人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定
人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定
黄宝成 陈志南 徐力青 姜绍谆
摘 要：目的 构建人肝癌细胞cDNA表达文库. 方法 从人肝癌细胞中提取总RNA并纯化出mRNA,反转录合成第一、二链cDNA，除去小于500 bp cDNA片段，连接EcoRI人工接头，与去磷酸化的λgt11噬菌体左、右臂连接，体外包装后建成cDNA文库. 取出一部分感染E.coli Y1090，测定文库大小并酶切鉴定插入cDNA片段的大小. 结果 构建成含1.2×106重组子人肝癌细胞cDNA文库，重组子平均插入外源片段长约1.5 kb. 结论 构建的文库合格，适合用于筛选目的cDNA克隆.
关键词：人肝癌细胞；cDNA文库
, 百拇医药
0 引言
20世纪90年代起,原发性肝癌已上升为我国第二位癌症杀手,加紧对其复发、转移机制及相关抗原的基础研究工作十分必要[1]. 我室多年来制备了数株肝癌特异性单克隆抗体，其中一株抗体与放射性核素的交联物治疗肝癌已处在临床验证阶段. 找到这几株单抗的相应抗原基因对肝癌的基础研究应很有意义. 利用抗体寻找抗原基因的最有效方法是构建cDNA文库[2]，继而进行筛选、克隆等. 我们选取与几株单抗的免疫荧光及Western免疫印迹反应均呈阳性结果的肝癌细胞株HHCC作为建库材料来源，以λgt11 DNA为载体，构建了人肝癌细胞cDNA表达文库.
1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞株 HHCC为本室保存， E.coli Y1090hsdR株、λgt11噬菌体去磷酸化的左、右臂DNA购自Promega公司，质粒Bluescript SK及感受态细菌TG1为本室保存. TRIZOL试剂购自美国Gibco公司,Oligotex mRNA kit购自Qiagen公司，Universal Riboclone cDNA Synthesis kit购自Promega公司，ExpandTM Reverse Transcriptase购自宝灵曼公司，Lambda Packaging kit购自Phamacia公司,[α-32P]dCTP系北京亚辉生物医学工程公司产品.
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1.2 方法 ①培养HHCC至旺盛生长期，倾去培养液后加入TRIZOL试剂，裂解细胞并抽提出总RNA;用Oligotex mRNA kit试剂从总RNA中纯化出含poly A的mRNA，并用紫外分光光度计(Perkin Elmer公司产品)测定其纯度及含量. ②以6 μg的mRNA为模板，3 μg Oligo(dT)15为引物，ExpandTM Reverse Transcriptase为反转录酶，42℃,60 min合成cDNA第1链；然后向其中加入10×第2链缓冲液，再加入DNA聚合酶I及 RNaseH, 22℃保温60 min合成cDNA第2链；双链cDNA(dscDNA)合成后加入T4DNA多聚酶，37℃保温10 min，削平双链cDNA的两端，以便于后续的连加人工接头反应. 在cDNA第1,2链的合成过程中均取出一小份反应体系，加入[α-32P]dCTP以示踪cDNA合成的效果. ③用T4DNA连接酶将EcoRI人工接头与削平后的dscDNA连接，用Sephacryl-S400柱去除小于500 bp的cDNA片段及游离的EcoRI人工接头. 用T4多核苷酸激酶对连接上cDNA的人工接头磷酸化,然后再与去磷酸化的λgt11噬菌体左、右臂相连，连接体加入到噬菌体体外包装系统中，22℃保温3 h包装成噬菌体. 混合多份包装产物建成重组λgt11噬菌体文库. ④取出1 μL的包装噬菌体，按1∶1000和1∶10 000倍稀释后感染对数生长期的E.coli Y1090，铺平板，并在上层培养基中加入终浓度为5 g.L-1的IPTG和11 g.L-1的x-Gal,37℃培养过夜，次日数噬斑数目及蓝、白噬斑之比，计算出文库的大小;为了验证插入的cDNA片段的平均大小，我们将与构建文库用的同一批cDNA加上EcoRI人工接头后,与经内切酶EcoRI酶切并去磷酸化的质粒载体Bluescript SK相连，并转化感受态细菌TG1，同样铺平板加入IPTG和X-Gal，37℃培养过夜，次日挑出9个白色细菌斑,分别接种入5 mL液体LB培养基中培养,小量提取质粒,并用内切酶EcoRI酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定切出片段的大小.
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2 结果
2.1 总RNA及mRNA的提取及纯化 总RNA提取出来之后，经变性凝胶电泳[3]. 结果表明，总RNA主要是28S和18S rRNA，且28S带的亮度是18S带亮度的2倍以上，说明总RNA提取完好，未被降解(Fig 1). 总RNA经过Oligotex纯化柱纯化后，获得mRNA，经测定约占总RNA量的1.84%，且A260 nm与A280 nm的比值大于2.0，说明mRNA足够纯净，符合建库要求.
图 1 人肝癌细胞总RNA的10 mL.L-1甲醛变性凝胶电泳
Fig 1 Total RNA of human hepatocarcinoma cell
, 百拇医药
line was analyzed on 10 mL.L-1 formaldehyde denaturing agarose
2.2 cDNA第1，2链的合成及鉴定 合成的cDNA第1，2链的示踪物经14 g.L-1的碱性琼脂糖凝胶电泳[4]，并经放射自显影结果表明，cDNA的第1链大小从约300 bp到9 kb，片段集中区在1.5～3.0 kb之间，cDNA第2链分布与第1链相似，只是影像更清晰，两链黑度分布均匀，为连续拖影，没有特异带型，完全符合哺乳动物细胞mRNA的分布规律(Fig 2)[5].
图 2 第1,2链cDNA碱性琼脂糖凝胶电泳后放射自显影
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Fig 2 Autoradiogram of sscDNA, dscDNA synthesized after electrophoressis
A:[α-32P]dCTP labeled λ/HindⅢ Marker; B:sscDNAs; C:dscDNAs.
2.3 文库的大小及重组子插入片段分析 合并多份包装体系后测得文库共含噬菌体1.2×106个，其中重组子(白色噬斑)与野生型(蓝色噬斑)之比为12∶1，重组子插入片段的大小是评价文库质量的重要标准，还由于质粒载体较噬菌体载体在提取、纯化、电泳等方面的易操作性，我们将与构建文库用的同一批cDNA插入到质粒载体中然后酶切鉴定，应能间接但真实地反映出噬菌体文库中插入片段的大小，从Fig 3看出9个重组质粒中均切出插入片段，且大小不一，平均大小约1.5 kb，达到了高质量文库的要求.
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图 3 质粒重组子EcoRI酶切图谱
Fig 3 Recombinant plasmids were cut by EcoRI
1.1 kb ladder marker; 2～10 plasmids.
3 讨论
由于很多目标蛋白质难以纯化以用于测定其氨基酸序列，还由于噬菌体体外包装效率及对细菌的感染力均大大超过质粒对细菌的转化，所以用噬菌体构建cDNA表达文库筛选目的克隆是用免疫学方法筛选目的基因的最佳选择之一. 但它同样会遇到在将来的筛库过程中抗体能否与变性抗原识别的问题，故我们在建库之前，已用抗体与多株肝癌细胞做了免疫荧光及Western免疫印迹试验，最后选择了一株阳性结果较好的肝癌细胞作为建库材料，这就大大减少了将来筛库的风险性.
目前，商品化的反转录试剂盒中所用的反转录酶以AMV(禽源反转录酶)居多，此酶对于较短片段和均一片段的反转录应该是合适的，但由于其本身含有较强的RNaseH活性和往往掺杂有核酸内切酶[6]，特别是核酸内切酶活性对于逆转录反应已完成的cDNA第2链合成的影响甚大，经过多次实践，我们选用的反转录酶ExpandTM Reverse Transcriptase是RNaseH活性突变掉的基因工程反转录酶，也没有核酸酶的污染，不存在降解cDNA的缺陷，且合成效率也大大提高.
, 百拇医药
典型的哺乳动物细胞含有10 000～30 000种不同的mRNA序列，还分为低丰度、中丰度和高丰度3种，其中低丰度的mRNA<14拷贝/细胞. 要克隆低丰度mRNA，可按Clare[7]的公式计算文库的大小，N=ln(1-P)/ln(1-1/n)(N为所需克隆数，P为要求的概率，1/n为低丰度mRNA在总mRNA中所占的相对比例)，因此，若要求以99%的概率得到一低丰度的克隆，所要求的文库克隆数为1.7×105，我们所建文库超过了这一标准，应适合用于筛选目的克隆.
作者简介：黄宝成(1968-)，男(汉族)，江西省清岗市人. 博士生(导师姜绍谆，陈志南). Tel.(029)3374547 Email. xiahuang@pub.xaonline.com
黄宝成(第四军医大学基础部 细胞工程研究中心)
陈志南(第四军医大学基础部 细胞工程研究中心)
, 百拇医药
徐力青(第四军医大学基础部 细胞工程研究中心)
姜绍谆(微生物学教研室，陕西 西安 710033)
参考文献：
[1]汤钊猷. 我国肝癌研究的进展与展望[J]. 中国癌症杂志，1997;7(3):151-154.
[2]Young RA, Davis. Efficient isolation of gene by using antibody probes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1983;80(5):1194-1198.
[3]金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京：科学出版社，1992：366-367.
, http://www.100md.com
[4]金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京：科学出版社，1992：316-18.
[5]Linzer DIH, Nathans D. Growth-related changes in specific mRNA of cultured ouse cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1983;80(14):4271-4275.
[6]Verma I M. Reverse transcripatase[M]. In: Boyer PD ed. The enzymes[M]. 3rd ed. New York: Acad Press, 1981:87-95.
[7]Clare L, Cardon J. A colony bank containing sythetic ColE, hybrid plasmids representative of the entire E.coli genome[J]. Cell, 1976;9(1):91-95., http://www.100md.com
黄宝成 陈志南 徐力青 姜绍谆
摘 要：目的 构建人肝癌细胞cDNA表达文库. 方法 从人肝癌细胞中提取总RNA并纯化出mRNA,反转录合成第一、二链cDNA，除去小于500 bp cDNA片段，连接EcoRI人工接头，与去磷酸化的λgt11噬菌体左、右臂连接，体外包装后建成cDNA文库. 取出一部分感染E.coli Y1090，测定文库大小并酶切鉴定插入cDNA片段的大小. 结果 构建成含1.2×106重组子人肝癌细胞cDNA文库，重组子平均插入外源片段长约1.5 kb. 结论 构建的文库合格，适合用于筛选目的cDNA克隆.
关键词：人肝癌细胞；cDNA文库
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0 引言
20世纪90年代起,原发性肝癌已上升为我国第二位癌症杀手,加紧对其复发、转移机制及相关抗原的基础研究工作十分必要[1]. 我室多年来制备了数株肝癌特异性单克隆抗体，其中一株抗体与放射性核素的交联物治疗肝癌已处在临床验证阶段. 找到这几株单抗的相应抗原基因对肝癌的基础研究应很有意义. 利用抗体寻找抗原基因的最有效方法是构建cDNA文库[2]，继而进行筛选、克隆等. 我们选取与几株单抗的免疫荧光及Western免疫印迹反应均呈阳性结果的肝癌细胞株HHCC作为建库材料来源，以λgt11 DNA为载体，构建了人肝癌细胞cDNA表达文库.
1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞株 HHCC为本室保存， E.coli Y1090hsdR株、λgt11噬菌体去磷酸化的左、右臂DNA购自Promega公司，质粒Bluescript SK及感受态细菌TG1为本室保存. TRIZOL试剂购自美国Gibco公司,Oligotex mRNA kit购自Qiagen公司，Universal Riboclone cDNA Synthesis kit购自Promega公司，ExpandTM Reverse Transcriptase购自宝灵曼公司，Lambda Packaging kit购自Phamacia公司,[α-32P]dCTP系北京亚辉生物医学工程公司产品.
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1.2 方法 ①培养HHCC至旺盛生长期，倾去培养液后加入TRIZOL试剂，裂解细胞并抽提出总RNA;用Oligotex mRNA kit试剂从总RNA中纯化出含poly A的mRNA，并用紫外分光光度计(Perkin Elmer公司产品)测定其纯度及含量. ②以6 μg的mRNA为模板，3 μg Oligo(dT)15为引物，ExpandTM Reverse Transcriptase为反转录酶，42℃,60 min合成cDNA第1链；然后向其中加入10×第2链缓冲液，再加入DNA聚合酶I及 RNaseH, 22℃保温60 min合成cDNA第2链；双链cDNA(dscDNA)合成后加入T4DNA多聚酶，37℃保温10 min，削平双链cDNA的两端，以便于后续的连加人工接头反应. 在cDNA第1,2链的合成过程中均取出一小份反应体系，加入[α-32P]dCTP以示踪cDNA合成的效果. ③用T4DNA连接酶将EcoRI人工接头与削平后的dscDNA连接，用Sephacryl-S400柱去除小于500 bp的cDNA片段及游离的EcoRI人工接头. 用T4多核苷酸激酶对连接上cDNA的人工接头磷酸化,然后再与去磷酸化的λgt11噬菌体左、右臂相连，连接体加入到噬菌体体外包装系统中，22℃保温3 h包装成噬菌体. 混合多份包装产物建成重组λgt11噬菌体文库. ④取出1 μL的包装噬菌体，按1∶1000和1∶10 000倍稀释后感染对数生长期的E.coli Y1090，铺平板，并在上层培养基中加入终浓度为5 g.L-1的IPTG和11 g.L-1的x-Gal,37℃培养过夜，次日数噬斑数目及蓝、白噬斑之比，计算出文库的大小;为了验证插入的cDNA片段的平均大小，我们将与构建文库用的同一批cDNA加上EcoRI人工接头后,与经内切酶EcoRI酶切并去磷酸化的质粒载体Bluescript SK相连，并转化感受态细菌TG1，同样铺平板加入IPTG和X-Gal，37℃培养过夜，次日挑出9个白色细菌斑,分别接种入5 mL液体LB培养基中培养,小量提取质粒,并用内切酶EcoRI酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定切出片段的大小.
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2 结果
2.1 总RNA及mRNA的提取及纯化 总RNA提取出来之后，经变性凝胶电泳[3]. 结果表明，总RNA主要是28S和18S rRNA，且28S带的亮度是18S带亮度的2倍以上，说明总RNA提取完好，未被降解(Fig 1). 总RNA经过Oligotex纯化柱纯化后，获得mRNA，经测定约占总RNA量的1.84%，且A260 nm与A280 nm的比值大于2.0，说明mRNA足够纯净，符合建库要求.
图 1 人肝癌细胞总RNA的10 mL.L-1甲醛变性凝胶电泳
Fig 1 Total RNA of human hepatocarcinoma cell
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line was analyzed on 10 mL.L-1 formaldehyde denaturing agarose
2.2 cDNA第1，2链的合成及鉴定 合成的cDNA第1，2链的示踪物经14 g.L-1的碱性琼脂糖凝胶电泳[4]，并经放射自显影结果表明，cDNA的第1链大小从约300 bp到9 kb，片段集中区在1.5～3.0 kb之间，cDNA第2链分布与第1链相似，只是影像更清晰，两链黑度分布均匀，为连续拖影，没有特异带型，完全符合哺乳动物细胞mRNA的分布规律(Fig 2)[5].
图 2 第1,2链cDNA碱性琼脂糖凝胶电泳后放射自显影
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Fig 2 Autoradiogram of sscDNA, dscDNA synthesized after electrophoressis
A:[α-32P]dCTP labeled λ/HindⅢ Marker; B:sscDNAs; C:dscDNAs.
2.3 文库的大小及重组子插入片段分析 合并多份包装体系后测得文库共含噬菌体1.2×106个，其中重组子(白色噬斑)与野生型(蓝色噬斑)之比为12∶1，重组子插入片段的大小是评价文库质量的重要标准，还由于质粒载体较噬菌体载体在提取、纯化、电泳等方面的易操作性，我们将与构建文库用的同一批cDNA插入到质粒载体中然后酶切鉴定，应能间接但真实地反映出噬菌体文库中插入片段的大小，从Fig 3看出9个重组质粒中均切出插入片段，且大小不一，平均大小约1.5 kb，达到了高质量文库的要求.
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图 3 质粒重组子EcoRI酶切图谱
Fig 3 Recombinant plasmids were cut by EcoRI
1.1 kb ladder marker; 2～10 plasmids.
3 讨论
由于很多目标蛋白质难以纯化以用于测定其氨基酸序列，还由于噬菌体体外包装效率及对细菌的感染力均大大超过质粒对细菌的转化，所以用噬菌体构建cDNA表达文库筛选目的克隆是用免疫学方法筛选目的基因的最佳选择之一. 但它同样会遇到在将来的筛库过程中抗体能否与变性抗原识别的问题，故我们在建库之前，已用抗体与多株肝癌细胞做了免疫荧光及Western免疫印迹试验，最后选择了一株阳性结果较好的肝癌细胞作为建库材料，这就大大减少了将来筛库的风险性.
目前，商品化的反转录试剂盒中所用的反转录酶以AMV(禽源反转录酶)居多，此酶对于较短片段和均一片段的反转录应该是合适的，但由于其本身含有较强的RNaseH活性和往往掺杂有核酸内切酶[6]，特别是核酸内切酶活性对于逆转录反应已完成的cDNA第2链合成的影响甚大，经过多次实践，我们选用的反转录酶ExpandTM Reverse Transcriptase是RNaseH活性突变掉的基因工程反转录酶，也没有核酸酶的污染，不存在降解cDNA的缺陷，且合成效率也大大提高.
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典型的哺乳动物细胞含有10 000～30 000种不同的mRNA序列，还分为低丰度、中丰度和高丰度3种，其中低丰度的mRNA<14拷贝/细胞. 要克隆低丰度mRNA，可按Clare[7]的公式计算文库的大小，N=ln(1-P)/ln(1-1/n)(N为所需克隆数，P为要求的概率，1/n为低丰度mRNA在总mRNA中所占的相对比例)，因此，若要求以99%的概率得到一低丰度的克隆，所要求的文库克隆数为1.7×105，我们所建文库超过了这一标准，应适合用于筛选目的克隆.
作者简介：黄宝成(1968-)，男(汉族)，江西省清岗市人. 博士生(导师姜绍谆，陈志南). Tel.(029)3374547 Email. xiahuang@pub.xaonline.com
黄宝成(第四军医大学基础部 细胞工程研究中心)
陈志南(第四军医大学基础部 细胞工程研究中心)
, 百拇医药
徐力青(第四军医大学基础部 细胞工程研究中心)
姜绍谆(微生物学教研室，陕西 西安 710033)
参考文献：
[1]汤钊猷. 我国肝癌研究的进展与展望[J]. 中国癌症杂志，1997;7(3):151-154.
[2]Young RA, Davis. Efficient isolation of gene by using antibody probes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1983;80(5):1194-1198.
[3]金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京：科学出版社，1992：366-367.
, http://www.100md.com
[4]金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京：科学出版社，1992：316-18.
[5]Linzer DIH, Nathans D. Growth-related changes in specific mRNA of cultured ouse cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1983;80(14):4271-4275.
[6]Verma I M. Reverse transcripatase[M]. In: Boyer PD ed. The enzymes[M]. 3rd ed. New York: Acad Press, 1981:87-95.
[7]Clare L, Cardon J. A colony bank containing sythetic ColE, hybrid plasmids representative of the entire E.coli genome[J]. Cell, 1976;9(1):91-95., http://www.100md.com