60Coγ射线对原代培养神经细胞增殖的影响
作者：刘建军 汪涛 王洪云
单位：苏州医学院放射生物教研室，苏州，215006)
关键词：辐射；神经细胞；细胞培养；辐射损伤
苏州医学院学报001006 摘要 目的 研究发育期神经细胞在辐照后损伤效应及其机理。方法 以不同剂量γ射线辐照原代培养神经细胞，通过3H-TdR掺入及MTT比色试验等观察辐照对神经细胞增殖、存活能力的影响。结果 0.25Gyγ射线即可引起神经细胞增殖及生存活性的抑制，并在一定剂量内具有剂量依赖关系(0.25～2.0Gy)；且抑制效应随着时间变化而改变。结论 低剂量γ射线对神经细胞的增殖和存活具有明显抑制作用，并伴有时间剂量依赖性。
中图法分类号 R811.5
Effects of 60 Co Gamma-Radiation on the Proliferation
, http://www.100md.com
of Primary Neurons
Liu Jianjun, Wang Tao, Wang Hongyun
(Department of Radiobiology,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective To investigate the injury effects of gamma-radiation on the proliferation and viability of cerebellar neurons grown in culture.Methods Primary cell culture were exposed to 0.25～2.0 Gy doses of γ-radiation 2h after plating.The proliferation and survival viability of neurons were examined for 3 H-TdR incorporation and MTT assay. Results After exposed to 0.25Gy dose γ-rays,neurons proliferation was significantly inhibited;cell survival viablity was decredsed;and the magnitude of injury effect was directly correlated to the dose of gamma-ray applied.Conclusion We conclude that the developing neurons is highly sensitive to irradiation.These acute effects was directly related to the dose of applied and the time after irradiated.
, 百拇医药
Key words irradiation;neurons cell
随着核技术在社会和其它领域的广泛应用，电离辐射对人类的损伤效应愈来愈受到人们所重视，特别是脑组织。我们利用细胞培养技术建立神经细胞的辐射损伤模型，研究电离辐射对发育期神经细胞的增殖抑制和损伤效应。
1 材料与方法
1.1 实验动物与设备 昆明种小鼠，由苏州医学院实验动物中心提供。DMEM培养基为GIBCO公司产品；小牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所生产；MTT、DAPI、RNase及多聚赖氨酸、蛋白酶K等均为Simga公司产品。60 Co放射治疗机为苏州医学院第一附属医院放疗科提供。CO2培养箱为日本Yamato产品。酶联免疫检测仪DG3022A为南京华东电子管厂制造，低本底液闪仪由苏州医学院放射生物实验室提供。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养按参照文献[1] 取新生小鼠大脑半球，置于HBSS液中，剔除脑膜及血管后，制成单细胞悬液，并于300滤网过滤，2000r/min×5min离心，用含20%小牛血清的DMEM培养液重悬浮，调细胞密度为1.5×106/ml，接种于用多聚赖氨酸处理过的培养皿中，置于二氧化碳培养箱中培养，CO2浓度为5%、温度为37℃，在第48h后加入阿糖孢甙10μm处理24h，以抑制非神经细胞的过度增殖，每3天换液1次，一次换取1/2。
1.2.2 辐照 细胞种植2h后，进行辐照。其中样本(SSD)为70.0cm，剂量率85.37cGy/min；照野大小为10×10cm2，分别照射18s,35s,70s,140s，算出辐射剂量分别为0.25、0.5、1.0、2.0Gy。
1.2.3 3H-TdR掺入法检测细胞增殖率参照文献[2] 取不同时相点的培养细胞，每瓶加入3H-TdR 20μl后(60×37KBq/ml)，再重新置入培养箱中培养16h，终止培养，收集细胞，依次经过蒸馏水、生理盐水洗涤，10%的三氯醋酸(TCA)固定，无水乙醇脱水，样品膜烘干后，移入闪烁瓶中，加入闪烁液3ml，用低本底液闪仪进行测定。
, 百拇医药
1.3.4 四唑蓝(MTT)比色试验 取不同时相点的培养细胞，加入MTT溶液20μl，37℃继续培养4h，终止培养，吸弃上清液，每孔加入DMSO 100μl，震荡10min在490nm波长处测定其光吸收值。
2 结果
2.1 形态学观察 正常神经细胞在离体培养后第7天时，在倒置显微镜下即可发现具有明显特征的神经元细胞，突触相互延伸，连接成网；而在经γ射线辐照后，神经细胞生长明显受到抑制，细胞数目减少，有聚集死亡现象，突触连接减少。
2.2 3H-TdR掺入试验结果 细胞种植2h后，分别在不同剂量射线下进行辐照，观察在不同时间、不同剂量3H-TdR掺入后其放射性活度的改变。结果见图1、图2。辐照对培养神经细胞增殖具有明显的抑制效应，并伴有剂量依赖关系；在一定的时间内，其抑制效应一直存在。
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2.3 MTT比色分析结果 用MTT法分别观察了在不同辐照剂量、不同时间，辐射对离体培养神经细胞的毒性作用。结果见图3、图4，经辐照后第12h，培养神经细胞的存活能力受到抑制；随着辐照剂量(0.25～2Gy)的增加，活性抑制效应亦明显增加；0.5Gy剂量γ-射线辐照后，随着时间的变化，神经细胞的抑制效应亦更明显。
图1 不同时间内用0.5FGyγ射线照射神经细胞后3H-TdR放射性活度
图2 不同剂量γ射照射神经细胞12h后3HTdR放射性活度
图3 0.5Gy γ射线照射后对神经细胞抑制作用的时效关系
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图4 不同剂量γ射线照射12小时后对神经细胞抑制作用
3 讨论
一般认为，成熟的神经元细胞对电离辐射具有较高的辐射抗性，而处于发育时期(胚胎期、新生期)的神经元对辐射具有较高的辐射敏感性。Skull和Otake[3]等发现，曾接受辐照而患有大脑发育畸形者中，95%患者接受辐照的剂量为0.06～0.30Gy；每增加1Gy的辐照剂量，大脑发育受损的危险性增加50倍。动物整体辐照模型实验可精确的观察到辐照引起大脑发育及神经细胞损伤的各过程，一直广泛的应用于神经放射生物学的研究。Pouma等人用0.5Gyγ射线辐照不同孕龄的小鼠，发现胎儿死亡、发育畸形频率明显增加，辐照引起大脑发育畸形的最敏感期在受孕10～13.5天，即大脑皮层神经组织发生期。
神经细胞的培养可使神经细胞在体外建立与体内相类似的发育过程，有利于直接研究神经细胞发育的辐射效应与机制，排除其他因素(如血运障碍等)对其辐射效应的干扰作用。
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Dmiberg[4]等人用0.5Gyγ～射线对聚集培养的神经细胞进行辐照，可引起培养神经细胞损伤，细胞内标志酶含量发生明显改变，DNA和蛋白质含量降低，NGF的表达抑制，存活细胞数量减少。王彬[5]等用0.05Gy γ-射线辐照，培养中脑神经细胞的增殖即可产生抑制效应；Guelmn-LR[6]辐射培养新生大鼠神经细胞(剂量为0.1～2Gy)，认为辐照后在24h内主要导致神经元DNA合成抑制等急性效应，而产生的亚致死性损伤可导致细胞生存活性降低等长期效应。
我们在实验中以新生小鼠进行分离培养，此时大脑神经细胞仍具有增殖能力[7]，对电离辐射仍然较敏感；我们发现0.25Gy剂量照射即可引起神经细胞3H-TdR掺入率的抑制，并随着剂量的增大(0.25～2Gy)，其掺入率受抑制逐渐增加，说明在一定的辐照剂量范围内，其增殖抑制效应存在着密切的剂量效应关系，随着时间的延续(48h内)，其抑制效应持续存在(与对照组相比)；MTT实验也说明了低剂量的电离辐射对神经细胞的增殖、存活有明显的抑制作用。这些结果与文献报道基本一致，证明处于发育期的神经细胞对电离辐射具有较高的敏感性，低剂量电离辐射(0.25Gy)对神经细胞具有毒性作用，降低神经细胞的存活能力，抑制细胞的增殖与分化，从而导致大脑发育不良、智力退化等长期效应的发生。
, 百拇医药
综上所述，电离辐射对处于发育时期的神经元细胞具有较高的辐射敏感性，低剂量电离辐射对培养神经细胞元的增殖、存活能力具有明显抑制作用，且其损伤效应随着剂量、时间的改变而改变。其机制可能为电离辐射使细胞内基因表达发生变化，从而损伤神经细胞分子结构，并诱发凋亡。刘建军硕士研究生，现在上海仁济医院ECT室 汪涛导师
参考文献
1，Ditchter MA.Rat cortical neurons in cell culture methods,cell morphology,electrophysiology,and synapse formation.Brain Res,1978，149∶279
2，苏州医学院卫生系第三教研室(苏燎原执笔).电离辐射对人血淋巴细胞转化能力的影响.生物化学与生物物理进展，1997，3∶10
, http://www.100md.com 3，Otake M,Schull W J,LEE S.Threshold for radiation～ralated severe mental retardation in prenatally exposed A～bomb survivors∶a reanalysis.Int J Radia Biol 1996，70∶755
4，Dimberg Y.Effect of low-dose x-irradiation on mouse brain aggregation cultures.Int J Radial Biol,1992，61(3)∶355
5，王 彬，渡边惠子，山田宏.有机氚化物对离体培养小鼠胎儿中脑细胞增殖及分化的影响.中华放射医学与防护杂志，1997，17(5)∶319
6，Guelmn LR,Zieher LM,Fiszman ML.The effect of xirradiation on cerebellar granule cells grown in culture.Ganglioside GM1 neuroprotective activity.Neurochem Int,1996，29(5)∶521
7，Inouye M,Kameyama Y.Cell death in the development rat cerebellum following x-irradiation of 3 to 100 rad:a quantitative study.J Radiat Res,1983，24∶259
(2000年9月25日收稿), 百拇医药
单位：苏州医学院放射生物教研室，苏州，215006)
关键词：辐射；神经细胞；细胞培养；辐射损伤
苏州医学院学报001006 摘要 目的 研究发育期神经细胞在辐照后损伤效应及其机理。方法 以不同剂量γ射线辐照原代培养神经细胞，通过3H-TdR掺入及MTT比色试验等观察辐照对神经细胞增殖、存活能力的影响。结果 0.25Gyγ射线即可引起神经细胞增殖及生存活性的抑制，并在一定剂量内具有剂量依赖关系(0.25～2.0Gy)；且抑制效应随着时间变化而改变。结论 低剂量γ射线对神经细胞的增殖和存活具有明显抑制作用，并伴有时间剂量依赖性。
中图法分类号 R811.5
Effects of 60 Co Gamma-Radiation on the Proliferation
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of Primary Neurons
Liu Jianjun, Wang Tao, Wang Hongyun
(Department of Radiobiology,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective To investigate the injury effects of gamma-radiation on the proliferation and viability of cerebellar neurons grown in culture.Methods Primary cell culture were exposed to 0.25～2.0 Gy doses of γ-radiation 2h after plating.The proliferation and survival viability of neurons were examined for 3 H-TdR incorporation and MTT assay. Results After exposed to 0.25Gy dose γ-rays,neurons proliferation was significantly inhibited;cell survival viablity was decredsed;and the magnitude of injury effect was directly correlated to the dose of gamma-ray applied.Conclusion We conclude that the developing neurons is highly sensitive to irradiation.These acute effects was directly related to the dose of applied and the time after irradiated.
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Key words irradiation;neurons cell
随着核技术在社会和其它领域的广泛应用，电离辐射对人类的损伤效应愈来愈受到人们所重视，特别是脑组织。我们利用细胞培养技术建立神经细胞的辐射损伤模型，研究电离辐射对发育期神经细胞的增殖抑制和损伤效应。
1 材料与方法
1.1 实验动物与设备 昆明种小鼠，由苏州医学院实验动物中心提供。DMEM培养基为GIBCO公司产品；小牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所生产；MTT、DAPI、RNase及多聚赖氨酸、蛋白酶K等均为Simga公司产品。60 Co放射治疗机为苏州医学院第一附属医院放疗科提供。CO2培养箱为日本Yamato产品。酶联免疫检测仪DG3022A为南京华东电子管厂制造，低本底液闪仪由苏州医学院放射生物实验室提供。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养按参照文献[1] 取新生小鼠大脑半球，置于HBSS液中，剔除脑膜及血管后，制成单细胞悬液，并于300滤网过滤，2000r/min×5min离心，用含20%小牛血清的DMEM培养液重悬浮，调细胞密度为1.5×106/ml，接种于用多聚赖氨酸处理过的培养皿中，置于二氧化碳培养箱中培养，CO2浓度为5%、温度为37℃，在第48h后加入阿糖孢甙10μm处理24h，以抑制非神经细胞的过度增殖，每3天换液1次，一次换取1/2。
1.2.2 辐照 细胞种植2h后，进行辐照。其中样本(SSD)为70.0cm，剂量率85.37cGy/min；照野大小为10×10cm2，分别照射18s,35s,70s,140s，算出辐射剂量分别为0.25、0.5、1.0、2.0Gy。
1.2.3 3H-TdR掺入法检测细胞增殖率参照文献[2] 取不同时相点的培养细胞，每瓶加入3H-TdR 20μl后(60×37KBq/ml)，再重新置入培养箱中培养16h，终止培养，收集细胞，依次经过蒸馏水、生理盐水洗涤，10%的三氯醋酸(TCA)固定，无水乙醇脱水，样品膜烘干后，移入闪烁瓶中，加入闪烁液3ml，用低本底液闪仪进行测定。
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1.3.4 四唑蓝(MTT)比色试验 取不同时相点的培养细胞，加入MTT溶液20μl，37℃继续培养4h，终止培养，吸弃上清液，每孔加入DMSO 100μl，震荡10min在490nm波长处测定其光吸收值。
2 结果
2.1 形态学观察 正常神经细胞在离体培养后第7天时，在倒置显微镜下即可发现具有明显特征的神经元细胞，突触相互延伸，连接成网；而在经γ射线辐照后，神经细胞生长明显受到抑制，细胞数目减少，有聚集死亡现象，突触连接减少。
2.2 3H-TdR掺入试验结果 细胞种植2h后，分别在不同剂量射线下进行辐照，观察在不同时间、不同剂量3H-TdR掺入后其放射性活度的改变。结果见图1、图2。辐照对培养神经细胞增殖具有明显的抑制效应，并伴有剂量依赖关系；在一定的时间内，其抑制效应一直存在。
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2.3 MTT比色分析结果 用MTT法分别观察了在不同辐照剂量、不同时间，辐射对离体培养神经细胞的毒性作用。结果见图3、图4，经辐照后第12h，培养神经细胞的存活能力受到抑制；随着辐照剂量(0.25～2Gy)的增加，活性抑制效应亦明显增加；0.5Gy剂量γ-射线辐照后，随着时间的变化，神经细胞的抑制效应亦更明显。
图1 不同时间内用0.5FGyγ射线照射神经细胞后3H-TdR放射性活度
图2 不同剂量γ射照射神经细胞12h后3HTdR放射性活度
图3 0.5Gy γ射线照射后对神经细胞抑制作用的时效关系
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图4 不同剂量γ射线照射12小时后对神经细胞抑制作用
3 讨论
一般认为，成熟的神经元细胞对电离辐射具有较高的辐射抗性，而处于发育时期(胚胎期、新生期)的神经元对辐射具有较高的辐射敏感性。Skull和Otake[3]等发现，曾接受辐照而患有大脑发育畸形者中，95%患者接受辐照的剂量为0.06～0.30Gy；每增加1Gy的辐照剂量，大脑发育受损的危险性增加50倍。动物整体辐照模型实验可精确的观察到辐照引起大脑发育及神经细胞损伤的各过程，一直广泛的应用于神经放射生物学的研究。Pouma等人用0.5Gyγ射线辐照不同孕龄的小鼠，发现胎儿死亡、发育畸形频率明显增加，辐照引起大脑发育畸形的最敏感期在受孕10～13.5天，即大脑皮层神经组织发生期。
神经细胞的培养可使神经细胞在体外建立与体内相类似的发育过程，有利于直接研究神经细胞发育的辐射效应与机制，排除其他因素(如血运障碍等)对其辐射效应的干扰作用。
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Dmiberg[4]等人用0.5Gyγ～射线对聚集培养的神经细胞进行辐照，可引起培养神经细胞损伤，细胞内标志酶含量发生明显改变，DNA和蛋白质含量降低，NGF的表达抑制，存活细胞数量减少。王彬[5]等用0.05Gy γ-射线辐照，培养中脑神经细胞的增殖即可产生抑制效应；Guelmn-LR[6]辐射培养新生大鼠神经细胞(剂量为0.1～2Gy)，认为辐照后在24h内主要导致神经元DNA合成抑制等急性效应，而产生的亚致死性损伤可导致细胞生存活性降低等长期效应。
我们在实验中以新生小鼠进行分离培养，此时大脑神经细胞仍具有增殖能力[7]，对电离辐射仍然较敏感；我们发现0.25Gy剂量照射即可引起神经细胞3H-TdR掺入率的抑制，并随着剂量的增大(0.25～2Gy)，其掺入率受抑制逐渐增加，说明在一定的辐照剂量范围内，其增殖抑制效应存在着密切的剂量效应关系，随着时间的延续(48h内)，其抑制效应持续存在(与对照组相比)；MTT实验也说明了低剂量的电离辐射对神经细胞的增殖、存活有明显的抑制作用。这些结果与文献报道基本一致，证明处于发育期的神经细胞对电离辐射具有较高的敏感性，低剂量电离辐射(0.25Gy)对神经细胞具有毒性作用，降低神经细胞的存活能力，抑制细胞的增殖与分化，从而导致大脑发育不良、智力退化等长期效应的发生。
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综上所述，电离辐射对处于发育时期的神经元细胞具有较高的辐射敏感性，低剂量电离辐射对培养神经细胞元的增殖、存活能力具有明显抑制作用，且其损伤效应随着剂量、时间的改变而改变。其机制可能为电离辐射使细胞内基因表达发生变化，从而损伤神经细胞分子结构，并诱发凋亡。刘建军硕士研究生，现在上海仁济医院ECT室 汪涛导师
参考文献
1，Ditchter MA.Rat cortical neurons in cell culture methods,cell morphology,electrophysiology,and synapse formation.Brain Res,1978，149∶279
2，苏州医学院卫生系第三教研室(苏燎原执笔).电离辐射对人血淋巴细胞转化能力的影响.生物化学与生物物理进展，1997，3∶10
, http://www.100md.com 3，Otake M,Schull W J,LEE S.Threshold for radiation～ralated severe mental retardation in prenatally exposed A～bomb survivors∶a reanalysis.Int J Radia Biol 1996，70∶755
4，Dimberg Y.Effect of low-dose x-irradiation on mouse brain aggregation cultures.Int J Radial Biol,1992，61(3)∶355
5，王 彬，渡边惠子，山田宏.有机氚化物对离体培养小鼠胎儿中脑细胞增殖及分化的影响.中华放射医学与防护杂志，1997，17(5)∶319
6，Guelmn LR,Zieher LM,Fiszman ML.The effect of xirradiation on cerebellar granule cells grown in culture.Ganglioside GM1 neuroprotective activity.Neurochem Int,1996，29(5)∶521
7，Inouye M,Kameyama Y.Cell death in the development rat cerebellum following x-irradiation of 3 to 100 rad:a quantitative study.J Radiat Res,1983，24∶259
(2000年9月25日收稿), 百拇医药