Int J Biochem Cell Biol, 1997, 29:1401-1408.
3，Kiehntopf M, Herrmann F, Brach MA. Functional NF-IL6/CCAAT enhancer-binding protein is required for tumor necrosis factor α-inducible expression of the granulocyte colony-stimulating factor (CSF), but not the granulocyte /macrophage CSF or interleukin 6 gene in human fibroblasts. J Exp Med, 1995, 181:793-798.
, 百拇医药
4，Wegenka UM, Buschmann J, Luttichen C, et al. Acute-phase response factor, a nuclear factor binding to acute-phase response elements, is rapidly activated by interleukin-6 at the posttranslational level. Mol Cell Biol, 1993, 13:276-288.
5，Hsu W, Kerppola TK, Chen PL, et al. Fos and Jun repress transcription activation by NF-IL6 through association at the basic zipper region. Mol Cell Biol, 1994, 14:268-276.
(收稿日期：1999-09-02), 百拇医药
单位：100850 北京, 军事医学科学院基础医学研究所
关键词：
中华血液学杂志001015 多年来的研究表明,白细胞介素6(IL-6)可影响多种急性髓系白血病(AML)细胞的生长与分化[1],现在知道，IL-6主要通过JAK-STATs途径(激活的核因子主要是STAT3)和Ras/MAPK/NF-IL6途径将信号转导至核内[2]。我们选择了多个AML细胞系,首先明确了IL-6的效应,然后通过凝胶阻滞电泳(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)的方法分析了IL-6对这些AML细胞核因子(STAT3与NF-IL6)的激活情况。在此基础上，运用STAT3、NF-IL6反义寡核苷酸(AS ODNs)阻断或减弱IL-6在M1细胞中对STAT3与NF-IL6的激活,检测AS ODNs对IL-6诱导的M1细胞生长停止效应的影响。
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材料和方法
1 细胞 M1细胞由本所王嘉玺教授惠赠;U937、K562、R2、KG-1a、TF1细胞由本室保存,其中R2细胞由任蕴芳教授将人IL-6Rα cDNA导入大鼠LT12细胞中建成;两份原代AML细胞(P1、P2)分别来自解放军第三О七医院和北京军区总医院。
2 主要试剂 [α-32P]dATP购自北京亚辉公司，rhIL-6(溶于含1g/L BSA的PBS中)的比活性为107U/mg，lipofectin购自Gibco公司。我们设计的STAT3 AS ODN序列如下，以正义链(S ODN)为对照：
S ODN 5′-AGGATGGCTCAGTGGAACCAGC-3′；
AS ODN 5′-GCTGGTTCCACTGAGCCATCCT-3′。
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我们采用的NF-IL6 AS ODN序列如下，以S ODN为对照[3]：
S ODN 5′-CCGCGTTCATGCAACGCCTG-3′；
AS ODN 5′-CAGGCGTTGCATGAACGCGG-3′。
上述ODNs均由上海生工公司合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化，全硫代修饰。
我们采用的双链脱氧寡核苷酸探针由本室合成，PAGE纯化(见表1)。
表1 双链脱氧寡核苷酸探针序列[4，5] 探针
检测核因子
核酸序列
, http://www.100md.com
APRE
APRF/STAT3
5′-cgatCTTCTGGGAATTCCTA-3′
3′-GAAGACCCTTAAGGATtagc-5′
ATF/NF-IL6
NF-IL6
5′-ctgaGATGACGTAGTTTTGGCGCT-3′
3′-CTACTGCATCAAAACCGCGAagtc-5′
注：小写字母为我们加入的粘端，目的是进行放射性核素标记3 EMSA 采用Klenow酶补平5′粘端的方法对双链脱氧寡核苷酸探针进行放射性核素标记。然后按照文献[4]方法进行电泳，并放射自显影。
, 百拇医药
4 细胞的ODNs处理及增殖检测 按Gibco公司lipofectin试剂盒说明书进行操作，将M1细胞种入96孔板中，每孔5×103个细胞。加入DNA-lipofectin复合物，6h后加入不含抗生素的完全培养基，使寡核苷酸浓度降为初始浓度的1/5。转染24h后加入梯度稀释的rhIL-6，培养72h，加入MTT后再培养4h，以100g/L SDS-0.01mol/L HCl溶解沉淀，测波长570nm处的吸光度(A)值。
结果和讨论
1 rhIL-6对AML细胞生长的影响 rhIL-6可显著抑制R2、M1细胞的生长，对U937细胞的生长也有一定的抑制作用,但不影响K562、KG-1a及2例原代AML细胞的生长，对TF1细胞的生长还有促进作用(图1)。可见，AML细胞对rhIL-6的反应并不一致。
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图1 rhIL-6对AML细胞生长的影响
2 rhIL-6对AML细胞核因子激活的影响 我们以STAT3与NF-IL6为指标，检测了100μg/L rhIL-6作用15min前后AML细胞中JAK-STATs途径与Ras/MAPK/NF-IL6途径的激活情况。在受rhIL-6抑制的M1、R2、U937细胞中，STAT3均有明确而显著的诱导激活，而NF-IL6仅在M1细胞中有诱导激活，说明这3种细胞中JAK-STATs途径的激活占优势，细胞主要表现出JAK-STATs途径转导的效应信息，提示JAK-STATs途径代表负调控信号。在K562细胞中，STAT3与NF-IL6均被诱导激活。在对rhIL-6无反应的KG-1a及2例原代AML细胞中，rhIL-6对STAT3与NF-IL6均无显著诱导作用。在受rhIL-6促进的TF1细胞中，STAT3有微弱的诱导激活，而NF-IL6的诱导激活较为显著，说明Ras/MAPK/NF-IL6途径的激活占优势，细胞主要表现出Ras/MAPK/NF-IL6途径转导的效应信息，提示Ras/MAPK/NF-IL6途径是正调控信号的一部分。在所有检测的细胞中，NF-IL6均有组成型激活(constitutively activated)，而STAT3在R2、K562及1例原代AML细胞中有组成型激活。
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3 M1细胞中STAT3、NF-IL6 AS ODNs对rhIL-6效应的影响 我们设计的STAT3 AS ODN的靶位点是起始密码子ATG附近的21个核苷酸。特异性分析表明，它与小鼠的其他已知基因无明显同源性。STAT3 AS ODN可明显拮抗rhIL-6对M1细胞中STAT3的激活，其后果为部分拮抗rhIL-6对M1细胞生长的抑制作用，直接证实了JAK-STATs途径(主要是STAT3)是将负调控信号转导至核内。另外，我们注意到在STAT3 AS ODN的作用下, 低剂量IL-6 (0.001～0.100μg/L)对M1细胞的生长有促进作用，说明IL-6在激活JAK-STATs途径(主要是STAT3)转导的负调控信号的同时，也激活正调控信号，但正调控信号的激活在一般情况下被负调控信号的激活遮蔽，STAT3 AS ODN的作用使负调控信号减弱，因而正调控信号的激活便显现出来。
我们采用的NF-IL6 AS ODN的靶位点亦在起始密码子ATG附近，其特异性符合AS ODN设计的要求。NF-IL6 AS ODN可减弱M1细胞中NF-IL6的激活，其后果为加强rhIL-6对M1细胞的抑制，证明了Ras/MAPK/NF-IL6途径转导正调控信号。
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另外，在我们所采用的剂量下，各种ODNs对M1细胞均无明显的非特异杀伤作用，STAT3、NF-IL6 AS ODNs本身对M1细胞生长亦无明显影响。既然NF-IL6 AS ODN可减弱M1细胞中NF-IL6的组成型激活，那么它为何不影响M1细胞的生长？答案也许在于在M1这样的急性髓系白血病细胞中，生长增强信号是如此强大以致于NF-IL6组成型激活的减弱被完全遮蔽了。这种减弱仅在IL-6作用时才体现出来。
既然JAK-STATs途径代表负调控信号，那么R2、K562及1例原代AML细胞中有STAT3的组成型激活意味着什么呢？我们认为，在肿瘤细胞及病毒转化细胞这样的恶性细胞中也同时存在着负调控信号与正调控信号，只不过负调控信号远较正调控信号弱小，被正调控信号完全遮蔽。在IL-6诱导后，随着JAK-STATs途径与Ras/MAPK/NF-IL6途径的激活，正、负调控信号的相对平衡关系改变，故细胞表现出相应的生物学效应。
参 考 文 献
, 百拇医药
1，Givon T, Slavin S, Haran-Ghera N, et al. Antitumor effects of human recombinant interleukin-6 on acute myeloid leukemia in mice and in cell cultures. Blood, 1992, 79:2392-2398.
2，Akira S. IL-6-regulated transcription factors. Int J Biochem Cell Biol, 1997, 29:1401-1408.
3，Kiehntopf M, Herrmann F, Brach MA. Functional NF-IL6/CCAAT enhancer-binding protein is required for tumor necrosis factor α-inducible expression of the granulocyte colony-stimulating factor (CSF), but not the granulocyte /macrophage CSF or interleukin 6 gene in human fibroblasts. J Exp Med, 1995, 181:793-798.
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4，Wegenka UM, Buschmann J, Luttichen C, et al. Acute-phase response factor, a nuclear factor binding to acute-phase response elements, is rapidly activated by interleukin-6 at the posttranslational level. Mol Cell Biol, 1993, 13:276-288.
5，Hsu W, Kerppola TK, Chen PL, et al. Fos and Jun repress transcription activation by NF-IL6 through association at the basic zipper region. Mol Cell Biol, 1994, 14:268-276.
(收稿日期：1999-09-02), 百拇医药