高三尖杉酯碱对人淋巴瘤细胞系Raji细胞作用的实验研究
作者：金洁 M Hauberg 林雄斌 R Parwaresch
单位：金洁(310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院)；M Hauberg 林雄斌 R Parwaresch(德国基尔大学血液病理所)
关键词：
中华血液学杂志001014 为探讨高三尖杉酯碱(HHT)对恶性淋巴细胞系的影响，我们观察HHT在体外对人Burkitt 淋巴瘤细胞Raji增殖、端粒酶活性的影响及是否诱导Raji细胞凋亡。
材料和方法
1 试剂 HHT为杭州民生药厂产品，以RPMI 1640培养液配成100ng/μl，4℃保存备用。胎牛血清、谷氨酰胺为Gibco公司产品。蛋白标准品为Bio-Rad公司产品。Apoptotic DNA Ladder试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品。牛血清清蛋白系Sigma公司产品。
, 百拇医药
2 细胞培养 Burkitt淋巴瘤细胞系Raji细胞由德国基尔大学血液病理所提供，用含体积分数为10%的灭活胎牛血清RPMI 1640培养液(内含2 mmol/L谷氨酰胺)在37℃、体积分数为5%的CO2条件下培养，2d传代1次。取对数生长期细胞用于实验。
3 引物合成 TS 引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)、CX-ext引物 (5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)均由Eurogentec公司合成。
4 剂量反应曲线 收集对数生长期的细胞，配成浓度为1×105/ml的细胞悬液，分别加入终浓度为5，10，20，40，100ng/ml的HHT，对照组加入等体积的RPMI 1640培养液，培养48h后收集细胞，用冰冷的PBS洗涤2遍。
5 时间反应曲线 在1×105/ml对数生长期的细胞中加入HHT，使其终浓度为40ng/ml，分别于给药后0，4，8，24，48及72h收集细胞，用冰冷的PBS洗涤2遍。以上实验均分别重复3次。
, 百拇医药
6 细胞增殖及细胞形态学观察 用体积分数为10%的牛血清清蛋白调整细胞浓度至1×106/ml，离心涂片，立即进行免疫组化染色。按常规ABC法，一抗Ki-67、Ki-S2和Ki-S4均由基尔大学血液病理所自制，二抗为Dako公司产品。其余玻片进行PAP染色，光镜下观察细胞形态并进行凋亡细胞计数，每张玻片计数200个细胞。
7 DNA琼脂糖凝胶电泳 1×106细胞用冰冷PBS洗涤2次，按Apoptotic DNA Ladder试剂盒说明书抽提DNA，取10μl DNA行15g/L琼脂糖凝胶电泳，用紫外透射仪观察电泳条带并摄片。
8 端粒酶活性测定 按照Krupp改良的荧光素标记的端粒重复扩增方法(TRAP)[1]进行半定量测定。
8.1 细胞抽提物的制备：将培养48h的1×106细胞用冰冷PBS洗涤2次，离心后将上清液吸干，加入冰冷的Chaps细胞裂解液100μl [10mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 1mmol/L MgCl2, 1mmol/L EGTA, 5% Chaps (购自Sigma公司), 5mmol/L β-巯基乙醇, 体积分数为10%的甘油, 0.1mol/L AEBSF(4-[2-aminoethyl]benzenesulfonylfluoride)(购自Sigma公司), 1U/μl RNA 酶抑制剂(后二者须新鲜加入)]。混匀后置冰中30min, 20000×g, 4℃离心30min。上清液转移到另一无菌管中, 留取5μl用于蛋白含量测定， 其余立即投入液氮中快速冷冻， 并储存在-80℃待测。
, 百拇医药
8.2 蛋白含量测定：蛋白含量按照Bradford分析法。蛋白标准品分别稀释成0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mg/ml, 并于每次测定前制备标准曲线。细胞抽提物用Bio-Rad蛋白显色液(预先用蒸馏水1∶5稀释)1∶100稀释，860分光光度计测定蛋白含量。
8.3 PCR条件：反应体积为50μl， 含20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EGTA, 体积分数为0.005%的Tween 20, 1.5 mmol/L MgCl2, 63mmol/L KCl, 50μmol/L 4×dNTP (购自MBI公司),2 U Taq DNA聚合酶(购自MBI公司), 0.1 attomol PCR标准物，10 pmol TS 引物, 10 pmol CX-ext引物, 1μg蛋白含量的细胞提取物作为摸板。立即在PCR扩增仪上进行扩增。先于30 ℃孵育30min以延伸TS引物，再经95℃变性3min，然后于95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环。
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8.4 端粒酶活性测定：取1μl PCR产物，加入1μl Genescan-500 ROX内泳道标准物(internal lane standard)及22μl的甲酰胺，混匀后95℃变性2min即置于冰中冷却，用DNA测序仪(ABI prism 310)进行毛细管电泳分析。取前5个峰值，相加并除以PCR标准物峰值，即为端粒酶活性。
9 统计学处理 采用卡方检验。
结果
1 HHT对Raji细胞增殖的抑制作用 HHT对Raji细胞体外增殖具有显著的抑制作用，并与剂量呈正比(表1)。
表1 HHT对Raji 细胞增殖抑制的影响结果(
±s) HHT浓度
, 百拇医药 (ng/ml)
Raji细胞抗原表达率(%)
Ki-S4
Ki-67
Ki-S2
0
94.5±5.0
95.5±5.0
57.0±3.0
10
90.5±0.5
91.5±0.5
, 百拇医药
50.0±5.0
20
82.0±3.0*
81.0±1.0*
36.5±19.5*
40
76.5±5.5＃
74.5±1.5＃
15.5±7.5＃
100
43.5±3.5＃
, 百拇医药
52.5±6.5＃
14.0±3.0＃
注：* 与对照组比较，P<0.01；#与对照组比较, P<0.001
2 HHT不同浓度对Raji细胞端粒酶活性的影响 HHT对端粒酶活性具有明显的抑制作用，并与浓度呈正比，当浓度为10ng/ml时，Raji细胞端粒酶活性即降低了40.2%，浓度为20ng/ml时活性下降了93.9%(图1)。
图1 不同浓度的HHT对Raji细胞端粒酶活性的影响
3 HHT不同作用时间对Raji细胞端粒酶活性的影响 HHT 40mg/ml与Raji细胞作用8h后，端粒酶活性下降了62.2%，48h达到最大的抑制(图2)。
, 百拇医药
图2 HHT作用时间对Raji细胞端粒酶活性的影响
4 细胞形态观察 经HHT处理48h后，可看到细胞核固缩、核碎裂和凋亡小体形成。
5 DNA凝胶电泳 HHT作用48h后，100ng/ml、200ng/ml组可见梯状图谱。
讨论
HHT作用于肿瘤细胞的核糖体从而抑制蛋白质合成，呈剂量、时间依赖方式。药物阻止细胞从G1期进入S期，G2期进入M期。临床上主要用于治疗急性非淋巴细胞白血病，效果显著。本研究结果表明，HHT在体外可明显抑制淋巴瘤细胞增殖。药物抑制作用随浓度增加而增强。Ki-67、Ki-S4和Ki-S2是检测细胞增殖的单克隆抗体。Ki-67和Ki-S4在细胞周期S期、G2期、M期和G1期表达，而Ki-S2仅在S期、G2期和M期表达，在G1期和G0期不表达[2，3]。本研究中发现Raji细胞在无HHT作用下Ki-67、Ki-S4的表达率分别为95.5%和94.5%,而Ki-S2的表达率为57.0%，说明约有37%的细胞处于G1期。HHT作用后，Ki-67、Ki-S4和Ki-S2呈平行下降，HHT浓度为100ng/ml时，Ki-67、Ki-S4和Ki-S2阳性率分别为52.5%、43.5%和14.0%，说明HHT不是主要作用于细胞周期G1期，与国内麦文渊等[4]报道HHT主要作用于K562细胞的G1期不同。表明HHT对不同的细胞所作用的细胞周期不同。
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端粒是真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质结构。随着细胞生长、分裂，端粒长度逐渐缩短，直至细胞出现核型不稳定而死亡。端粒酶是一种由RNA模板，端粒酶逆转录酶及端粒相关蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，可添加端粒重复序列于染色体末端，弥补DNA复制造成的端粒缩短，使细胞逃逸死亡。研究结果表明，绝大多数无限增殖的细胞株及85%人类原发性肿瘤均表达高的端粒酶活性[5]。因此，对端粒酶的抑制已成为恶性肿瘤治疗上的新思路。本实验结果表明，HHT对Burkitt淋巴瘤细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用。抑制作用呈量-效和时-效关系。结果还显示，HHT对细胞端粒酶活性的抑制于药物作用后8h即出现，而对该细胞增殖的抑制于药物作用后24h才出现，且抑制程度前者大于后者，说明药物作用后先出现端粒酶的抑制，后出现细胞增殖降低，似乎可以说明对端粒酶的抑制可能是HHT对肿瘤抑制的机制之一。
为探明HHT对Raji细胞的端粒酶活性抑制是否与细胞凋亡相关，我们观察了细胞形态变化与 DNA凝胶电泳，发现当HHT浓度为40ng/ml时，细胞形态观察即可见明显的凋亡表现，而DNA凝胶电泳则于药物浓度为100ng/ml时才出现梯形条带，200ng/ml时更明显。
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HHT对恶性淋巴瘤细胞的端粒酶活性具有抑制作用，同时具有抑制恶性淋巴瘤细胞增殖和促凋亡作用，提示HHT可能对于淋巴细胞恶性疾病具有潜在的治疗作用。
基金项目：浙江省卫生厅科学基金部分资助项目(2000A082)
参 考 文 献
1，Krupp G, Kuehne K, Tamm S, et al. Molecular basis of artifacts in the detection of telomerase activity and a modified primer for a more robust ‘TRAP’ assay. Nucl Acids Res, 1997, 25: 919-921.
2，Bonatz G, Klapper W, Barthe A, et al. Analysis of telomerase expression and proliferative activity in the different layers of cyclic endometrium. Biochem Biophysi Res Commun, 1998, 253: 214-221.
, 百拇医药
3，Heidebrecht HJ, Buck F, Steinmann J, et al. P100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M. Blood, 1997, 90: 226-233.
4，麦文渊，林茂芳. 高三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的实验研究. 中华血液学杂志，1998，19：375-376.
5，Kim NW. Clinical implications of telomerase in cancer. Eur J Cancer, 1997, 33: 781-786.
(收稿日期：1999-11-08), http://www.100md.com
单位：金洁(310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院)；M Hauberg 林雄斌 R Parwaresch(德国基尔大学血液病理所)
关键词：
中华血液学杂志001014 为探讨高三尖杉酯碱(HHT)对恶性淋巴细胞系的影响，我们观察HHT在体外对人Burkitt 淋巴瘤细胞Raji增殖、端粒酶活性的影响及是否诱导Raji细胞凋亡。
材料和方法
1 试剂 HHT为杭州民生药厂产品，以RPMI 1640培养液配成100ng/μl，4℃保存备用。胎牛血清、谷氨酰胺为Gibco公司产品。蛋白标准品为Bio-Rad公司产品。Apoptotic DNA Ladder试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品。牛血清清蛋白系Sigma公司产品。
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2 细胞培养 Burkitt淋巴瘤细胞系Raji细胞由德国基尔大学血液病理所提供，用含体积分数为10%的灭活胎牛血清RPMI 1640培养液(内含2 mmol/L谷氨酰胺)在37℃、体积分数为5%的CO2条件下培养，2d传代1次。取对数生长期细胞用于实验。
3 引物合成 TS 引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)、CX-ext引物 (5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)均由Eurogentec公司合成。
4 剂量反应曲线 收集对数生长期的细胞，配成浓度为1×105/ml的细胞悬液，分别加入终浓度为5，10，20，40，100ng/ml的HHT，对照组加入等体积的RPMI 1640培养液，培养48h后收集细胞，用冰冷的PBS洗涤2遍。
5 时间反应曲线 在1×105/ml对数生长期的细胞中加入HHT，使其终浓度为40ng/ml，分别于给药后0，4，8，24，48及72h收集细胞，用冰冷的PBS洗涤2遍。以上实验均分别重复3次。
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6 细胞增殖及细胞形态学观察 用体积分数为10%的牛血清清蛋白调整细胞浓度至1×106/ml，离心涂片，立即进行免疫组化染色。按常规ABC法，一抗Ki-67、Ki-S2和Ki-S4均由基尔大学血液病理所自制，二抗为Dako公司产品。其余玻片进行PAP染色，光镜下观察细胞形态并进行凋亡细胞计数，每张玻片计数200个细胞。
7 DNA琼脂糖凝胶电泳 1×106细胞用冰冷PBS洗涤2次，按Apoptotic DNA Ladder试剂盒说明书抽提DNA，取10μl DNA行15g/L琼脂糖凝胶电泳，用紫外透射仪观察电泳条带并摄片。
8 端粒酶活性测定 按照Krupp改良的荧光素标记的端粒重复扩增方法(TRAP)[1]进行半定量测定。
8.1 细胞抽提物的制备：将培养48h的1×106细胞用冰冷PBS洗涤2次，离心后将上清液吸干，加入冰冷的Chaps细胞裂解液100μl [10mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 1mmol/L MgCl2, 1mmol/L EGTA, 5% Chaps (购自Sigma公司), 5mmol/L β-巯基乙醇, 体积分数为10%的甘油, 0.1mol/L AEBSF(4-[2-aminoethyl]benzenesulfonylfluoride)(购自Sigma公司), 1U/μl RNA 酶抑制剂(后二者须新鲜加入)]。混匀后置冰中30min, 20000×g, 4℃离心30min。上清液转移到另一无菌管中, 留取5μl用于蛋白含量测定， 其余立即投入液氮中快速冷冻， 并储存在-80℃待测。
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8.2 蛋白含量测定：蛋白含量按照Bradford分析法。蛋白标准品分别稀释成0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mg/ml, 并于每次测定前制备标准曲线。细胞抽提物用Bio-Rad蛋白显色液(预先用蒸馏水1∶5稀释)1∶100稀释，860分光光度计测定蛋白含量。
8.3 PCR条件：反应体积为50μl， 含20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EGTA, 体积分数为0.005%的Tween 20, 1.5 mmol/L MgCl2, 63mmol/L KCl, 50μmol/L 4×dNTP (购自MBI公司),2 U Taq DNA聚合酶(购自MBI公司), 0.1 attomol PCR标准物，10 pmol TS 引物, 10 pmol CX-ext引物, 1μg蛋白含量的细胞提取物作为摸板。立即在PCR扩增仪上进行扩增。先于30 ℃孵育30min以延伸TS引物，再经95℃变性3min，然后于95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环。
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8.4 端粒酶活性测定：取1μl PCR产物，加入1μl Genescan-500 ROX内泳道标准物(internal lane standard)及22μl的甲酰胺，混匀后95℃变性2min即置于冰中冷却，用DNA测序仪(ABI prism 310)进行毛细管电泳分析。取前5个峰值，相加并除以PCR标准物峰值，即为端粒酶活性。
9 统计学处理 采用卡方检验。
结果
1 HHT对Raji细胞增殖的抑制作用 HHT对Raji细胞体外增殖具有显著的抑制作用，并与剂量呈正比(表1)。
表1 HHT对Raji 细胞增殖抑制的影响结果(
±s) HHT浓度, 百拇医药 (ng/ml)
Raji细胞抗原表达率(%)
Ki-S4
Ki-67
Ki-S2
0
94.5±5.0
95.5±5.0
57.0±3.0
10
90.5±0.5
91.5±0.5
, 百拇医药
50.0±5.0
20
82.0±3.0*
81.0±1.0*
36.5±19.5*
40
76.5±5.5＃
74.5±1.5＃
15.5±7.5＃
100
43.5±3.5＃
, 百拇医药
52.5±6.5＃
14.0±3.0＃
注：* 与对照组比较，P<0.01；#与对照组比较, P<0.001
2 HHT不同浓度对Raji细胞端粒酶活性的影响 HHT对端粒酶活性具有明显的抑制作用，并与浓度呈正比，当浓度为10ng/ml时，Raji细胞端粒酶活性即降低了40.2%，浓度为20ng/ml时活性下降了93.9%(图1)。
图1 不同浓度的HHT对Raji细胞端粒酶活性的影响
3 HHT不同作用时间对Raji细胞端粒酶活性的影响 HHT 40mg/ml与Raji细胞作用8h后，端粒酶活性下降了62.2%，48h达到最大的抑制(图2)。
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图2 HHT作用时间对Raji细胞端粒酶活性的影响
4 细胞形态观察 经HHT处理48h后，可看到细胞核固缩、核碎裂和凋亡小体形成。
5 DNA凝胶电泳 HHT作用48h后，100ng/ml、200ng/ml组可见梯状图谱。
讨论
HHT作用于肿瘤细胞的核糖体从而抑制蛋白质合成，呈剂量、时间依赖方式。药物阻止细胞从G1期进入S期，G2期进入M期。临床上主要用于治疗急性非淋巴细胞白血病，效果显著。本研究结果表明，HHT在体外可明显抑制淋巴瘤细胞增殖。药物抑制作用随浓度增加而增强。Ki-67、Ki-S4和Ki-S2是检测细胞增殖的单克隆抗体。Ki-67和Ki-S4在细胞周期S期、G2期、M期和G1期表达，而Ki-S2仅在S期、G2期和M期表达，在G1期和G0期不表达[2，3]。本研究中发现Raji细胞在无HHT作用下Ki-67、Ki-S4的表达率分别为95.5%和94.5%,而Ki-S2的表达率为57.0%，说明约有37%的细胞处于G1期。HHT作用后，Ki-67、Ki-S4和Ki-S2呈平行下降，HHT浓度为100ng/ml时，Ki-67、Ki-S4和Ki-S2阳性率分别为52.5%、43.5%和14.0%，说明HHT不是主要作用于细胞周期G1期，与国内麦文渊等[4]报道HHT主要作用于K562细胞的G1期不同。表明HHT对不同的细胞所作用的细胞周期不同。
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端粒是真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质结构。随着细胞生长、分裂，端粒长度逐渐缩短，直至细胞出现核型不稳定而死亡。端粒酶是一种由RNA模板，端粒酶逆转录酶及端粒相关蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，可添加端粒重复序列于染色体末端，弥补DNA复制造成的端粒缩短，使细胞逃逸死亡。研究结果表明，绝大多数无限增殖的细胞株及85%人类原发性肿瘤均表达高的端粒酶活性[5]。因此，对端粒酶的抑制已成为恶性肿瘤治疗上的新思路。本实验结果表明，HHT对Burkitt淋巴瘤细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用。抑制作用呈量-效和时-效关系。结果还显示，HHT对细胞端粒酶活性的抑制于药物作用后8h即出现，而对该细胞增殖的抑制于药物作用后24h才出现，且抑制程度前者大于后者，说明药物作用后先出现端粒酶的抑制，后出现细胞增殖降低，似乎可以说明对端粒酶的抑制可能是HHT对肿瘤抑制的机制之一。
为探明HHT对Raji细胞的端粒酶活性抑制是否与细胞凋亡相关，我们观察了细胞形态变化与 DNA凝胶电泳，发现当HHT浓度为40ng/ml时，细胞形态观察即可见明显的凋亡表现，而DNA凝胶电泳则于药物浓度为100ng/ml时才出现梯形条带，200ng/ml时更明显。
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HHT对恶性淋巴瘤细胞的端粒酶活性具有抑制作用，同时具有抑制恶性淋巴瘤细胞增殖和促凋亡作用，提示HHT可能对于淋巴细胞恶性疾病具有潜在的治疗作用。
基金项目：浙江省卫生厅科学基金部分资助项目(2000A082)
参 考 文 献
1，Krupp G, Kuehne K, Tamm S, et al. Molecular basis of artifacts in the detection of telomerase activity and a modified primer for a more robust ‘TRAP’ assay. Nucl Acids Res, 1997, 25: 919-921.
2，Bonatz G, Klapper W, Barthe A, et al. Analysis of telomerase expression and proliferative activity in the different layers of cyclic endometrium. Biochem Biophysi Res Commun, 1998, 253: 214-221.
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3，Heidebrecht HJ, Buck F, Steinmann J, et al. P100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M. Blood, 1997, 90: 226-233.
4，麦文渊，林茂芳. 高三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的实验研究. 中华血液学杂志，1998，19：375-376.
5，Kim NW. Clinical implications of telomerase in cancer. Eur J Cancer, 1997, 33: 781-786.
(收稿日期：1999-11-08), http://www.100md.com