应用ARMS法对β地中海贫血进行基因型分析
作者：江悦华 杜琴 陈阳 李春平 张中芬
单位：江悦华 杜琴 李春平 张中芬(510010 广州，广州军区广州总医院优生遗传中心)；陈阳(广东省顺德市桂州医院)
关键词：
中华血液学杂志001011 β地中海贫血(β地贫)是我国南方和西南各省常见的遗传病，从婚前或产前检查中检出β地贫携带者(轻型)并鉴定他们的基因突变类型是降低重型β地贫患儿出生的有效预防方法。已经报告的中国人中β珠蛋白基因突变型已达29种。对于常见突变使用的反向点杂交法(RDB)已经得到广泛应用。毛跃华等[1]报告了多重PCR检测我国常见4种β地贫的突变特异性扩增系统(ARMS)法,杜传书等[2]补充了占第2位的IVS-Ⅱ-654(C→T)突变的ARMS检测法。我们用此法对95例β地贫进行基因型分析，评价其作为常规分子生物学诊断方法的可能性。
, 百拇医药
对象和方法
1 检测对象 对本院和顺德桂州医院妇产科正常妊娠妇女及其丈夫以及住院和门诊的部分无关病例进行地贫筛查。检查出阳性者(地贫杂合子携带者)再作常规Hb A2和Hb F检查。Hb A2>4.0%，伴有或不伴有Hb F>2.0%者定β地贫携带者(轻型)。将查出的95例β地贫携带者作为突变型检测对象。另有1个家系:先证者：男性，3岁4个月，原籍广东信宜，1岁时明显贫血，先后4次输血，RBC 1.65×1012/L, Hb 36g/L,HCT 0.115, MCV 69.5fl，地贫一管筛查法脆性30%，α地贫(-),Hb A2 4.8%,Hb F 33.0%，诊断为重型β地贫。先证者弟，1岁7个月，与患儿有同样临床表现，RBC 1.67×1012/L,Hb 37g/L,HCT 0.119,MCV 71.4 fl，脆性43%，α地贫(-)，Hb A2 4.3%, Hb F 41.0%，诊断为重型β地贫。先证者之父脆性17%，Hb A2 6.3%,Hb F 0.8%，α地贫(-)；其母脆性34%，Hb A2 4.4%,Hb F 0.6%,α地贫(-)，均诊断为轻型β地贫。对2个患儿及其父母均进行了突变分析。
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2 研究方法
2.1 地贫一管筛查法脆性：根据试剂盒(购自广州真达科技公司)说明书进行。<60%者初步判断为地贫。
2.2 α地贫诊断法：脆性<60%者，用α地贫东南亚型检测试剂盒(购自广州真达科技公司)检测阳性者，判断为α地贫东南亚型(--sea/)，阴性者暂定为α地贫非东南亚型。
2.3 β地贫的ARMS法检测：
2.3.1 DNA制备：取外周血4～5ml, 蛋白酶K消化，酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀DNA，TE溶解备用。
2.3.2 ARMS法检测：41-42(-4bp)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、17(A→T)、-28(A→G)4种突变采用真达科技公司生产的试剂盒。检测β71-72(+A)突变引物设计如下：
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上游引物：5′-GTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCA-3′；
下游引物：5′-GTGAGCCAGGCCATCACTTTAA-3′。
2.3.3 PCR：反应总体积为25μl，含样本DNA约1μg,10×缓冲液2.5μl,2mmol/L dNTP 2.5μl,引物各20ng,内对照引物各15ng,Taq酶 (加拿大GENDA公司产品) 2U。94℃变性3min后，94℃ 45s,60～63℃ 1min,72℃ 1min,共25～30个循环，72℃延伸5min。10g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
结果和讨论
正常人DNA标本仅见一条196bp的内对照带，β地贫携带者除有196bp的内对照带外，β 41-42/N可见一条453bp带，β 654-2/N突变可见一条817bp带，β 17/N可见一条281bp带，β-28/N可见一条391bp带，71-72/N则可见一条551bp带(图1)。没有内对照带者，表明DNA降解或DNA量不足。
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M: 100bp DNA ladder; 1：正常DNA(含654-2引物)仅有196bp内对照带；
2：654-2/N突变,除内对照带外，有654-2突变的817bp带；
3：正常DNA(含41-42引物),仅有196bp带；4：41-42/N突变，除内对照带外，有41-42(-4bp)突变的453bp带；5：正常DNA(含-28引物)，仅有内对照带；
6：-28突变，除内对照带外，有-28突变的391bp带；7：17/N突变，除内对照带外，有17突变的281bp带； 8：正常DNA(含71-72突变引物),仅有196bp内对照带；
9：71-72突变，除内对照带外，有71-72突变的551bp带
图1 β地贫5种突变的ARMS法检测结果
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本组用ARMS法共检测轻型β地贫95例，查出41-42(-4bp)突变49例(51.6%),IVS-Ⅱ-654(C→T)突变17例(17.9%),17(A→T)突变6例(6.3%), -28(A→G)突变3例(3.2%),71-72(+A)突变2例(2.1%),未检测出突变18例(19.0%)。5种常见突变共77例，占81.1%。
1个重型地贫家系检测结果如图2所示，父亲为41-42突变，母亲为-28突变，2例重型地贫患儿均为41-42/-28突变的双重杂合子。
M：100bp DNA ladder；1：正常DNA；2,4,6：先证者及其父、弟41-42突变检测结果，图示除对照196bp带外，有1条453bp 41-42突变特异性带；
3,5,7：先证者及其母、弟-28突变检测结果，图示除有对照带外，均有-28突变的391bp特异性带
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图2 1个41-42/-28突变的家系检测结果
ARMS又称等位基因特异性扩增(allele specific amplification, ASA)，是一种用来检测已知突变的简易方法，已经在很多遗传病和多态检测中得到应用。也被一些国家或地区推广应用于β地贫的基因型诊断和产前基因诊断。用ARMS法诊断我国β地贫常见突变型已有方法学的报道[1,2]。我们应用已经制成的β地贫ARMS法4种常见突变诊断试剂盒以及我们设计的检测71-72突变的一对引物，检查了95例β地贫的常见突变，获得了满意的结果。对一个重型β地贫家系4例基因型的检测也证明这种检测方法的可行性和可靠性。鉴于这种方法比较经济、简便，一次PCR即刻可以观察结果，值得推广，并进一步积累经验，将其应用于产前基因诊断。在应用试剂盒前，我们已经对包括5种突变在内的18例(包括上述重型地贫家系)进行过ARMS法与RDB法对比观察，获得完全一致的效果。因而本次检测所得结果应该认为是可靠的。应该指出，应用本法可以检测出80%以上的突变, 如果再按此法原理还可设计新的引物检测-29(A→C)突变、HbE等，这样，可以检测更多的突变。即使如此，ARMS法还不能代替能一次检测10多种突变的RDB法，但RDB法有时也不易清楚地观察结果。所以在进行产前基因诊断时，最好同时用RDB法进行对照，将更加安全可靠。
, 百拇医药
本组检测出的5种突变占总例数的82%，较文献中用RDB法检测出的广东群体的92.5%为低[3],与各地中国人合并报道的81.2%[4]相符。广州近年外来人口较多，本组结果与全国不同地区的几个综合报告相符合是可以理解的。
志谢：感谢中山医科大学杜传书教授给予的指导和帮助
参 考 文 献
1，毛跃华，孙琼，李峥，等. 应用多重等位基因特异性PCR技术进行β地中海贫血的基因诊断. 中华医学遗传学杂志， 1995，12:209-211.
2，杜传书，曾瑞萍，任晓琴，等. 用ARMS法检测β地中海贫血C654-2T突变. 中华血液学杂志， 1998，19:544-545.
3，Zhang JZ, Cai SP, He X, et al. Molecular basis of β thalassemia in South China. Strategy for DNA analysis. Hum Genet，1988，78:37-40.
4，Huang SZ, Zhou XD, Zhu H, et al. Detection of β-thalassemia mutations in the Chinese using amplified DNA from dried blood specimens. Hum Genet, 1990,84:129-131.
(收稿日期：2000-02-14), 百拇医药
单位：江悦华 杜琴 李春平 张中芬(510010 广州，广州军区广州总医院优生遗传中心)；陈阳(广东省顺德市桂州医院)
关键词：
中华血液学杂志001011 β地中海贫血(β地贫)是我国南方和西南各省常见的遗传病，从婚前或产前检查中检出β地贫携带者(轻型)并鉴定他们的基因突变类型是降低重型β地贫患儿出生的有效预防方法。已经报告的中国人中β珠蛋白基因突变型已达29种。对于常见突变使用的反向点杂交法(RDB)已经得到广泛应用。毛跃华等[1]报告了多重PCR检测我国常见4种β地贫的突变特异性扩增系统(ARMS)法,杜传书等[2]补充了占第2位的IVS-Ⅱ-654(C→T)突变的ARMS检测法。我们用此法对95例β地贫进行基因型分析，评价其作为常规分子生物学诊断方法的可能性。
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对象和方法
1 检测对象 对本院和顺德桂州医院妇产科正常妊娠妇女及其丈夫以及住院和门诊的部分无关病例进行地贫筛查。检查出阳性者(地贫杂合子携带者)再作常规Hb A2和Hb F检查。Hb A2>4.0%，伴有或不伴有Hb F>2.0%者定β地贫携带者(轻型)。将查出的95例β地贫携带者作为突变型检测对象。另有1个家系:先证者：男性，3岁4个月，原籍广东信宜，1岁时明显贫血，先后4次输血，RBC 1.65×1012/L, Hb 36g/L,HCT 0.115, MCV 69.5fl，地贫一管筛查法脆性30%，α地贫(-),Hb A2 4.8%,Hb F 33.0%，诊断为重型β地贫。先证者弟，1岁7个月，与患儿有同样临床表现，RBC 1.67×1012/L,Hb 37g/L,HCT 0.119,MCV 71.4 fl，脆性43%，α地贫(-)，Hb A2 4.3%, Hb F 41.0%，诊断为重型β地贫。先证者之父脆性17%，Hb A2 6.3%,Hb F 0.8%，α地贫(-)；其母脆性34%，Hb A2 4.4%,Hb F 0.6%,α地贫(-)，均诊断为轻型β地贫。对2个患儿及其父母均进行了突变分析。
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2 研究方法
2.1 地贫一管筛查法脆性：根据试剂盒(购自广州真达科技公司)说明书进行。<60%者初步判断为地贫。
2.2 α地贫诊断法：脆性<60%者，用α地贫东南亚型检测试剂盒(购自广州真达科技公司)检测阳性者，判断为α地贫东南亚型(--sea/)，阴性者暂定为α地贫非东南亚型。
2.3 β地贫的ARMS法检测：
2.3.1 DNA制备：取外周血4～5ml, 蛋白酶K消化，酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀DNA，TE溶解备用。
2.3.2 ARMS法检测：41-42(-4bp)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、17(A→T)、-28(A→G)4种突变采用真达科技公司生产的试剂盒。检测β71-72(+A)突变引物设计如下：
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上游引物：5′-GTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCA-3′；
下游引物：5′-GTGAGCCAGGCCATCACTTTAA-3′。
2.3.3 PCR：反应总体积为25μl，含样本DNA约1μg,10×缓冲液2.5μl,2mmol/L dNTP 2.5μl,引物各20ng,内对照引物各15ng,Taq酶 (加拿大GENDA公司产品) 2U。94℃变性3min后，94℃ 45s,60～63℃ 1min,72℃ 1min,共25～30个循环，72℃延伸5min。10g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
结果和讨论
正常人DNA标本仅见一条196bp的内对照带，β地贫携带者除有196bp的内对照带外，β 41-42/N可见一条453bp带，β 654-2/N突变可见一条817bp带，β 17/N可见一条281bp带，β-28/N可见一条391bp带，71-72/N则可见一条551bp带(图1)。没有内对照带者，表明DNA降解或DNA量不足。
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M: 100bp DNA ladder; 1：正常DNA(含654-2引物)仅有196bp内对照带；
2：654-2/N突变,除内对照带外，有654-2突变的817bp带；
3：正常DNA(含41-42引物),仅有196bp带；4：41-42/N突变，除内对照带外，有41-42(-4bp)突变的453bp带；5：正常DNA(含-28引物)，仅有内对照带；
6：-28突变，除内对照带外，有-28突变的391bp带；7：17/N突变，除内对照带外，有17突变的281bp带； 8：正常DNA(含71-72突变引物),仅有196bp内对照带；
9：71-72突变，除内对照带外，有71-72突变的551bp带
图1 β地贫5种突变的ARMS法检测结果
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本组用ARMS法共检测轻型β地贫95例，查出41-42(-4bp)突变49例(51.6%),IVS-Ⅱ-654(C→T)突变17例(17.9%),17(A→T)突变6例(6.3%), -28(A→G)突变3例(3.2%),71-72(+A)突变2例(2.1%),未检测出突变18例(19.0%)。5种常见突变共77例，占81.1%。
1个重型地贫家系检测结果如图2所示，父亲为41-42突变，母亲为-28突变，2例重型地贫患儿均为41-42/-28突变的双重杂合子。
M：100bp DNA ladder；1：正常DNA；2,4,6：先证者及其父、弟41-42突变检测结果，图示除对照196bp带外，有1条453bp 41-42突变特异性带；
3,5,7：先证者及其母、弟-28突变检测结果，图示除有对照带外，均有-28突变的391bp特异性带
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图2 1个41-42/-28突变的家系检测结果
ARMS又称等位基因特异性扩增(allele specific amplification, ASA)，是一种用来检测已知突变的简易方法，已经在很多遗传病和多态检测中得到应用。也被一些国家或地区推广应用于β地贫的基因型诊断和产前基因诊断。用ARMS法诊断我国β地贫常见突变型已有方法学的报道[1,2]。我们应用已经制成的β地贫ARMS法4种常见突变诊断试剂盒以及我们设计的检测71-72突变的一对引物，检查了95例β地贫的常见突变，获得了满意的结果。对一个重型β地贫家系4例基因型的检测也证明这种检测方法的可行性和可靠性。鉴于这种方法比较经济、简便，一次PCR即刻可以观察结果，值得推广，并进一步积累经验，将其应用于产前基因诊断。在应用试剂盒前，我们已经对包括5种突变在内的18例(包括上述重型地贫家系)进行过ARMS法与RDB法对比观察，获得完全一致的效果。因而本次检测所得结果应该认为是可靠的。应该指出，应用本法可以检测出80%以上的突变, 如果再按此法原理还可设计新的引物检测-29(A→C)突变、HbE等，这样，可以检测更多的突变。即使如此，ARMS法还不能代替能一次检测10多种突变的RDB法，但RDB法有时也不易清楚地观察结果。所以在进行产前基因诊断时，最好同时用RDB法进行对照，将更加安全可靠。
, 百拇医药
本组检测出的5种突变占总例数的82%，较文献中用RDB法检测出的广东群体的92.5%为低[3],与各地中国人合并报道的81.2%[4]相符。广州近年外来人口较多，本组结果与全国不同地区的几个综合报告相符合是可以理解的。
志谢：感谢中山医科大学杜传书教授给予的指导和帮助
参 考 文 献
1，毛跃华，孙琼，李峥，等. 应用多重等位基因特异性PCR技术进行β地中海贫血的基因诊断. 中华医学遗传学杂志， 1995，12:209-211.
2，杜传书，曾瑞萍，任晓琴，等. 用ARMS法检测β地中海贫血C654-2T突变. 中华血液学杂志， 1998，19:544-545.
3，Zhang JZ, Cai SP, He X, et al. Molecular basis of β thalassemia in South China. Strategy for DNA analysis. Hum Genet，1988，78:37-40.
4，Huang SZ, Zhou XD, Zhu H, et al. Detection of β-thalassemia mutations in the Chinese using amplified DNA from dried blood specimens. Hum Genet, 1990,84:129-131.
(收稿日期：2000-02-14), 百拇医药