北京市药品监督管理局对药品委托加工有关问题作出解释
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山东医药001004 摘要 采用电镜技术及原位末端标记法(TUNEL)对柯萨奇病毒B3(CVB3)心肌炎小鼠不同时期心肌组织中细胞凋亡进行检测，并采用硫代巴比妥酸法检测外周血丙二醛(MDA)。CVB3感染100只雄性Balb/c小鼠，VMC发病率为86%。各期病鼠心肌中均见到凋亡细胞，包括心肌细胞、血管内皮细胞及间质细胞。TUNEL法检出率为78.94%，中、重度VMC小鼠中阳性检出率明显高于轻度VMC小鼠(P<0.05)。感染后7～14天心肌细胞凋亡百分率明显高于21～28天(P<0.05)。正常对照组未见凋亡细胞。感染后7天始MDA明显升高，14～21天为高峰，第28天开始恢复。中、重度VMC小鼠MDA升高发生率明显高于轻度VMC小鼠(P<0.05)。实验组小鼠心肌细胞凋亡百分率与MDA的变化趋势基本相同。说明细胞凋亡可能为VMC中造成心肌损伤的重要发病机制之一，氧自由基(OFR)可能为VMC细胞凋亡的促发因素之一。
, http://www.100md.com
Abstract Electronic microscopic and terminal trans ferasemediated dUPT-biotin nick end-labeling(TUNEL)assays quantified apoptosis in myocardium.Malon dialdehyde(MDA)in serum were detected.One hundred Balb/c mice were inoculated with CVB3.The incidence of VMC was 86%.Apoptotic cells detected in myocardium from CVB3-injected mice included myocytes，endothelial cells and infiltrating cells in myocardium.TUNEL-positive myocytes increased significantly from 7 to 14 days p.i.then reduced from 21 to 28 days p.i(P<0.05).The positive rate of TUNEL-positive mice were more higher in mice exhibited moderate to severeer histopathology than that in mice exhibited mild histopathology(P<0.05).In experimental group，the level of MDA rised up significantly from 7 days p.i.and reached its peak at 14 days p.i.，recovered from 28 days p.i.The level of MDA in serum from CVB3-injected mice correlated with the degree of myocardial lesions significantly(P<0.05).Both of Apoptosis and MDA which can induce apoptosis significantly during 7 to 14 days p.i..It demonstrates that apoptosis might play an important role in the development of VMC.Oxygen free radicals might be one of proapoptosis factors.
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Key words Mice Myocarditis Coxsackievirus Apoptosis Oxygen free radical
Malon dialdehyde
我们选用Balb/c小鼠柯萨奇病毒B3(CVB3)心肌炎为模型，应用电镜技术及原位末端标记法(TUNEL)检测小鼠病毒性心肌炎(VMC)心肌组织中细胞凋亡情况，同时检测外周血OFR丙二醛水平，以探讨细胞凋亡在VMC发展中的作用及其与氧自由基(OFR)的关系。
1 资料与方法
1.1 CVB3心肌炎动物模型的制备 由山东省医科院提供CVB3病毒(Nancy株)，山东医科大学动物实验中心提供125只4～6周龄雄性Balb/c小鼠。随机分为：①实验组100只，每只腹腔接种0.12ml含109TCID50CVB3的病毒液。②对照组25只，腹腔接种等量生理盐水。分别于接种后7、10、14、21、28天，随机取实验组20只、对照组5只处死。摘眼球取血用于丙二醛(MDA)测定。取心脏，用4%多聚甲醛固定，待做HE染色、TUNEL法检测，部分心肌用2.5%戊二醛固定，送检电镜。
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1.2 TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡 利用寡核甘酸末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法检测。结果判定：随机数5个高倍镜(×400)视野的心肌细胞总数及阳性数，按公式阳性细胞/细胞总数×100%计算心肌细胞凋亡细胞百分率。
1.3 丙二醛测定 采用硫代苯巴比妥酸法。
1.4 统计学处理 计量资料用
±S，用不配对t检验，计数资料用卡方检验。
2 结果
2.1 CVB3心肌炎小鼠病理变化 实验小鼠于接种后第7天即见明显的心肌细胞坏死和淋巴细胞浸润，10～14天病变达高峰，第21天部分炎性病灶开始吸收，代之以纤维化，第28天多数病灶吸收。总感染率为86%。
, 百拇医药
2.2 CVB3心肌炎小鼠心肌细胞凋亡情况 每批小鼠在电镜下均见到凋亡的心肌细胞，检出率为62.5%。表现为细胞变圆，核染色质密度增高，凝聚在核膜周边，胞膜内陷，将细胞分割成多个外有完整包膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体，细胞器无明显改变。正常对照组2只均未检到凋亡细胞。用TUNEL法检测细胞凋亡，含有DNA片段的凋亡细胞核呈紫蓝色，正常细胞核为淡红色；凋亡细胞多为分布在心内膜、心外膜下及炎症灶周围的心肌细胞，还包括浸润淋巴细胞及血管内皮细胞。实验组中，心肌细胞凋亡检出率为78.94%(15/19)，中、重度病鼠细胞凋亡的检出率(14/14)较轻度病鼠(1/5)明显升高(P<0.01)。平均心肌细胞凋亡百分率为7.97±6.43%，感染后7～14天(10.11±6.91%)较21～28天(4.02±3.37%)明显升高(P<0.05)。正常对照组5只均未见到凋亡细胞。
2.3 CVB3心肌炎小鼠不同时期MDA变化 由表1可见，实验组小鼠第7天开始MDA值升高，10～21天时达高峰，以后渐下降，第28天仍低于正常。
, 百拇医药
表1 CVB3心肌炎小鼠不同时期MDA值改变(Nμ/ml，
±S)
腹腔接种后MDA值
7天
10天
14天
21天
28天
实验组
对照组
P值
, 百拇医药
11.15±214
6.34±1.76
<0.01
12.41±1.64
6.93±1.55
<0.01
13.51±2.18
6.44±1.62
<0.01
13.38±1.82
7.12±1.57
<0.01
, 百拇医药
10.31±1.91
6.96±1.86
<0.01
2.4 细胞凋亡与OFR的关系 感染第7天，MDA已明显上升，凋亡细胞明显增加；第10～14天MDA上升至最高峰，细胞凋亡亦达高峰；第21天MDA仍处于高水平，细胞凋亡减少，但持续存在；第28天MDA开始趋于恢复，细胞凋亡仍少量存在。
3 讨论
细胞凋亡是一由遗传基因控制的细胞自主性死亡过程，其基本特征为DNA被核酸内切酶切成180bp或其整倍数的片段。电镜检查细胞凋亡最直观。脱氧核糖核酸(TdT)介导的原位末端标记法(TUNEL)通过鉴别含有DNA降解片段的细胞来判断早期的凋亡细胞，方法简便、快速、敏感，是目前广泛应用的手段。1994年Kawano等[1]首次报道心肌炎患者存在心肌细胞凋亡。1997年钱素娟等[2]研究CVB3致Balb/c小鼠VMC，发现实验组小鼠存在心肌细胞凋亡现象。然而，细胞凋亡与VMC的病变轻重及病程的关系如何未见报道。我们经电镜观察发现，每批病鼠心肌中均存在心肌细胞凋亡，检出率为62.5%(5/8)。应用TUNEL法检测发现，阳性率为78.94%，平均细胞凋亡百分率为7.97±6.43%，中、重度病鼠细胞凋亡检出率显著高于轻度病鼠(P<0.05)，与病情相关；感染7～14天凋亡百分率最高(P<0.05)，与病程相关，表明细胞凋亡参与了心肌炎的发生发展过程。1998年Takemura等[3]研究心肌梗塞后浸润细胞和增生间质细胞凋亡现象后，认为细胞凋亡为其消除方式之一。本研究表明，实验组小鼠心肌中存在浸润细胞凋亡现象，尤其是感染第7～14天，表明细胞凋亡为心肌炎浸润细胞的消除方式之一，也可能是机体调节免疫反应的一种方式。
, 百拇医药
细胞凋亡过程受细胞内外多种因素的调控，其中病毒是较重要的因素之一。病毒感染后，一方面机体运用细胞凋亡的手段，通过牺牲个别细胞来消除外物，超宿主防御作用；另一方面，病毒为维持自身的存活与繁殖，调控宿主细胞凋亡，引起宿主病理损伤。
人和动物实验均表明伴有自由基增高，但均未研究其变化过程及其与病变程度的关系，因此对抗氧化剂治疗疗程缺少客观依据。本研究表明，小鼠感染第7天，心肌组织即出现明显的血管外淋巴细胞浸润及心肌变性坏死，此时MDA明显升高。第10～14天病变逐渐加重，心肌细胞广泛坏死，MDA升至最高；第28天时上述病变仍然存在，坏死区见毛细血管增生，肉芽组织生成，病变已到恢复阶段，MDA渐恢复，表明OFR对心肌的损害作用可持续4周。诱导细胞凋亡因素很多，同一种因素既能诱导细胞凋亡也能产生坏死，而细胞死亡的类型取决于损害的严重程度而不是其本身性质。MDA是脂质过氧化作用的中间产物，其升高表明体内脂质过氧作用增强，而脂质过氧化作用可直接导致细胞凋亡[4]。然而关于氧自由基与VMC细胞凋亡的关系，国内外均未见报道。本研究结果显示，感染后7天始，细胞凋亡明显增加，MDA明显升高；10～14天细胞凋亡达高峰，MDA亦达高峰。MDA具有促凋亡作用，因此细胞凋亡可能与MDA升高有关。第21天MDA仍处高峰，而细胞凋亡明显减少，可能由于机体的抗氧化机制起作用，如Bcl-2蛋白的表达等。
, 百拇医药
总 之，VMC存在细胞凋亡，且与病变程度密切相关，表明心肌细胞凋亡为心肌炎的重要病理改变。浸润淋巴细胞凋亡可调节免疫功能，氧自由基可能为心肌细胞凋亡的诱发因素之一，而且作用时间持续约4周。本研究为VMC的发病机制和防治提供了新的方向，为大剂量维生素C治疗心肌炎的良好疗效提供了新的机理，并为其治疗疗程提供了科学依据。
参考文献
1，Kawanp H，Okada R，Kauano Y，et al.A poptosis in acute and chronic myocarditis.J pn Heart J，1994，35(6)：745.
2，钱素娟，曾宪惠，于维汉.细胞凋亡与小鼠病毒性心肌炎发生发展的关系.中国地方病学杂志，1997，16(4)：203.
3，Takemura G，Ohno M，Hayakawa Y，et al.Role of apoptosis in the disappearance of infiltrated and proliferated interstitial cells after myocardial infarction.Circ Res，1998，82：1130.
4，Sandstrom PA，Pardi D，Tebbey PW，et al.Lipid hydroperoxide-induced apoptosis：lack of inhibition by bcl-2 overexpression.FEBS Lett，1995，65(1)：66.
(2000-01-10收稿), http://www.100md.com
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关键词：
山东医药001004 摘要 采用电镜技术及原位末端标记法(TUNEL)对柯萨奇病毒B3(CVB3)心肌炎小鼠不同时期心肌组织中细胞凋亡进行检测，并采用硫代巴比妥酸法检测外周血丙二醛(MDA)。CVB3感染100只雄性Balb/c小鼠，VMC发病率为86%。各期病鼠心肌中均见到凋亡细胞，包括心肌细胞、血管内皮细胞及间质细胞。TUNEL法检出率为78.94%，中、重度VMC小鼠中阳性检出率明显高于轻度VMC小鼠(P<0.05)。感染后7～14天心肌细胞凋亡百分率明显高于21～28天(P<0.05)。正常对照组未见凋亡细胞。感染后7天始MDA明显升高，14～21天为高峰，第28天开始恢复。中、重度VMC小鼠MDA升高发生率明显高于轻度VMC小鼠(P<0.05)。实验组小鼠心肌细胞凋亡百分率与MDA的变化趋势基本相同。说明细胞凋亡可能为VMC中造成心肌损伤的重要发病机制之一，氧自由基(OFR)可能为VMC细胞凋亡的促发因素之一。
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Abstract Electronic microscopic and terminal trans ferasemediated dUPT-biotin nick end-labeling(TUNEL)assays quantified apoptosis in myocardium.Malon dialdehyde(MDA)in serum were detected.One hundred Balb/c mice were inoculated with CVB3.The incidence of VMC was 86%.Apoptotic cells detected in myocardium from CVB3-injected mice included myocytes，endothelial cells and infiltrating cells in myocardium.TUNEL-positive myocytes increased significantly from 7 to 14 days p.i.then reduced from 21 to 28 days p.i(P<0.05).The positive rate of TUNEL-positive mice were more higher in mice exhibited moderate to severeer histopathology than that in mice exhibited mild histopathology(P<0.05).In experimental group，the level of MDA rised up significantly from 7 days p.i.and reached its peak at 14 days p.i.，recovered from 28 days p.i.The level of MDA in serum from CVB3-injected mice correlated with the degree of myocardial lesions significantly(P<0.05).Both of Apoptosis and MDA which can induce apoptosis significantly during 7 to 14 days p.i..It demonstrates that apoptosis might play an important role in the development of VMC.Oxygen free radicals might be one of proapoptosis factors.
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Key words Mice Myocarditis Coxsackievirus Apoptosis Oxygen free radical
Malon dialdehyde
我们选用Balb/c小鼠柯萨奇病毒B3(CVB3)心肌炎为模型，应用电镜技术及原位末端标记法(TUNEL)检测小鼠病毒性心肌炎(VMC)心肌组织中细胞凋亡情况，同时检测外周血OFR丙二醛水平，以探讨细胞凋亡在VMC发展中的作用及其与氧自由基(OFR)的关系。
1 资料与方法
1.1 CVB3心肌炎动物模型的制备 由山东省医科院提供CVB3病毒(Nancy株)，山东医科大学动物实验中心提供125只4～6周龄雄性Balb/c小鼠。随机分为：①实验组100只，每只腹腔接种0.12ml含109TCID50CVB3的病毒液。②对照组25只，腹腔接种等量生理盐水。分别于接种后7、10、14、21、28天，随机取实验组20只、对照组5只处死。摘眼球取血用于丙二醛(MDA)测定。取心脏，用4%多聚甲醛固定，待做HE染色、TUNEL法检测，部分心肌用2.5%戊二醛固定，送检电镜。
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1.2 TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡 利用寡核甘酸末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法检测。结果判定：随机数5个高倍镜(×400)视野的心肌细胞总数及阳性数，按公式阳性细胞/细胞总数×100%计算心肌细胞凋亡细胞百分率。
1.3 丙二醛测定 采用硫代苯巴比妥酸法。
1.4 统计学处理 计量资料用
±S，用不配对t检验，计数资料用卡方检验。2 结果
2.1 CVB3心肌炎小鼠病理变化 实验小鼠于接种后第7天即见明显的心肌细胞坏死和淋巴细胞浸润，10～14天病变达高峰，第21天部分炎性病灶开始吸收，代之以纤维化，第28天多数病灶吸收。总感染率为86%。
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2.2 CVB3心肌炎小鼠心肌细胞凋亡情况 每批小鼠在电镜下均见到凋亡的心肌细胞，检出率为62.5%。表现为细胞变圆，核染色质密度增高，凝聚在核膜周边，胞膜内陷，将细胞分割成多个外有完整包膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体，细胞器无明显改变。正常对照组2只均未检到凋亡细胞。用TUNEL法检测细胞凋亡，含有DNA片段的凋亡细胞核呈紫蓝色，正常细胞核为淡红色；凋亡细胞多为分布在心内膜、心外膜下及炎症灶周围的心肌细胞，还包括浸润淋巴细胞及血管内皮细胞。实验组中，心肌细胞凋亡检出率为78.94%(15/19)，中、重度病鼠细胞凋亡的检出率(14/14)较轻度病鼠(1/5)明显升高(P<0.01)。平均心肌细胞凋亡百分率为7.97±6.43%，感染后7～14天(10.11±6.91%)较21～28天(4.02±3.37%)明显升高(P<0.05)。正常对照组5只均未见到凋亡细胞。
2.3 CVB3心肌炎小鼠不同时期MDA变化 由表1可见，实验组小鼠第7天开始MDA值升高，10～21天时达高峰，以后渐下降，第28天仍低于正常。
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表1 CVB3心肌炎小鼠不同时期MDA值改变(Nμ/ml，
±S)腹腔接种后MDA值
7天
10天
14天
21天
28天
实验组
对照组
P值
, 百拇医药
11.15±214
6.34±1.76
<0.01
12.41±1.64
6.93±1.55
<0.01
13.51±2.18
6.44±1.62
<0.01
13.38±1.82
7.12±1.57
<0.01
, 百拇医药
10.31±1.91
6.96±1.86
<0.01
2.4 细胞凋亡与OFR的关系 感染第7天，MDA已明显上升，凋亡细胞明显增加；第10～14天MDA上升至最高峰，细胞凋亡亦达高峰；第21天MDA仍处于高水平，细胞凋亡减少，但持续存在；第28天MDA开始趋于恢复，细胞凋亡仍少量存在。
3 讨论
细胞凋亡是一由遗传基因控制的细胞自主性死亡过程，其基本特征为DNA被核酸内切酶切成180bp或其整倍数的片段。电镜检查细胞凋亡最直观。脱氧核糖核酸(TdT)介导的原位末端标记法(TUNEL)通过鉴别含有DNA降解片段的细胞来判断早期的凋亡细胞，方法简便、快速、敏感，是目前广泛应用的手段。1994年Kawano等[1]首次报道心肌炎患者存在心肌细胞凋亡。1997年钱素娟等[2]研究CVB3致Balb/c小鼠VMC，发现实验组小鼠存在心肌细胞凋亡现象。然而，细胞凋亡与VMC的病变轻重及病程的关系如何未见报道。我们经电镜观察发现，每批病鼠心肌中均存在心肌细胞凋亡，检出率为62.5%(5/8)。应用TUNEL法检测发现，阳性率为78.94%，平均细胞凋亡百分率为7.97±6.43%，中、重度病鼠细胞凋亡检出率显著高于轻度病鼠(P<0.05)，与病情相关；感染7～14天凋亡百分率最高(P<0.05)，与病程相关，表明细胞凋亡参与了心肌炎的发生发展过程。1998年Takemura等[3]研究心肌梗塞后浸润细胞和增生间质细胞凋亡现象后，认为细胞凋亡为其消除方式之一。本研究表明，实验组小鼠心肌中存在浸润细胞凋亡现象，尤其是感染第7～14天，表明细胞凋亡为心肌炎浸润细胞的消除方式之一，也可能是机体调节免疫反应的一种方式。
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细胞凋亡过程受细胞内外多种因素的调控，其中病毒是较重要的因素之一。病毒感染后，一方面机体运用细胞凋亡的手段，通过牺牲个别细胞来消除外物，超宿主防御作用；另一方面，病毒为维持自身的存活与繁殖，调控宿主细胞凋亡，引起宿主病理损伤。
人和动物实验均表明伴有自由基增高，但均未研究其变化过程及其与病变程度的关系，因此对抗氧化剂治疗疗程缺少客观依据。本研究表明，小鼠感染第7天，心肌组织即出现明显的血管外淋巴细胞浸润及心肌变性坏死，此时MDA明显升高。第10～14天病变逐渐加重，心肌细胞广泛坏死，MDA升至最高；第28天时上述病变仍然存在，坏死区见毛细血管增生，肉芽组织生成，病变已到恢复阶段，MDA渐恢复，表明OFR对心肌的损害作用可持续4周。诱导细胞凋亡因素很多，同一种因素既能诱导细胞凋亡也能产生坏死，而细胞死亡的类型取决于损害的严重程度而不是其本身性质。MDA是脂质过氧化作用的中间产物，其升高表明体内脂质过氧作用增强，而脂质过氧化作用可直接导致细胞凋亡[4]。然而关于氧自由基与VMC细胞凋亡的关系，国内外均未见报道。本研究结果显示，感染后7天始，细胞凋亡明显增加，MDA明显升高；10～14天细胞凋亡达高峰，MDA亦达高峰。MDA具有促凋亡作用，因此细胞凋亡可能与MDA升高有关。第21天MDA仍处高峰，而细胞凋亡明显减少，可能由于机体的抗氧化机制起作用，如Bcl-2蛋白的表达等。
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总 之，VMC存在细胞凋亡，且与病变程度密切相关，表明心肌细胞凋亡为心肌炎的重要病理改变。浸润淋巴细胞凋亡可调节免疫功能，氧自由基可能为心肌细胞凋亡的诱发因素之一，而且作用时间持续约4周。本研究为VMC的发病机制和防治提供了新的方向，为大剂量维生素C治疗心肌炎的良好疗效提供了新的机理，并为其治疗疗程提供了科学依据。
参考文献
1，Kawanp H，Okada R，Kauano Y，et al.A poptosis in acute and chronic myocarditis.J pn Heart J，1994，35(6)：745.
2，钱素娟，曾宪惠，于维汉.细胞凋亡与小鼠病毒性心肌炎发生发展的关系.中国地方病学杂志，1997，16(4)：203.
3，Takemura G，Ohno M，Hayakawa Y，et al.Role of apoptosis in the disappearance of infiltrated and proliferated interstitial cells after myocardial infarction.Circ Res，1998，82：1130.
4，Sandstrom PA，Pardi D，Tebbey PW，et al.Lipid hydroperoxide-induced apoptosis：lack of inhibition by bcl-2 overexpression.FEBS Lett，1995，65(1)：66.
(2000-01-10收稿), http://www.100md.com