急性与慢性再生障碍性贫血患者IL-4、IFN-γ及TNF-α诱生水平的对比研究
作者：张涛 孙秉中 冯琦 袁跃传 朱华锋 刘利
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院血液内科
关键词：贫血，再生障碍性；白细胞介素4；干扰素类；肿瘤坏死因子α
中华血液学杂志001007
【摘要】 目的 检测急性和慢性再生障碍性贫血(再障)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)培养上清白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱生水平，了解两组患者免疫学状况的异同点。方法 利用双抗体夹心ELISA法测定BMMNC培养上清中IL-4、IFN-γ和TNF-α的诱生水平，比较两组患者上述细胞因子水平的差异。结果 ① 所有患者IFN-γ、TNF-α水平均增高，与对照组比较，差异有显著性。急性组IL-4大致正常，与对照组比较，差异无显著性；慢性组IL-4水平升高，与对照组比较，差异有显著性。② 在急、慢性组之间，TNF-α水平差异无显著性；但IL-4 、IFN-γ水平差异有显著性。结论 异常细胞免疫效应可能在急性再障发病中起主要作用；慢性再障既可能有细胞免疫增强，又有体液免疫功能亢进。
, 百拇医药
A comparative study on the expressions of IL-4、IFN-γ and TNF-α in BMMNC of acute and chronic aplastic anemia patients
ZHANG Tao SUN Bingzhong FENG Qi
(Department of Hematology, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xian 710032，China)
【Abstract】 Objective To detect the induced levels of IL-4,IFN-γ and TNF-α in the supernatant of bone marrow mononuclear cells (BMMNC) and compare the difference of immune status between acute(SAA) and chronic(CAA) aplastic anemia patients. Methods Concentrations of IL-4、IFN-γ and TNF-α in PHA-P-induced BMMNC supernatants were determined by ELISA assay in 11 SAA and 13 CAA patients as well as 16 controls. Concentration differences between the two groups were compared. Results ① The IFN-γ and TNF-α levels in AA patients studied were much higher than that in controls,and IL-4 levels were normal in SAA group but elevated in CAA group. ② TNF-α levels were comparable between the two AA groups, but both IL-4 and IFN-γ levels were significantly different between them. Conclusion Enhanced cellular immunity seems to play an important role in the pathogenesis of SAA, and enhancement of both cellular and humoral immunity might contribute to the pathogenesis of CAA.
, 百拇医药
【Key words】 Anemia,aplastic； Interleukin-4; Interferons; Tumor necosis factor-alpha
再生障碍性贫血(再障)包括急性和慢性再障70%以上的患者发病与免疫机制有关。骨髓T淋巴细胞亚群异常分布和活化；患者骨髓淋巴细胞及其培养上清和血清，对健康人造血细胞功能有抑制作用，高度提示再障是一种器官特异免疫性疾病[1]。为了解急性和慢性再障免疫状况的差异，以便深入研究其免疫学发病机制，我们对两型患者骨髓单个核细胞(BMMNC)培养上清中，由植物血凝素(PHA-P)诱生的白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平进行了对比研究。
病例和方法
1 病例来源 24例患者来源于第四军医大学及西安医科大学附属医院的初诊再障患者，男性13例，女性11例，年龄15～48岁。其中急性再障(SAA-Ⅰ型)11例,慢性再障13例，发病前无明确诱因，诊断符合全国再障诊断标准[2]。16例对照标本来源于我院胸科非血液病患者开胸手术后的废弃肋骨，术前骨髓形态学检查均系正常髓象。
, 百拇医药
2 试剂来源 IL-4、IFN-γ和TNF-α夹心法ELISA试剂盒及标准品均为Genzyme公司产品；淋巴细胞分离液购自Pharmacia公司；PHA-P为Sigma公司产品。
3 实验方法
3.1 标本采集和BMMNC培养：无菌抽取患者骨髓5～8ml，肝素抗凝；即时从术中离断的肋骨中无菌获取骨髓5～8 ml，肝素抗凝，作为对照。分别以含体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液等量稀释，用淋巴细胞分离液分离出BMMNC，再重悬于培养液中，将细胞浓度调整至2×106/ml，移置24孔培养板中，每孔接种BMMNC 2×106个，在37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱培养。每个病例及对照均设3个复孔。
3.2 PHA-P诱导BMMNC：BMMNC培养过夜后更换培养液，同时添加终浓度为3μg/ml的PHA-P刺激，诱生细胞因子分泌。据预实验，IL-4于培养24h时达高峰，IFN-γ、TNF-α的峰值约在72h，依此在相应时间点收集上清， -20℃冻存待检。
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3.3 细胞因子测定：培养上清中IL-4、IFN-γ和TNF-α均采用双抗体夹心ELISA法检测。分别向IL-4、IFN-γ和TNF-α单抗包被的96孔PVC板每孔加入标准品稀释液或待检样本100μl，均设3个复孔，并设空白及阴性对照孔。稀释浓度和步骤按方法说明。终止反应后即用自动酶标仪测定492nm处的吸光度(A)值。以标准品稀释浓度的对数值为横坐标、A值为纵坐标绘制标准曲线，由样本的A值查出相应的IL-4、IFN-γ和TNF-α含量。用每一病例(或对照)各个细胞因子的9个浓度值的均数，作为该病例或对照的相应细胞因子浓度值。
4 统计方法 数据以
±s表示，组间的比较采用t检验。
结果
BMMNC培养上清中诱生的细胞因子水平检测结果见表1。16例对照标本均有低水平的IL-4、IFN-γ及TNF-α表达。11例急性再障患者PHA-P诱导的BMMNC培养上清中，IFN-γ和TNF-α含量较对照组显著增高(P<0.01)；有3例患者未检出IL-4，8例的IL-4水平与对照组比较，差异无显著性(P>0.O5)。13例慢性再障患者BMMNC培养上清的IL-4、IFN-γ及TNF-α水平较对照组增高(P<0.01)，其中IL-4较急性再障患者显著增高(P<0.01)，IFN-γ与急性组相比，显著降低(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 再障患者BMMNC上清中诱生的细胞因子水平(±s) 组别
例数
IL-4
IFN-γ
TNF-α
阳性例数
浓度(ng/L)
阳性例数
浓度(ng/L)
阳性例数
浓度(ng/L)
, 百拇医药
对照组
16
16
65.04±18.80
16
1174.52±389.47
16
764.17±290.45
急性再障组
11
8
70.17±15.56
, 百拇医药 11
2835.62±1143.50*
11
1843.25±725.12*
慢性再障组
13
13
158.07±30.55*#
13
1953.50±510.71*#
13
, 百拇医药
1752.44±690.27*
注：与对照组比较，*P<0.01；与急性组比较，#P<0.013
讨论
1 据报道，再障患者骨髓及外周血，尤其是骨髓中淋巴细胞活化抗原CD25和HLA-DR表达增高，血浆中及外周血单个核细胞(PBMNC)诱生的IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IFN-α、IFN-γ和TNF-α等因子水平明显上调[3，4]。我们在BMMNC水平进行因子诱生，有针对性地分别检测了主要介导体液免疫和细胞免疫的3种细胞因子IL-4、IFN-γ和TNF-α水平，发现24例再障患者骨髓淋巴细胞分泌IFN-γ及TNF-α均有增加，而IL-4水平仅在慢性再障患者中增高，表明纳入本研究的急、慢性再障患者在骨髓靶器官水平有明显的免疫炎性表现，间接反映了淋巴细胞活化增强，有免疫机能亢进或紊乱，这一结果支持再障发病和免疫机制异常紧密相联的观点。近来有学者报道再障患者骨髓中T细胞呈克隆或寡克隆性活化，能特异抑制和(或)杀伤自体造血干/祖细胞[5]。晚近Nakao等[6]鉴定出表达于患者红系祖细胞膜上、启动自身免疫反应的一种自身靶抗原，这为再障免疫学发病理论的确立提供了直接依据，从而将免疫作用提到了重要高度。
, 百拇医药
2 急、慢性再障患者3种细胞因子水平的差异
急性再障患者BMMNC诱生的TNF-α、IFN-γ水平较对照组和慢性病例明显增高，IL-4水平与对照组相比差异无显著性，表明Th1型细胞因子(TNF-α、IFN-γ)水平上调是其免疫病理反应的显著特征，提示有细胞免疫应答亢进；而Th2型因子IL-4所介导的体液免疫水平似无明显异常，可能在发病时起次要作用，这也许是与慢性再障的主要区别。Young[7]推测获得性再障属Th1型免疫疾病，但尚缺乏在Th1/ Th2层次的研究报道。为把握急、慢性再障免疫异常本质的异同点，我们在现有线索基础上已就此展开研究。
我们发现慢性再障与急性再障显著不同的是,慢性患者BMMNC诱生IL-4水平明显高出对照；IFN-γ增高程度虽不及急性者，但仍显著高于对照；TNF-α水平也明显升高。我们设想，很可能在慢性患者由Th1型因子介导的细胞免疫和Th2型因子介导的体液免疫都增强，两者均参与发病，但前者效应水平较急性型的低。
, 百拇医药
3 我们推测慢性再障既有细胞免疫增强，又有体液免疫亢进，细胞免疫效应则在急性再障发病中起主导作用。然而再障发病的异质性很强，因而应作更细致的研究。人类CD4+Th细胞包含分别介导细胞免疫和体液免疫的两种极化亚群Th1与Th2，Th1/Th2 生理性平衡维系着免疫自稳，某些自身免疫疾病的发生与Th1/Th2失衡有关。这一理论为我们今后的研究提供了新思路，由此可望在Th1、Th2水平了解个例患者及急、慢性再障患者群体的免疫状态，为阐明其发病机制和指导治疗提供依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900062)
参 考 文 献
1，和虹，邵宗鸿.再生障碍性贫血T淋巴细胞研究进展.中华血液学杂志，1999，20：553-555.
2，张之南，沈悌，主编.血液病诊断及疗效标准.第2版.北京：科学出版社，1998.33-38.
, http://www.100md.com
3，曾凤华，沈柏均，时庆，等.再生障碍性贫血患者骨髓T淋巴细胞的研究.中华血液学杂志，1997，18：541-543.
4，王欣，张明珙，宋素琴，等.再生障碍性贫血患者细胞免疫功能与造血细胞因子的研究.中华血液学杂志，1998，19：181-183.
5，Nakao S, Takami A, Takamatsu H,et al.Isolation of a T-cell clone showing HLA-DRB1.0405-restricted cytotoxicity for hematopoietic cells in a patient with aplastic anemia.Blood ,1997，89:3691-3699.
6，Nakao S，Zeng WH，Murata R，et al.Identification of a novel antigen derived from hematopoietic progenitor cells that is recogenized by the immune system of a patient with aplastic anemia.Blood,1999,94(10 Suppl 1):193a.
7，Young NS.Acquired aplastic anemia.JAMA, 1999，282：271-278.
(收稿日期：2000-01-17), http://www.100md.com
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院血液内科
关键词：贫血，再生障碍性；白细胞介素4；干扰素类；肿瘤坏死因子α
中华血液学杂志001007
【摘要】 目的 检测急性和慢性再生障碍性贫血(再障)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)培养上清白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱生水平，了解两组患者免疫学状况的异同点。方法 利用双抗体夹心ELISA法测定BMMNC培养上清中IL-4、IFN-γ和TNF-α的诱生水平，比较两组患者上述细胞因子水平的差异。结果 ① 所有患者IFN-γ、TNF-α水平均增高，与对照组比较，差异有显著性。急性组IL-4大致正常，与对照组比较，差异无显著性；慢性组IL-4水平升高，与对照组比较，差异有显著性。② 在急、慢性组之间，TNF-α水平差异无显著性；但IL-4 、IFN-γ水平差异有显著性。结论 异常细胞免疫效应可能在急性再障发病中起主要作用；慢性再障既可能有细胞免疫增强，又有体液免疫功能亢进。
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A comparative study on the expressions of IL-4、IFN-γ and TNF-α in BMMNC of acute and chronic aplastic anemia patients
ZHANG Tao SUN Bingzhong FENG Qi
(Department of Hematology, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xian 710032，China)
【Abstract】 Objective To detect the induced levels of IL-4,IFN-γ and TNF-α in the supernatant of bone marrow mononuclear cells (BMMNC) and compare the difference of immune status between acute(SAA) and chronic(CAA) aplastic anemia patients. Methods Concentrations of IL-4、IFN-γ and TNF-α in PHA-P-induced BMMNC supernatants were determined by ELISA assay in 11 SAA and 13 CAA patients as well as 16 controls. Concentration differences between the two groups were compared. Results ① The IFN-γ and TNF-α levels in AA patients studied were much higher than that in controls,and IL-4 levels were normal in SAA group but elevated in CAA group. ② TNF-α levels were comparable between the two AA groups, but both IL-4 and IFN-γ levels were significantly different between them. Conclusion Enhanced cellular immunity seems to play an important role in the pathogenesis of SAA, and enhancement of both cellular and humoral immunity might contribute to the pathogenesis of CAA.
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【Key words】 Anemia,aplastic； Interleukin-4; Interferons; Tumor necosis factor-alpha
再生障碍性贫血(再障)包括急性和慢性再障70%以上的患者发病与免疫机制有关。骨髓T淋巴细胞亚群异常分布和活化；患者骨髓淋巴细胞及其培养上清和血清，对健康人造血细胞功能有抑制作用，高度提示再障是一种器官特异免疫性疾病[1]。为了解急性和慢性再障免疫状况的差异，以便深入研究其免疫学发病机制，我们对两型患者骨髓单个核细胞(BMMNC)培养上清中，由植物血凝素(PHA-P)诱生的白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平进行了对比研究。
病例和方法
1 病例来源 24例患者来源于第四军医大学及西安医科大学附属医院的初诊再障患者，男性13例，女性11例，年龄15～48岁。其中急性再障(SAA-Ⅰ型)11例,慢性再障13例，发病前无明确诱因，诊断符合全国再障诊断标准[2]。16例对照标本来源于我院胸科非血液病患者开胸手术后的废弃肋骨，术前骨髓形态学检查均系正常髓象。
, 百拇医药
2 试剂来源 IL-4、IFN-γ和TNF-α夹心法ELISA试剂盒及标准品均为Genzyme公司产品；淋巴细胞分离液购自Pharmacia公司；PHA-P为Sigma公司产品。
3 实验方法
3.1 标本采集和BMMNC培养：无菌抽取患者骨髓5～8ml，肝素抗凝；即时从术中离断的肋骨中无菌获取骨髓5～8 ml，肝素抗凝，作为对照。分别以含体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液等量稀释，用淋巴细胞分离液分离出BMMNC，再重悬于培养液中，将细胞浓度调整至2×106/ml，移置24孔培养板中，每孔接种BMMNC 2×106个，在37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱培养。每个病例及对照均设3个复孔。
3.2 PHA-P诱导BMMNC：BMMNC培养过夜后更换培养液，同时添加终浓度为3μg/ml的PHA-P刺激，诱生细胞因子分泌。据预实验，IL-4于培养24h时达高峰，IFN-γ、TNF-α的峰值约在72h，依此在相应时间点收集上清， -20℃冻存待检。
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3.3 细胞因子测定：培养上清中IL-4、IFN-γ和TNF-α均采用双抗体夹心ELISA法检测。分别向IL-4、IFN-γ和TNF-α单抗包被的96孔PVC板每孔加入标准品稀释液或待检样本100μl，均设3个复孔，并设空白及阴性对照孔。稀释浓度和步骤按方法说明。终止反应后即用自动酶标仪测定492nm处的吸光度(A)值。以标准品稀释浓度的对数值为横坐标、A值为纵坐标绘制标准曲线，由样本的A值查出相应的IL-4、IFN-γ和TNF-α含量。用每一病例(或对照)各个细胞因子的9个浓度值的均数，作为该病例或对照的相应细胞因子浓度值。
4 统计方法 数据以
±s表示，组间的比较采用t检验。结果
BMMNC培养上清中诱生的细胞因子水平检测结果见表1。16例对照标本均有低水平的IL-4、IFN-γ及TNF-α表达。11例急性再障患者PHA-P诱导的BMMNC培养上清中，IFN-γ和TNF-α含量较对照组显著增高(P<0.01)；有3例患者未检出IL-4，8例的IL-4水平与对照组比较，差异无显著性(P>0.O5)。13例慢性再障患者BMMNC培养上清的IL-4、IFN-γ及TNF-α水平较对照组增高(P<0.01)，其中IL-4较急性再障患者显著增高(P<0.01)，IFN-γ与急性组相比，显著降低(P<0.01)。
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表1 再障患者BMMNC上清中诱生的细胞因子水平(
±s) 组别例数
IL-4
IFN-γ
TNF-α
阳性例数
浓度(ng/L)
阳性例数
浓度(ng/L)
阳性例数
浓度(ng/L)
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对照组
16
16
65.04±18.80
16
1174.52±389.47
16
764.17±290.45
急性再障组
11
8
70.17±15.56
, 百拇医药 11
2835.62±1143.50*
11
1843.25±725.12*
慢性再障组
13
13
158.07±30.55*#
13
1953.50±510.71*#
13
, 百拇医药
1752.44±690.27*
注：与对照组比较，*P<0.01；与急性组比较，#P<0.013
讨论
1 据报道，再障患者骨髓及外周血，尤其是骨髓中淋巴细胞活化抗原CD25和HLA-DR表达增高，血浆中及外周血单个核细胞(PBMNC)诱生的IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IFN-α、IFN-γ和TNF-α等因子水平明显上调[3，4]。我们在BMMNC水平进行因子诱生，有针对性地分别检测了主要介导体液免疫和细胞免疫的3种细胞因子IL-4、IFN-γ和TNF-α水平，发现24例再障患者骨髓淋巴细胞分泌IFN-γ及TNF-α均有增加，而IL-4水平仅在慢性再障患者中增高，表明纳入本研究的急、慢性再障患者在骨髓靶器官水平有明显的免疫炎性表现，间接反映了淋巴细胞活化增强，有免疫机能亢进或紊乱，这一结果支持再障发病和免疫机制异常紧密相联的观点。近来有学者报道再障患者骨髓中T细胞呈克隆或寡克隆性活化，能特异抑制和(或)杀伤自体造血干/祖细胞[5]。晚近Nakao等[6]鉴定出表达于患者红系祖细胞膜上、启动自身免疫反应的一种自身靶抗原，这为再障免疫学发病理论的确立提供了直接依据，从而将免疫作用提到了重要高度。
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2 急、慢性再障患者3种细胞因子水平的差异
急性再障患者BMMNC诱生的TNF-α、IFN-γ水平较对照组和慢性病例明显增高，IL-4水平与对照组相比差异无显著性，表明Th1型细胞因子(TNF-α、IFN-γ)水平上调是其免疫病理反应的显著特征，提示有细胞免疫应答亢进；而Th2型因子IL-4所介导的体液免疫水平似无明显异常，可能在发病时起次要作用，这也许是与慢性再障的主要区别。Young[7]推测获得性再障属Th1型免疫疾病，但尚缺乏在Th1/ Th2层次的研究报道。为把握急、慢性再障免疫异常本质的异同点，我们在现有线索基础上已就此展开研究。
我们发现慢性再障与急性再障显著不同的是,慢性患者BMMNC诱生IL-4水平明显高出对照；IFN-γ增高程度虽不及急性者，但仍显著高于对照；TNF-α水平也明显升高。我们设想，很可能在慢性患者由Th1型因子介导的细胞免疫和Th2型因子介导的体液免疫都增强，两者均参与发病，但前者效应水平较急性型的低。
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3 我们推测慢性再障既有细胞免疫增强，又有体液免疫亢进，细胞免疫效应则在急性再障发病中起主导作用。然而再障发病的异质性很强，因而应作更细致的研究。人类CD4+Th细胞包含分别介导细胞免疫和体液免疫的两种极化亚群Th1与Th2，Th1/Th2 生理性平衡维系着免疫自稳，某些自身免疫疾病的发生与Th1/Th2失衡有关。这一理论为我们今后的研究提供了新思路，由此可望在Th1、Th2水平了解个例患者及急、慢性再障患者群体的免疫状态，为阐明其发病机制和指导治疗提供依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900062)
参 考 文 献
1，和虹，邵宗鸿.再生障碍性贫血T淋巴细胞研究进展.中华血液学杂志，1999，20：553-555.
2，张之南，沈悌，主编.血液病诊断及疗效标准.第2版.北京：科学出版社，1998.33-38.
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3，曾凤华，沈柏均，时庆，等.再生障碍性贫血患者骨髓T淋巴细胞的研究.中华血液学杂志，1997，18：541-543.
4，王欣，张明珙，宋素琴，等.再生障碍性贫血患者细胞免疫功能与造血细胞因子的研究.中华血液学杂志，1998，19：181-183.
5，Nakao S, Takami A, Takamatsu H,et al.Isolation of a T-cell clone showing HLA-DRB1.0405-restricted cytotoxicity for hematopoietic cells in a patient with aplastic anemia.Blood ,1997，89:3691-3699.
6，Nakao S，Zeng WH，Murata R，et al.Identification of a novel antigen derived from hematopoietic progenitor cells that is recogenized by the immune system of a patient with aplastic anemia.Blood,1999,94(10 Suppl 1):193a.
7，Young NS.Acquired aplastic anemia.JAMA, 1999，282：271-278.
(收稿日期：2000-01-17), http://www.100md.com