ABC-ELISA法定量检测红细胞相关IgG及临床意义
作者：杨国元 王昌富 张万胜 黄知平 虞咏知 李良凤 鲁志英 邓明凤
单位：434100 湖北省荆州市中心医院血液病研究室
关键词：贫血，溶血性，自身免疫性；Coombs试验；酶联免疫吸附测定
中华血液学杂志001005 【摘要】 目的 寻求一种温抗体型自身免疫性溶血性贫血( WAIHA)的诊断方法，以期提高 WAIHA的诊断率。方法 采用本室建立的亲和素生物素化酶复合物酶联免疫吸附测定(ABC-ELISA)，定量检测红细胞相关IgG(EAIgG)。共检测60名正常人、196例 WAIHA及各类疾病患者的EAIgG值，并与 Coombs试验作比较。结果 WAIHA组患者的EAIgG显著增高，与正常组、非免疫性贫血组及免疫性疾病组的EAIgG值比较，差异有显著性(P<0.01)；44例 WAIHA患者中， 38例Coombs试验阳性，6例阴性。 6例Coombs试验阴性患者，其临床表现典型，对皮质激素治疗反应良好, EAIgG值均显著增高, 可证实为 WAIHA。动态观察12例患者的EAIgG值, 随着病情好转, 血红蛋白、红细胞数上升，网织红细胞数下降，EAIgG量减少。结论 定量检测EAIgG可作为WAIHA的诊断指标之一，对Coombs试验阴性的WAIHA更具有诊断价值，观察EAIgG的动态变化可作为观察疗效和估计预后的指标。
, http://www.100md.com
Quantitative determination of EAIgG by ABC-ELISA and its clinical significance
YANG Guoyuan WANG Changfu ZHANG Wansheng
(Jingzhou City Central Hospital, Jingzhou, Hubei 434100, China)
【Abstract】 Objective To explore a method for diagnosis of autoimmune hemolytic anemia (AIHA) and evaluate its clinical significance. Methods Erythrocyte associated IgG(EAIgG) was quantified in 60 healthy people, 44 patients with warm antibody AIHA (WAIHA), 108 non-immune anemia and 44 other immune diseases (total 256 cases ) by using ABC-ELISA were estimated. Results EAIgG in WAIHA patients were significantly higher than those in other groups (P<0.01). In the 44 WAIHA patients, 38 were Coombs positive and 6 Coombs negative. EAIgG in Coombs negative was significantly high. The dynamic changes of EAIgG in 12 WAIHA patients were observed during treatment. When patient's condition got better, Hb and RBC increased and EAIgG decreased. Conclusion Quantitative detection of EAIgG is an index in the diagnosis of WAIHA, especially in AIHA with negative Coombs' test. It is also a useful factor for evaluating therapeutic effect and prognosis in WAIHA.
, 百拇医药
【Key words】 Anemia, hemolytic, autoimmune； Coombs test； ELISA
自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是一类由抗体与红细胞抗原结合，及(或)有补体介入，导致红细胞破坏增多而引起的溶血性贫血(溶贫)。使用Coombs试验诊断AIHA，因检出红细胞表面抗体的敏感性所限，有时漏诊。我们建立亲和素生物素化酶复合物酶联免疫吸附测定(ABC-ELISA)，定量检测红细胞相关 IgG(EAIgG)，检测60名健康人、 196例温抗体型AIHA(WAIHA)及其它疾病患者的EAIgG值, 并与Coombs试验作比较，探讨其在 WAIHA诊断、治疗中的临床应用价值，现报道如下。
对象和方法
1 检测对象 正常对照组60名，其中献血员、学生各30名；男39名，女21名；年龄18～49岁，血红蛋白男性>120g/L, 女性>105g/L。温抗体型AIHA(WAIHA ) 44例，系本院1988年1月～1999年6月收治的患者，依据张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》确诊，其中男6例，女38例；原发性32例，继发性12例[系统性红斑狼疮(SLE)9 例，肾病综合征2例，类风湿性关节炎 1例]；同时合并血小板减少(Evans综合征)6例。Hb (31～78)g/L, RBC (1.25～2.89)×1012/L, BPC (40～225)×109/L, Ret 0.050～0.250，网织红细胞绝对值(107～375 )×109/L。非免疫性贫血组108例。免疫性疾病组44例。后两组病例均经临床、血常规、骨髓象及其它有关检查确诊，详细情况见表1。
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表1 正常人及各组患者EAIgG值(fg/红细胞，
±s) 组别
例数
EAIgG值
P1值
P2值
正常组
60
0.26±0.12
WAIHA组
44
2.86±1.63
, 百拇医药
<0.001
非免疫性贫血组
108
缺铁性贫血
41
0.35±0.25
>0.05
<0.01
慢性再生障碍性贫血
19
0.27±0.14
>0.05
<0.01
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血液系统肿瘤
17
0.39±0.35
>0.05
<0.01
其它溶血性贫血
10
0.22±0.08
>0.05
<0.01
MDS
7
0.40±0.29
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>0.05
<0.01
巨幼细胞性贫血
2
0.22±0.02
>0.05
<0.01
肾性贫血
8
0.47±0.16
>0.05
<0.01
肝硬化脾功能亢进
, 百拇医药
4
0.35±0.14
>0.05
<0.01
免疫性疾病
44
ITP
25
0.79±0.60
<0.01
<0.01
SLE
14
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0.94±1.07
<0.01
<0.01
其它
5
0.80±0.30
<0.01
<0.01
注:P1值为与正常组比较，P2值为与WAIHA组比较；血液系统肿瘤包括急性白血病9例，淋巴瘤 5例，多发性骨髓瘤1例，恶组1例,窦组织细胞增生性巨淋巴结病1例；其它溶血性贫血包括先天性非球形红细胞增多症2例，β地中海贫血3例，阵发性睡眠性血红蛋白尿2例，原因未明溶贫3例；SLE中不包括合并溶血性贫血的患者；其它包括皮肌炎3 例，类风湿性关节炎2例2 检测方法 ABC-ELISA法，按文献[1]方法。
, 百拇医药
原理：采用竞争性抑制法原理，将等量的人IgG包被于酶标反应板的微孔内，分别加入系列标准人IgG和待测的红细胞悬液，再加入定量生物素化鼠抗人IgG (b-MAHG)，因标准人IgG或EAIgG的竞争，抑制部分b-MAHG与固相人IgG结合。结合于固相的b-MAHG连接 ABC，后者作用于底物显色，其色泽深度与系列标准人IgG成反比，以标准吸光度查标准曲线，即知EAIgG含量。
3 统计学方法 均值比较采用t检验。
结果
1 EAIgG测定结果 见表1。
2 Coombs试验检查结果 44例WAIHA患者中, 38例Coombs试验阳性，其EAIgG值为(2.69±1.60) fg/红细胞,6例Coombs试验阴性, 其EAIgG值分别为1.5，5.6，5.3， 5.0，3.8，2.4fg/红细胞[(3.93±1.68) fg/红细胞], 两组相比，差异无显著性(P>0.05)。非免疫性贫血组检查81例及免疫性疾病组检查42例，均为阴性。
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3 EAIgG与病情的关系 对12例WAIHA患者治疗前后进行观察，以血红蛋白、红细胞计数、网织红细胞计数、EAgIG值作为观察指标，治疗前血红蛋白均值为49 g/L，红细胞数为1.73×1012/L，网织红细胞绝对值为196×109/L，EAIgG值为2.90 fg/红细胞，治疗后随病情好转，血红蛋白上升为115 g/L，红细胞上升为 3.81×1012/L，而网织红细胞绝对值下降为87×109/L，EAIgG值减少为0.69 fg/红细胞，以上各值治疗前后比较, 差异均有显著性(P<0.01)。其中2例分别于半年和2年后复发，再次出现贫血，EAIgG值再度升高, 1例由0.55 fg/红细胞升高为2.00 fg/红细胞，1例由0.75 fg/红细胞升高为1.40 fg/红细胞。
讨论
Coombs试验是诊断WAIHA的经典方法，但不够敏感，有时出现漏诊，漏诊率为10%～30%[1]。近年来已发展了多种定量检测EAIgG的新技术以协助诊断[2]。我们建立ABC-ELISA法，定量检测EAIgG，其正常上限为0.5 fg/红细胞 (+2s)。44例WAIHA的EAIgG值为(2.86±1.63) fg/红细胞(0.9～7.4 fg/红细胞), 与正常组比较, 差异极为显著(P<0.001); 非免疫性贫血组中各组EAIgG值与正常组比较，差异均无显著性(P>0.05)；免疫性疾病组中各组EAIgG值与正常组及WAIHA组比较，差异亦有显著性(P<0.01)，故EAIgG值可作为WAIHA诊断指标之一。免疫性疾病的EAIgG值虽轻度增高，但与WAIHA组比较, 差异有显著性，故本组检测结果说明EAIgG值增高对WAIHA诊断的敏感性高，再结合临床表现，可作出确切判断。
, 百拇医药
多年来学者们对Coombs试验阴性的AIHA引起重视，此类患者有的病情严重，Hb<30 g/L，甚至呈溶血危象，但常规Coombs试验呈阴性，一般认为是由于红细胞上抗体浓度过低，未能达到 Coombs 试验所能检测的阈值范围[3]。有人认为即使红细胞上有相当数量抗体足以使溶贫发生发展，但由于抗体位置或分布不同，Coombs试验也可能阴性。也有推测可能是急性溶血后大量致敏红细胞被破坏，使Coombs试验敏感性下降所致[4]。对于Coombs试验阴性的WAIHA检测方法的探讨也是研究的重点，但迄今未有简便易行的方法可供推广应用。本组Coombs 试验阳性38例，阴性6例，阴性病例的EAIgG明显升高，分别为1.5，5.6，5.3，5.0，3.8，2.4 fg/红细胞[(3.39±1.68 ) fg/红细胞]，结合其临床表现，给予肾上腺皮质激素治疗，疗效均显著，从而证实了WAIHA的诊断。本组Coombs试验假阴性率为13.6%，而EAIgG值全部增高，其诊断敏感性为100%，故采用本法检测EAIgG，对于Coombs试验阴性的WAIHA，更具有诊断价值。
, 百拇医药
动态观察12例 WAIHA患者治疗前后EAIgG值的变化，显示EAIgG值与血红蛋白浓度、红细胞数及网织红细胞绝对值有明显的相关性，治疗显效者，血红蛋白、红细胞上升，网织红细胞绝对值下降，EAIgG值减低，而2例患者在病情复发时随着血红蛋白、红细胞下降，EAIgG值又再度升高，故动态观察EAIgG值可作为观察疗效和估计预后的指标。
参 考 文 献
1，王昌富，杨国元，张国明，等.亲和素生物素化酶复合物-ELISA法定量检测红细胞相关IgG.中国实验血液学杂志，1994，2：96-98.
2，王昌富. 红细胞相关Ig检测进展.上海医学检验杂志，1991，6：52-54.
3，李家增，王鸿利，韩忠朝, 主编.血液实验学.上海：上海科学技术出版社，1997. 231-232.
4，Zupanski B, Sokol RJ, Booker DJ, et al. Erythrocyte autoantibodies, the monocyte monolayer assay and in vivo haemolysis. Br J Haematol, 1993, 84：144-150.
5，周有宁，林宝爵.328例AIHA及实验指标分析.中华血液学杂志，1997，18：549-550.
(收稿日期：1999-12-01), 百拇医药
单位：434100 湖北省荆州市中心医院血液病研究室
关键词：贫血，溶血性，自身免疫性；Coombs试验；酶联免疫吸附测定
中华血液学杂志001005 【摘要】 目的 寻求一种温抗体型自身免疫性溶血性贫血( WAIHA)的诊断方法，以期提高 WAIHA的诊断率。方法 采用本室建立的亲和素生物素化酶复合物酶联免疫吸附测定(ABC-ELISA)，定量检测红细胞相关IgG(EAIgG)。共检测60名正常人、196例 WAIHA及各类疾病患者的EAIgG值，并与 Coombs试验作比较。结果 WAIHA组患者的EAIgG显著增高，与正常组、非免疫性贫血组及免疫性疾病组的EAIgG值比较，差异有显著性(P<0.01)；44例 WAIHA患者中， 38例Coombs试验阳性，6例阴性。 6例Coombs试验阴性患者，其临床表现典型，对皮质激素治疗反应良好, EAIgG值均显著增高, 可证实为 WAIHA。动态观察12例患者的EAIgG值, 随着病情好转, 血红蛋白、红细胞数上升，网织红细胞数下降，EAIgG量减少。结论 定量检测EAIgG可作为WAIHA的诊断指标之一，对Coombs试验阴性的WAIHA更具有诊断价值，观察EAIgG的动态变化可作为观察疗效和估计预后的指标。
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Quantitative determination of EAIgG by ABC-ELISA and its clinical significance
YANG Guoyuan WANG Changfu ZHANG Wansheng
(Jingzhou City Central Hospital, Jingzhou, Hubei 434100, China)
【Abstract】 Objective To explore a method for diagnosis of autoimmune hemolytic anemia (AIHA) and evaluate its clinical significance. Methods Erythrocyte associated IgG(EAIgG) was quantified in 60 healthy people, 44 patients with warm antibody AIHA (WAIHA), 108 non-immune anemia and 44 other immune diseases (total 256 cases ) by using ABC-ELISA were estimated. Results EAIgG in WAIHA patients were significantly higher than those in other groups (P<0.01). In the 44 WAIHA patients, 38 were Coombs positive and 6 Coombs negative. EAIgG in Coombs negative was significantly high. The dynamic changes of EAIgG in 12 WAIHA patients were observed during treatment. When patient's condition got better, Hb and RBC increased and EAIgG decreased. Conclusion Quantitative detection of EAIgG is an index in the diagnosis of WAIHA, especially in AIHA with negative Coombs' test. It is also a useful factor for evaluating therapeutic effect and prognosis in WAIHA.
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【Key words】 Anemia, hemolytic, autoimmune； Coombs test； ELISA
自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是一类由抗体与红细胞抗原结合，及(或)有补体介入，导致红细胞破坏增多而引起的溶血性贫血(溶贫)。使用Coombs试验诊断AIHA，因检出红细胞表面抗体的敏感性所限，有时漏诊。我们建立亲和素生物素化酶复合物酶联免疫吸附测定(ABC-ELISA)，定量检测红细胞相关 IgG(EAIgG)，检测60名健康人、 196例温抗体型AIHA(WAIHA)及其它疾病患者的EAIgG值, 并与Coombs试验作比较，探讨其在 WAIHA诊断、治疗中的临床应用价值，现报道如下。
对象和方法
1 检测对象 正常对照组60名，其中献血员、学生各30名；男39名，女21名；年龄18～49岁，血红蛋白男性>120g/L, 女性>105g/L。温抗体型AIHA(WAIHA ) 44例，系本院1988年1月～1999年6月收治的患者，依据张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》确诊，其中男6例，女38例；原发性32例，继发性12例[系统性红斑狼疮(SLE)9 例，肾病综合征2例，类风湿性关节炎 1例]；同时合并血小板减少(Evans综合征)6例。Hb (31～78)g/L, RBC (1.25～2.89)×1012/L, BPC (40～225)×109/L, Ret 0.050～0.250，网织红细胞绝对值(107～375 )×109/L。非免疫性贫血组108例。免疫性疾病组44例。后两组病例均经临床、血常规、骨髓象及其它有关检查确诊，详细情况见表1。
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表1 正常人及各组患者EAIgG值(fg/红细胞，
±s) 组别例数
EAIgG值
P1值
P2值
正常组
60
0.26±0.12
WAIHA组
44
2.86±1.63
, 百拇医药
<0.001
非免疫性贫血组
108
缺铁性贫血
41
0.35±0.25
>0.05
<0.01
慢性再生障碍性贫血
19
0.27±0.14
>0.05
<0.01
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血液系统肿瘤
17
0.39±0.35
>0.05
<0.01
其它溶血性贫血
10
0.22±0.08
>0.05
<0.01
MDS
7
0.40±0.29
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>0.05
<0.01
巨幼细胞性贫血
2
0.22±0.02
>0.05
<0.01
肾性贫血
8
0.47±0.16
>0.05
<0.01
肝硬化脾功能亢进
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4
0.35±0.14
>0.05
<0.01
免疫性疾病
44
ITP
25
0.79±0.60
<0.01
<0.01
SLE
14
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0.94±1.07
<0.01
<0.01
其它
5
0.80±0.30
<0.01
<0.01
注:P1值为与正常组比较，P2值为与WAIHA组比较；血液系统肿瘤包括急性白血病9例，淋巴瘤 5例，多发性骨髓瘤1例，恶组1例,窦组织细胞增生性巨淋巴结病1例；其它溶血性贫血包括先天性非球形红细胞增多症2例，β地中海贫血3例，阵发性睡眠性血红蛋白尿2例，原因未明溶贫3例；SLE中不包括合并溶血性贫血的患者；其它包括皮肌炎3 例，类风湿性关节炎2例2 检测方法 ABC-ELISA法，按文献[1]方法。
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原理：采用竞争性抑制法原理，将等量的人IgG包被于酶标反应板的微孔内，分别加入系列标准人IgG和待测的红细胞悬液，再加入定量生物素化鼠抗人IgG (b-MAHG)，因标准人IgG或EAIgG的竞争，抑制部分b-MAHG与固相人IgG结合。结合于固相的b-MAHG连接 ABC，后者作用于底物显色，其色泽深度与系列标准人IgG成反比，以标准吸光度查标准曲线，即知EAIgG含量。
3 统计学方法 均值比较采用t检验。
结果
1 EAIgG测定结果 见表1。
2 Coombs试验检查结果 44例WAIHA患者中, 38例Coombs试验阳性，其EAIgG值为(2.69±1.60) fg/红细胞,6例Coombs试验阴性, 其EAIgG值分别为1.5，5.6，5.3， 5.0，3.8，2.4fg/红细胞[(3.93±1.68) fg/红细胞], 两组相比，差异无显著性(P>0.05)。非免疫性贫血组检查81例及免疫性疾病组检查42例，均为阴性。
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3 EAIgG与病情的关系 对12例WAIHA患者治疗前后进行观察，以血红蛋白、红细胞计数、网织红细胞计数、EAgIG值作为观察指标，治疗前血红蛋白均值为49 g/L，红细胞数为1.73×1012/L，网织红细胞绝对值为196×109/L，EAIgG值为2.90 fg/红细胞，治疗后随病情好转，血红蛋白上升为115 g/L，红细胞上升为 3.81×1012/L，而网织红细胞绝对值下降为87×109/L，EAIgG值减少为0.69 fg/红细胞，以上各值治疗前后比较, 差异均有显著性(P<0.01)。其中2例分别于半年和2年后复发，再次出现贫血，EAIgG值再度升高, 1例由0.55 fg/红细胞升高为2.00 fg/红细胞，1例由0.75 fg/红细胞升高为1.40 fg/红细胞。
讨论
Coombs试验是诊断WAIHA的经典方法，但不够敏感，有时出现漏诊，漏诊率为10%～30%[1]。近年来已发展了多种定量检测EAIgG的新技术以协助诊断[2]。我们建立ABC-ELISA法，定量检测EAIgG，其正常上限为0.5 fg/红细胞 (
+2s)。44例WAIHA的EAIgG值为(2.86±1.63) fg/红细胞(0.9～7.4 fg/红细胞), 与正常组比较, 差异极为显著(P<0.001); 非免疫性贫血组中各组EAIgG值与正常组比较，差异均无显著性(P>0.05)；免疫性疾病组中各组EAIgG值与正常组及WAIHA组比较，差异亦有显著性(P<0.01)，故EAIgG值可作为WAIHA诊断指标之一。免疫性疾病的EAIgG值虽轻度增高，但与WAIHA组比较, 差异有显著性，故本组检测结果说明EAIgG值增高对WAIHA诊断的敏感性高，再结合临床表现，可作出确切判断。, 百拇医药
多年来学者们对Coombs试验阴性的AIHA引起重视，此类患者有的病情严重，Hb<30 g/L，甚至呈溶血危象，但常规Coombs试验呈阴性，一般认为是由于红细胞上抗体浓度过低，未能达到 Coombs 试验所能检测的阈值范围[3]。有人认为即使红细胞上有相当数量抗体足以使溶贫发生发展，但由于抗体位置或分布不同，Coombs试验也可能阴性。也有推测可能是急性溶血后大量致敏红细胞被破坏，使Coombs试验敏感性下降所致[4]。对于Coombs试验阴性的WAIHA检测方法的探讨也是研究的重点，但迄今未有简便易行的方法可供推广应用。本组Coombs 试验阳性38例，阴性6例，阴性病例的EAIgG明显升高，分别为1.5，5.6，5.3，5.0，3.8，2.4 fg/红细胞[(3.39±1.68 ) fg/红细胞]，结合其临床表现，给予肾上腺皮质激素治疗，疗效均显著，从而证实了WAIHA的诊断。本组Coombs试验假阴性率为13.6%，而EAIgG值全部增高，其诊断敏感性为100%，故采用本法检测EAIgG，对于Coombs试验阴性的WAIHA，更具有诊断价值。
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动态观察12例 WAIHA患者治疗前后EAIgG值的变化，显示EAIgG值与血红蛋白浓度、红细胞数及网织红细胞绝对值有明显的相关性，治疗显效者，血红蛋白、红细胞上升，网织红细胞绝对值下降，EAIgG值减低，而2例患者在病情复发时随着血红蛋白、红细胞下降，EAIgG值又再度升高，故动态观察EAIgG值可作为观察疗效和估计预后的指标。
参 考 文 献
1，王昌富，杨国元，张国明，等.亲和素生物素化酶复合物-ELISA法定量检测红细胞相关IgG.中国实验血液学杂志，1994，2：96-98.
2，王昌富. 红细胞相关Ig检测进展.上海医学检验杂志，1991，6：52-54.
3，李家增，王鸿利，韩忠朝, 主编.血液实验学.上海：上海科学技术出版社，1997. 231-232.
4，Zupanski B, Sokol RJ, Booker DJ, et al. Erythrocyte autoantibodies, the monocyte monolayer assay and in vivo haemolysis. Br J Haematol, 1993, 84：144-150.
5，周有宁，林宝爵.328例AIHA及实验指标分析.中华血液学杂志，1997，18：549-550.
(收稿日期：1999-12-01), 百拇医药