骨髓单个核细胞抗人球蛋白分型试验
作者：和虹 邵宗鸿 曹增 田鹏 崔文 刘鸿 宋鲁燕 孙娟贾海蓉 储榆林 钱林生 杨天楹
单位：300020 天津，中国医学科学院、中国协和医科大学 血液学研究所、血液病医院
关键词：
中华血液学杂志001016 我们应用经典的直接抗人球蛋白试验(Coombs试验)的原理和方法[1，2]，以骨髓单个核细胞(BMMNC)悬液取代红细胞悬液作Coombs分型试验(BMMNC-Coombs)，结果发现，一部分经典Coombs分型试验阴性的血细胞减少症患者BMMNC-Coombs分型试验阳性。现将方法及结果报告如下。
对象和方法
1 检测对象
1.1 阳性对照组： 5例，男2例，女3 例，中位年龄42岁 (35～72 岁)，均为Coombs 试验阳性的自身免疫性溶血性贫血(AIHA)患者。
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1.2 阴性对照组： 47例，男 22例，女25 例，中位年龄31 岁 (7～55 岁)。其中正常人4名及各种诊断明确的血细胞减少患者33例[包括再生障碍性贫血(再障)16 例、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH) 6例、骨髓增生异常综合征(MDS)11例]、缺铁性贫血(IDA) 4例、叶酸或维生素B12缺乏性巨幼细胞贫血患者4例及慢性病贫血(ACD)2例。
1.3 实验组： 不易诊断的血细胞减少症患者24例，男11 例，女13 例，中位年龄29 岁( 9～52岁)，表现为全血细胞减少19例，单纯贫血2例，贫血合并血小板减少2例，贫血合并白细胞减少1例。
1.4 所有检测对象均按常规方法取静脉血1 ml及骨髓4.5 ml，肝素抗凝。
2 试剂 特异性羊抗人IgG血清、抗人C3血清、抗人IgM血清、抗人IgA血清均购自Sigma公司，淋巴细胞分离液为本所产品。
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3 BMMNC-Coombs试验
3.1 原理： 应用经典的直接Coombs试验的原理，即自身抗体能与表面附有相应抗原的靶细胞(BMMNC)结合，使BMMNC致敏而不发生凝集，待加入抗人球蛋白血清后，抗球蛋白抗体与BMMNC上结合的抗体结合，使BMMNC发生凝集反应。
3.2 方法：
3.2.1 把特异性羊抗人IgG血清、抗人C3血清、抗人IgM血清、抗人IgA血清各稀释成最适稀释度作为工作液。
3.2.2 外周血红细胞(PBRBC)及骨髓红细胞(BMRBC)悬液
的配制：分别取检测对象的外周血和骨髓液各0.5ml,用8ml生理盐水洗涤,离心(1500r/min,10min)弃上清，重复3次后用生理盐水配成(2～3)×107/ml PBRBC和BMRBC悬液待用。
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3.2.3 BMMNC悬液的配制： 取骨髓液4ml,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(MNC)(1800r/min,20min),吸取白膜层,用8ml生理盐水洗涤,离心(1500r/min,10min)弃上清,重复4次后用生理盐水配成(4～5)×106/ml细胞悬液待用。
4 在玻璃板上加工作液各10μl, 然后各加入10μl 配制好的细胞悬液，混匀后将玻璃板放入饱和湿度盒中，将盒置37℃恒温水浴箱中温育30min后，在显微镜下观察结果。阳性结果判断按经典Coombs试验常规[2]进行。
结果
1 阳性率 阳性对照组5例，PBRBC、BMRBC及BMMNC Coombs试验均为阳性；阴性对照组47例，PBRBC、BMRBC及BMMNC Coombs试验均为阴性；实验组24例，PBRBC、BMRBC Coombs试验均为阴性，BMMNC Coombs试验阳性17例。
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2 BMMNC-Coombs分型 BMMNC-Coombs阳性17例患者中单纯IgG阳性8例，单纯C3阳性3例，IgG+C3 3例，IgG+IgM 1例，IgG +IgM+C3 1例，IgG+C3+IgM+IgA 1例。
讨论
临床工作中我们观察到一类血细胞减少患者，骨髓增生以活跃及明显活跃为主，尤其是红系比值偏高。溶血方面检查包括结合珠蛋白(HP)，血浆游离血红蛋白(F-Hb)，抗人球蛋白分型试验(Coombs分型)，单抗Coombs亚型试验，冷凝集素试验，冷热溶血试验，酸化血清溶血(Ham)试验，糖水溶血试验，蛇毒因子溶血试验(CoF)，微量补体溶血敏感试验(mCLST)，尿含铁血黄素试验(Rous)，酸化甘油溶血试验(AGLT 50)，渗透脆性试验(OF)，红细胞膜蛋白电泳，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、丙酮酸激酶(PK)荧光斑点试验，血红蛋白电泳，抗碱血红蛋白和血红蛋白A2的定量试验，变性珠蛋白小体生成试验，异丙醇沉淀试验，热不稳定试验，红细胞及粒细胞CD55、CD59检查，均不能确定诊断。部分患者血清间接胆红素偏高，试用肾上腺皮质激素有快速、明显疗效。证明这类患者存在溶血或血细胞破坏。
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由于现有溶血试验的局限性，可能有一部分溶血性贫血的患者难以找到发生溶血的原因[3，4]。曾有报道，年轻及年老的成熟红细胞上结合的抗体量不同[5]，Herron等[6]又提出在一些患者中可能存在针对网织红细胞的特异性抗体, Liesveld等[7]推测部分患者可能存在针对有核红细胞抗体，但尚未见到有关直接证据的报道。众所周知，现有的溶血试验多以成熟红细胞作为检测对象，若抗体是针对骨髓内的造血细胞,溶血(或细胞破坏)发生在血细胞生成的较早期，仅凭经典Coombs试验则不可能查到溶血的证据。
为寻找该类患者血细胞减少的原因，我们用BMRBC及BMMNC取代PBRBC做Coombs试验，检测吸附在BMRBC及BMMNC上的抗体，结果发现，5例AIHA患者(阳性对照)PBRBC、BMRBC及BMMNC Coombs试验均阳性，说明这5例患者的自身抗体不仅仅是结合在成熟红细胞上，而且还结合在BMMNC上。是否有一部分AIHA患者以破坏成熟红细胞为主，BMMNC-Coombs试验阴性？临床工作中患者一旦常规Coombs试验阳性，AIHA诊断确定，一般不再行骨髓检查，故该组病例数少，随病例数的增加，有望得到更为全面的结论。阴性对照组47例PBRBC、BMRBC及BMMNC Coombs试验均阴性。实验组24例中17例(70.8%)BMMNC-Coombs试验阳性，而PBRBC及BMRBC Coombs试验均为阴性，说明BMMNC-Coombs试验阳性患者存在针对BMMNC(包括有核红细胞、早期粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及造血干/祖细胞等细胞群)的自身抗体。我们报告的这组临床不易诊断的血细胞减少患者中有7例BMMNC-Coombs分型试验阴性，原因可能与做BMMNC-Coombs分型试验前部分患者已用肾上腺皮质激素治疗、BMMNC-Coombs分型试验灵敏度不够及疾病本身可能与自身抗体并不相关等因素有关，须积累更多的病例，并进一步完善此实验。至于BMMNC-Coombs试验阳性患者的自身抗体是结合在所有BMMNC上，还是有核红细胞上？尚须做进一步深入的研究才能证实。
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总之，BMMNC-Coombs分型试验可弥补常规Coombs 分型试验仅检测成熟红细胞的自身抗体的不足，为血细胞减少患者的诊断和鉴别诊断提供又一实验依据，对减少误诊，使患者得到及时、有效的治疗有重要意义，且实验方法简单易行，任何可作Coombs 试验的单位均可开展，建议对不易诊断的血细胞减少患者试用BMMNC-Coombs分型试验。
参 考 文 献
1，李家增,王鸿利,韩忠朝,主编.血液实验学.第1版.上海: 上海科学技术出版社,1997. 227-228.
2，王永才, 主编.血液病确诊化验诊断. 第1版.大连: 大连出版社,1997. 155-160.
3，丁训杰.我国温抗体型自身免疫性溶血性贫血的研究现状和方向.中华血液学杂志,1999,20:509-510.
, 百拇医药
4，李孜,邵宗鸿.自身免疫性溶血性贫血研究进展.国外医学输血及血液学分册,1999,22:106-109.
5，Branch DR, Shulman IA, Hian ALSS, et al. Two distinct categories of warm autoantibody reactivity with age-fraction red cells. Blood, 1984, 63:177-180.
6，Herron R，Clark M，Smith S.An antibody with activity dependent on red cell age in the serum of a patient with autoimmune haemolytic anaemia and a negative direct antiglobulin test. Vax Sang,1987,52:71-74.
7，Liesveld JL,Rowe JM,Lichtman M. Variability of the erythropoietic response in autoimmue hemolytic anemia: analysis of 109 cases. Blood,1987,69:820-826.
(收稿日期：2000-04-18), 百拇医药
单位：300020 天津，中国医学科学院、中国协和医科大学 血液学研究所、血液病医院
关键词：
中华血液学杂志001016 我们应用经典的直接抗人球蛋白试验(Coombs试验)的原理和方法[1，2]，以骨髓单个核细胞(BMMNC)悬液取代红细胞悬液作Coombs分型试验(BMMNC-Coombs)，结果发现，一部分经典Coombs分型试验阴性的血细胞减少症患者BMMNC-Coombs分型试验阳性。现将方法及结果报告如下。
对象和方法
1 检测对象
1.1 阳性对照组： 5例，男2例，女3 例，中位年龄42岁 (35～72 岁)，均为Coombs 试验阳性的自身免疫性溶血性贫血(AIHA)患者。
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1.2 阴性对照组： 47例，男 22例，女25 例，中位年龄31 岁 (7～55 岁)。其中正常人4名及各种诊断明确的血细胞减少患者33例[包括再生障碍性贫血(再障)16 例、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH) 6例、骨髓增生异常综合征(MDS)11例]、缺铁性贫血(IDA) 4例、叶酸或维生素B12缺乏性巨幼细胞贫血患者4例及慢性病贫血(ACD)2例。
1.3 实验组： 不易诊断的血细胞减少症患者24例，男11 例，女13 例，中位年龄29 岁( 9～52岁)，表现为全血细胞减少19例，单纯贫血2例，贫血合并血小板减少2例，贫血合并白细胞减少1例。
1.4 所有检测对象均按常规方法取静脉血1 ml及骨髓4.5 ml，肝素抗凝。
2 试剂 特异性羊抗人IgG血清、抗人C3血清、抗人IgM血清、抗人IgA血清均购自Sigma公司，淋巴细胞分离液为本所产品。
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3 BMMNC-Coombs试验
3.1 原理： 应用经典的直接Coombs试验的原理，即自身抗体能与表面附有相应抗原的靶细胞(BMMNC)结合，使BMMNC致敏而不发生凝集，待加入抗人球蛋白血清后，抗球蛋白抗体与BMMNC上结合的抗体结合，使BMMNC发生凝集反应。
3.2 方法：
3.2.1 把特异性羊抗人IgG血清、抗人C3血清、抗人IgM血清、抗人IgA血清各稀释成最适稀释度作为工作液。
3.2.2 外周血红细胞(PBRBC)及骨髓红细胞(BMRBC)悬液
的配制：分别取检测对象的外周血和骨髓液各0.5ml,用8ml生理盐水洗涤,离心(1500r/min,10min)弃上清，重复3次后用生理盐水配成(2～3)×107/ml PBRBC和BMRBC悬液待用。
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3.2.3 BMMNC悬液的配制： 取骨髓液4ml,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(MNC)(1800r/min,20min),吸取白膜层,用8ml生理盐水洗涤,离心(1500r/min,10min)弃上清,重复4次后用生理盐水配成(4～5)×106/ml细胞悬液待用。
4 在玻璃板上加工作液各10μl, 然后各加入10μl 配制好的细胞悬液，混匀后将玻璃板放入饱和湿度盒中，将盒置37℃恒温水浴箱中温育30min后，在显微镜下观察结果。阳性结果判断按经典Coombs试验常规[2]进行。
结果
1 阳性率 阳性对照组5例，PBRBC、BMRBC及BMMNC Coombs试验均为阳性；阴性对照组47例，PBRBC、BMRBC及BMMNC Coombs试验均为阴性；实验组24例，PBRBC、BMRBC Coombs试验均为阴性，BMMNC Coombs试验阳性17例。
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2 BMMNC-Coombs分型 BMMNC-Coombs阳性17例患者中单纯IgG阳性8例，单纯C3阳性3例，IgG+C3 3例，IgG+IgM 1例，IgG +IgM+C3 1例，IgG+C3+IgM+IgA 1例。
讨论
临床工作中我们观察到一类血细胞减少患者，骨髓增生以活跃及明显活跃为主，尤其是红系比值偏高。溶血方面检查包括结合珠蛋白(HP)，血浆游离血红蛋白(F-Hb)，抗人球蛋白分型试验(Coombs分型)，单抗Coombs亚型试验，冷凝集素试验，冷热溶血试验，酸化血清溶血(Ham)试验，糖水溶血试验，蛇毒因子溶血试验(CoF)，微量补体溶血敏感试验(mCLST)，尿含铁血黄素试验(Rous)，酸化甘油溶血试验(AGLT 50)，渗透脆性试验(OF)，红细胞膜蛋白电泳，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、丙酮酸激酶(PK)荧光斑点试验，血红蛋白电泳，抗碱血红蛋白和血红蛋白A2的定量试验，变性珠蛋白小体生成试验，异丙醇沉淀试验，热不稳定试验，红细胞及粒细胞CD55、CD59检查，均不能确定诊断。部分患者血清间接胆红素偏高，试用肾上腺皮质激素有快速、明显疗效。证明这类患者存在溶血或血细胞破坏。
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由于现有溶血试验的局限性，可能有一部分溶血性贫血的患者难以找到发生溶血的原因[3，4]。曾有报道，年轻及年老的成熟红细胞上结合的抗体量不同[5]，Herron等[6]又提出在一些患者中可能存在针对网织红细胞的特异性抗体, Liesveld等[7]推测部分患者可能存在针对有核红细胞抗体，但尚未见到有关直接证据的报道。众所周知，现有的溶血试验多以成熟红细胞作为检测对象，若抗体是针对骨髓内的造血细胞,溶血(或细胞破坏)发生在血细胞生成的较早期，仅凭经典Coombs试验则不可能查到溶血的证据。
为寻找该类患者血细胞减少的原因，我们用BMRBC及BMMNC取代PBRBC做Coombs试验，检测吸附在BMRBC及BMMNC上的抗体，结果发现，5例AIHA患者(阳性对照)PBRBC、BMRBC及BMMNC Coombs试验均阳性，说明这5例患者的自身抗体不仅仅是结合在成熟红细胞上，而且还结合在BMMNC上。是否有一部分AIHA患者以破坏成熟红细胞为主，BMMNC-Coombs试验阴性？临床工作中患者一旦常规Coombs试验阳性，AIHA诊断确定，一般不再行骨髓检查，故该组病例数少，随病例数的增加，有望得到更为全面的结论。阴性对照组47例PBRBC、BMRBC及BMMNC Coombs试验均阴性。实验组24例中17例(70.8%)BMMNC-Coombs试验阳性，而PBRBC及BMRBC Coombs试验均为阴性，说明BMMNC-Coombs试验阳性患者存在针对BMMNC(包括有核红细胞、早期粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及造血干/祖细胞等细胞群)的自身抗体。我们报告的这组临床不易诊断的血细胞减少患者中有7例BMMNC-Coombs分型试验阴性，原因可能与做BMMNC-Coombs分型试验前部分患者已用肾上腺皮质激素治疗、BMMNC-Coombs分型试验灵敏度不够及疾病本身可能与自身抗体并不相关等因素有关，须积累更多的病例，并进一步完善此实验。至于BMMNC-Coombs试验阳性患者的自身抗体是结合在所有BMMNC上，还是有核红细胞上？尚须做进一步深入的研究才能证实。
, http://www.100md.com
总之，BMMNC-Coombs分型试验可弥补常规Coombs 分型试验仅检测成熟红细胞的自身抗体的不足，为血细胞减少患者的诊断和鉴别诊断提供又一实验依据，对减少误诊，使患者得到及时、有效的治疗有重要意义，且实验方法简单易行，任何可作Coombs 试验的单位均可开展，建议对不易诊断的血细胞减少患者试用BMMNC-Coombs分型试验。
参 考 文 献
1，李家增,王鸿利,韩忠朝,主编.血液实验学.第1版.上海: 上海科学技术出版社,1997. 227-228.
2，王永才, 主编.血液病确诊化验诊断. 第1版.大连: 大连出版社,1997. 155-160.
3，丁训杰.我国温抗体型自身免疫性溶血性贫血的研究现状和方向.中华血液学杂志,1999,20:509-510.
, 百拇医药
4，李孜,邵宗鸿.自身免疫性溶血性贫血研究进展.国外医学输血及血液学分册,1999,22:106-109.
5，Branch DR, Shulman IA, Hian ALSS, et al. Two distinct categories of warm autoantibody reactivity with age-fraction red cells. Blood, 1984, 63:177-180.
6，Herron R，Clark M，Smith S.An antibody with activity dependent on red cell age in the serum of a patient with autoimmune haemolytic anaemia and a negative direct antiglobulin test. Vax Sang,1987,52:71-74.
7，Liesveld JL,Rowe JM,Lichtman M. Variability of the erythropoietic response in autoimmue hemolytic anemia: analysis of 109 cases. Blood,1987,69:820-826.
(收稿日期：2000-04-18), 百拇医药