抗白念珠菌单抗的保护性研究
抗白念珠菌单抗的保护性研究
王鲁 刁庆春 刘荣卿 钟白玉
摘 要： 目的 证实抗白念珠菌保护性抗体存在，为保护机制以及保护性工程抗体的研究打下基础。方法 在实验动物模型中观察单抗影响白念珠菌感染动物存活时间、感染动物重要脏器的组织病理变化、相应组织中白念珠菌cfu等。结果 1B5、3E8这2株单抗能显著延长致死量白念珠菌感染小鼠存活时间，减少感染小鼠主要脏器组织中白念珠菌cfu，减轻相应组织的病理损害。结论 1B5和3E8皆是具有保护作用的抗白念珠菌胞壁外膜单克隆抗体。
关键词：白念珠菌；单克降抗体；保护性抗体
目前，白念珠菌(以下简称白念)已成为医院感染中最常见的病原菌之一[1，2]。近来研究发现机体体液免疫在抗系统性念珠菌感染中发挥重要作用[3]。本研究将已制备的3株抗白念胞壁外膜成分单克隆抗体——1B5、3E8、4C7单抗[4]，运用了系统性念珠菌病动物模型实验研究中，观察单抗对白念感染动物的保护作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌种及实验动物
本科真菌室保存菌株——白念19(白19)，重新培养、鉴定。BALB/C纯系小鼠由本校实验动物中心提供。
1.2 三株抗白念胞壁外膜单克隆抗体的制备及其1B5单抗的鉴定[4]
1.3 单抗对致死量白念感染小鼠存活时间的影响[5，6]
1.3.1实验动物分组 8～10周龄BALB/C小鼠随机分成4组——1B5组、3E8组、4C7组和阴性对照组，每组10只小鼠。
1.3.2 腹水单抗预处理 参考徐志凯[7]方法。
, 百拇医药
1.3.3 实验步骤 4组小鼠经腹腔分别注入相应1B5、3E8、4C7腹水单抗和阴性腹水(不含单抗的SP 2/0腹水)各0.2 ml，4 h后每只小鼠经尾静脉注入白19菌液0.1 ml(含白19静止时相孢子107)，间隔12 h观察小鼠存活情况，记录小鼠死亡时间。
1.4 单抗对半数致死量白念感染小鼠肾、肝、脑脏器的重量变化、组织病理以及相应组织中白念菌落形成单位(cfu)的影响[8]
1.4.1 实验动物分组 8～10周龄BALB/C小鼠随机分成3组——1B5组、3E8组和阴性对照组，每组10只小鼠。
1.4.2 腹水单抗预处理 同前述
1.4.3 实验步骤 3组小鼠经腹腔分别注入1B5、3E8腹水单抗和阴性腹水0.2 ml，4 h后经小鼠尾静脉注入白19菌液(含白19静止时相孢子5×106)，48 h后小鼠脱颈处死，无菌条件下摘取各组小鼠肾、肝、脑脏器并称重，一半脏器组织放入Bouin's液固定，做组织病理学检查(HE染色，PAS染色)，另一半用以测定相应组织中白念cfu。
, 百拇医药
1.5 统计学处理
非连续性数据资料采用非参数秩和检验；连续性数据资料采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 单抗对致死量白念感染小鼠的存活时间的影响
2单组注射组-1B5组和3E8组小鼠的存活时间显著长于阴性对照组小鼠的存活时间；4C7组小鼠的存活时间与阴性对照组无显著差异，见表1。
表1 致死量白念感染小鼠存活时间(
±s)
Tab 1 Survival time of mice infected with lethal dose
, 百拇医药
of candida albicans(±s)
Groups
(t/d)
n
1B5
9.3±1.6* *
10
3E8
8.8±1.3* *
, 百拇医药 10
4C7
4.5±0.7*
10
Control
4.4±0.7
10
*:P>0.05 vs control;* *：P<0.01 vs control
2.2 单抗对半数致死量白念感染小鼠肾、肝、脑组织中白念cfu的影响
1B5和3E8组小鼠肾、肝组织中白念cfu显著低于阴性对照组，1B5和3E8组小鼠脑中白念cfu为0，而对照组中脑组织白念cfu为(14.36±3.75)×103/g，见表2。
, 百拇医药
表2 半数致死量白念感染小鼠肾、肝、脑中的白念cfu(±s,n=10)
Tab 2 Candida albicans cfu in the kidneys, liver and brain of mice infected with half lethal dose of candida albicans(±s,n=10)
Groups
(×103/g)
, 百拇医药
Kindey
Liver
Brain
1B5
99.69±11.927*
12.21±1.818*
0
3E8
170.85±16.643*
12.83±1.575*
0
, 百拇医药
Control
859.41±62.185
93.11±8.692
14.36±3.751
*:P<0.01 vs control
2.3 单抗影响半数致死量白念感染小鼠肾、肝、脑组织病理变化
1B5、3E8组20只小鼠中有4只小鼠肾脏和1只小鼠肝脏普通病理切片发现有1～2处轻度炎性细胞聚集，PAS染色未见白念孢子和菌丝，其余小鼠肾、肝、脑组织中未见明显病理学改变。阴性对照组中所有小鼠肾、肝、脑组织皆有明显组织病理学改变，三种组织中皆可见到较多灶性炎症细胞浸润灶，PAS染色发现肾脏炎性浸润灶中有大量的白念孢子、菌丝；各脏器损害严重程度依次为：肾>肝>脑。
, 百拇医药
2.4 单抗对半数致死量白念感染小鼠肾、脑脏器的重量变化影响
1B5和3E8组小鼠肾、肝、脑脏器重量显著低于阴性对照组中小鼠肾、肝、脑脏器的重量，见表3。
表3 半数致死量白念感染小鼠肾、肝、脑脏器的重量(g,±s,n=10)
Tab 3 Weight of the kidneys, liver, brain of mice infected with
half lethal dose of candida albieans(g,±s,n=10)
, http://www.100md.com
Groups
Kidney
Liver
Brain
1B5
0.246±0.0.0165*
0.82 ±0.0283*
0.249±0.0195*
3E8
0.234±0.0151*
0.811±0.0145*
, 百拇医药
0.28 ±0.0137*
Control
0.282±0.0148
0.924±0.0158
0.435±0.0196
*：P<0.01 vs control
3 讨论
80年代中末期以来，Matthews等[9]发现抗白念珠菌HSP 90亚单位(分子量约47×103)抗原的抗体与系统性念珠菌病的转归有关，这种抗体能延长白念感染小鼠的存活时间。Han等提供了抗白念保护性抗体免疫存在的有力证据，单抗-MAbB6.1能保护免疫功能正常小鼠和联合免疫缺陷小鼠抵抗白念的攻击，延长小鼠存活时间，减少感染小鼠肾、肝组织中白念cfu[8，11]。抗白念粘附素受体iC3b抗体能阻断白念对人真皮微血管内皮细胞的粘附，动物实验中该单抗具有保护作用[12]。
, 百拇医药
针对抗体保护性研究，取决于以下三个实验结果：①抗体能否延长致死量白念感染小鼠的存活时间；②抗体能否减少白念感染小鼠重要脏器组织中白念cfu；③抗体能否减轻感染小鼠主要脏器组织的病理损害。本文通过单抗影响致死量白念珠菌感染小鼠存活时间实验筛选得到2株能延长致死量白念感染小鼠存活时间的抗白念胞型外膜成分单抗——1B5和3E8。再将单抗-1B5、3E8进行其它保护性实验研究，结果表明1B5和3E8单抗皆能显著降低半数致死量白念感染小鼠肾肝组织有白念cfu。这里应特别指出，2株单抗注射组中小鼠脑组织内白念cfu为“0”，并非表明这2株单抗能完全阻止白念对小鼠脑组织的侵袭，客观的解释是单抗1B5、3E8既能降低感染小鼠肾、肝组织中白念cfu，同样也能减少脑组织中白念cfu，只是我们在检测该项指标时对接种物稀释过量，导致单抗组小鼠脑组织中白念cfu检测结果“阴性”。在感染小鼠重要脏器组织病理变化检测中，1B5和3E8这2株单抗能显著减轻白念珠菌所致感染小鼠肾、肝、脑等主要脏器的组织病理损害。故而，我们从定量病原菌角度得出1B5和3E8 2株单抗皆能降低白念感染小鼠肾、肝、脑等重要脏器组织中白念感染数目，明显改善由白念感染所致小鼠肾、肝、脑等主要脏器的病理损害。另外，我们还发现1B5、3E8 2株单抗能减少白念感染小鼠肾、肝、脑脏器组织的重量变化，推测这可能是单抗减轻感染小鼠主要脏器炎性水肿的结果。
, 百拇医药
在检测感染小鼠重要器官组织中白念cfu时，不论是阴性对照组中的肾、肝、脑，还是单抗注射组中肾、肝脏器，尽管各组以及因组织不同而白念cfu检测值不同，但皆有白念cfu阳性检出结果，而在相应组织病理学检查中，仅有阴性对照组中肾组织PAS染色发现白念孢子和菌丝，而阴性对照组的肝、脑组织以及单抗注射组的肾、肝、脑组织切片PAS染色均未发现孢子和菌丝，在这一点，我们也认为在保护性抗体筛选实验中，检测真菌cfu的敏感性要比检查相应组织病理学改变强[12]。
因此，通过抗白念珠菌单抗保护性实验，我们可以得出以下结论：2株抗白念珠菌胞壁外膜成份单克隆抗体1B5和3E8，皆能减少白念珠菌感染小鼠主要脏器组织中白念珠菌感染数目，减轻相应组织的病理损害，延长致死量白念珠菌感染小鼠的存活时间。故而，3E8和1B5皆是具有保护作用的抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体。
作者简介：王鲁(1963-)，男，山东省莱阳市人，博士，副主任医师，副教授，主要从事医学真菌学方面的研究，发表论文10篇。电话：(023)68754000-73080
, http://www.100md.com
王鲁(第三军医大学附属西南医院皮肤科 重庆，400038)
刁庆春(第三军医大学附属西南医院皮肤科 重庆，400038)
刘荣卿(第三军医大学附属西南医院皮肤科 重庆，400038)
钟白玉(第三军医大学附属西南医院皮肤科 重庆，400038)
参考文献
[1] Jarvis W R. Epidemiology of nosocomial fungal infection with emphasis on candida species[J]. Clin Infect Dis,1995,20(4):1 526-1 530.
[2] Voss A, Le-Noble J, Verdugn F, et al. Candidemia in intensive care unit patients risk factor for mortality[J]. Infection,1997,25(1):8-11.
, 百拇医药
[3] Matthews R C. Pathogenicity determinants of candida albicans: potential targets for immunotherapy[J]. Microbiology,1994,140(8):1 505-1 511.
[4] 王 鲁，刁庆春，刘荣卿，等.三株抗白念珠菌单克隆抗体的制备与鉴定[J].第三军医大学学报，2000，22(1)：97-98.
[5] Mukherjee J. Scharff M, Cryptococcus neaformans infection can elicit protective antibodies in mice[J]. Can J Microbiol,1994,40(4):888-892.
[6] Allendoerfer R, Magee D, Smith J, et al. Induction of tumor necrosis factor-alpha in murine candida albicans infection[J]. J Infect Dis,1993,167(5):1 168-1 172.
, 百拇医药
[7] 徐志恺.实用单克隆抗体技术[M].西安：科学技术出版社，1992.1-142.
[8] Han Y, Culter J. Antibody response that protects against disseminated candidiasis[J]. Infect Immun,1995,63(7):2 714-2 719.
[9] Matthews R C, Hodgetts S, Burnie J. Preliminary assessement of a human recombinant antibody fragment to hsp90 in murine invasive candidiasis[J]. J Infect Dis,1995,171(6):1 668-1 671.
[10] Han Y, Kanbe T, Cherniak R, et al. Biochemical cheracterization of candida albicans epitopes that can elicit protective and nonprotective antibodies[J]. Infect Immun,1997,65(10):4 100-4 107.
, http://www.100md.com
[11] Lee K H, Yoon M S, Chun W H. The effects of monoclonal antibodies against iC3b receptors in mice with experimentally induced disseminated candidiasis[J]. Immunology,1997,92(1):104-110.
[12] Mwkherjee J, Scharff M, Casadevall A. Variable efficiency of passive antibody administration against diverse cryptococcus neaformans strains[J]. Infect Immun,1995,63(8):3 353- 3 359., 百拇医药
王鲁 刁庆春 刘荣卿 钟白玉
摘 要： 目的 证实抗白念珠菌保护性抗体存在，为保护机制以及保护性工程抗体的研究打下基础。方法 在实验动物模型中观察单抗影响白念珠菌感染动物存活时间、感染动物重要脏器的组织病理变化、相应组织中白念珠菌cfu等。结果 1B5、3E8这2株单抗能显著延长致死量白念珠菌感染小鼠存活时间，减少感染小鼠主要脏器组织中白念珠菌cfu，减轻相应组织的病理损害。结论 1B5和3E8皆是具有保护作用的抗白念珠菌胞壁外膜单克隆抗体。
关键词：白念珠菌；单克降抗体；保护性抗体
目前，白念珠菌(以下简称白念)已成为医院感染中最常见的病原菌之一[1，2]。近来研究发现机体体液免疫在抗系统性念珠菌感染中发挥重要作用[3]。本研究将已制备的3株抗白念胞壁外膜成分单克隆抗体——1B5、3E8、4C7单抗[4]，运用了系统性念珠菌病动物模型实验研究中，观察单抗对白念感染动物的保护作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌种及实验动物
本科真菌室保存菌株——白念19(白19)，重新培养、鉴定。BALB/C纯系小鼠由本校实验动物中心提供。
1.2 三株抗白念胞壁外膜单克隆抗体的制备及其1B5单抗的鉴定[4]
1.3 单抗对致死量白念感染小鼠存活时间的影响[5，6]
1.3.1实验动物分组 8～10周龄BALB/C小鼠随机分成4组——1B5组、3E8组、4C7组和阴性对照组，每组10只小鼠。
1.3.2 腹水单抗预处理 参考徐志凯[7]方法。
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1.3.3 实验步骤 4组小鼠经腹腔分别注入相应1B5、3E8、4C7腹水单抗和阴性腹水(不含单抗的SP 2/0腹水)各0.2 ml，4 h后每只小鼠经尾静脉注入白19菌液0.1 ml(含白19静止时相孢子107)，间隔12 h观察小鼠存活情况，记录小鼠死亡时间。
1.4 单抗对半数致死量白念感染小鼠肾、肝、脑脏器的重量变化、组织病理以及相应组织中白念菌落形成单位(cfu)的影响[8]
1.4.1 实验动物分组 8～10周龄BALB/C小鼠随机分成3组——1B5组、3E8组和阴性对照组，每组10只小鼠。
1.4.2 腹水单抗预处理 同前述
1.4.3 实验步骤 3组小鼠经腹腔分别注入1B5、3E8腹水单抗和阴性腹水0.2 ml，4 h后经小鼠尾静脉注入白19菌液(含白19静止时相孢子5×106)，48 h后小鼠脱颈处死，无菌条件下摘取各组小鼠肾、肝、脑脏器并称重，一半脏器组织放入Bouin's液固定，做组织病理学检查(HE染色，PAS染色)，另一半用以测定相应组织中白念cfu。
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1.5 统计学处理
非连续性数据资料采用非参数秩和检验；连续性数据资料采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 单抗对致死量白念感染小鼠的存活时间的影响
2单组注射组-1B5组和3E8组小鼠的存活时间显著长于阴性对照组小鼠的存活时间；4C7组小鼠的存活时间与阴性对照组无显著差异，见表1。
表1 致死量白念感染小鼠存活时间(
±s)Tab 1 Survival time of mice infected with lethal dose
, 百拇医药
of candida albicans(
±s)Groups
(t/d)
n
1B5
9.3±1.6* *
10
3E8
8.8±1.3* *
, 百拇医药 10
4C7
4.5±0.7*
10
Control
4.4±0.7
10
*:P>0.05 vs control;* *：P<0.01 vs control
2.2 单抗对半数致死量白念感染小鼠肾、肝、脑组织中白念cfu的影响
1B5和3E8组小鼠肾、肝组织中白念cfu显著低于阴性对照组，1B5和3E8组小鼠脑中白念cfu为0，而对照组中脑组织白念cfu为(14.36±3.75)×103/g，见表2。
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表2 半数致死量白念感染小鼠肾、肝、脑中的白念cfu(
±s,n=10)Tab 2 Candida albicans cfu in the kidneys, liver and brain of mice infected with half lethal dose of candida albicans(
±s,n=10)Groups
(×103/g)
, 百拇医药
Kindey
Liver
Brain
1B5
99.69±11.927*
12.21±1.818*
0
3E8
170.85±16.643*
12.83±1.575*
0
, 百拇医药
Control
859.41±62.185
93.11±8.692
14.36±3.751
*:P<0.01 vs control
2.3 单抗影响半数致死量白念感染小鼠肾、肝、脑组织病理变化
1B5、3E8组20只小鼠中有4只小鼠肾脏和1只小鼠肝脏普通病理切片发现有1～2处轻度炎性细胞聚集，PAS染色未见白念孢子和菌丝，其余小鼠肾、肝、脑组织中未见明显病理学改变。阴性对照组中所有小鼠肾、肝、脑组织皆有明显组织病理学改变，三种组织中皆可见到较多灶性炎症细胞浸润灶，PAS染色发现肾脏炎性浸润灶中有大量的白念孢子、菌丝；各脏器损害严重程度依次为：肾>肝>脑。
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2.4 单抗对半数致死量白念感染小鼠肾、脑脏器的重量变化影响
1B5和3E8组小鼠肾、肝、脑脏器重量显著低于阴性对照组中小鼠肾、肝、脑脏器的重量，见表3。
表3 半数致死量白念感染小鼠肾、肝、脑脏器的重量(g,
±s,n=10)Tab 3 Weight of the kidneys, liver, brain of mice infected with
half lethal dose of candida albieans(g,
±s,n=10), http://www.100md.com
Groups
Kidney
Liver
Brain
1B5
0.246±0.0.0165*
0.82 ±0.0283*
0.249±0.0195*
3E8
0.234±0.0151*
0.811±0.0145*
, 百拇医药
0.28 ±0.0137*
Control
0.282±0.0148
0.924±0.0158
0.435±0.0196
*：P<0.01 vs control
3 讨论
80年代中末期以来，Matthews等[9]发现抗白念珠菌HSP 90亚单位(分子量约47×103)抗原的抗体与系统性念珠菌病的转归有关，这种抗体能延长白念感染小鼠的存活时间。Han等提供了抗白念保护性抗体免疫存在的有力证据，单抗-MAbB6.1能保护免疫功能正常小鼠和联合免疫缺陷小鼠抵抗白念的攻击，延长小鼠存活时间，减少感染小鼠肾、肝组织中白念cfu[8，11]。抗白念粘附素受体iC3b抗体能阻断白念对人真皮微血管内皮细胞的粘附，动物实验中该单抗具有保护作用[12]。
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针对抗体保护性研究，取决于以下三个实验结果：①抗体能否延长致死量白念感染小鼠的存活时间；②抗体能否减少白念感染小鼠重要脏器组织中白念cfu；③抗体能否减轻感染小鼠主要脏器组织的病理损害。本文通过单抗影响致死量白念珠菌感染小鼠存活时间实验筛选得到2株能延长致死量白念感染小鼠存活时间的抗白念胞型外膜成分单抗——1B5和3E8。再将单抗-1B5、3E8进行其它保护性实验研究，结果表明1B5和3E8单抗皆能显著降低半数致死量白念感染小鼠肾肝组织有白念cfu。这里应特别指出，2株单抗注射组中小鼠脑组织内白念cfu为“0”，并非表明这2株单抗能完全阻止白念对小鼠脑组织的侵袭，客观的解释是单抗1B5、3E8既能降低感染小鼠肾、肝组织中白念cfu，同样也能减少脑组织中白念cfu，只是我们在检测该项指标时对接种物稀释过量，导致单抗组小鼠脑组织中白念cfu检测结果“阴性”。在感染小鼠重要脏器组织病理变化检测中，1B5和3E8这2株单抗能显著减轻白念珠菌所致感染小鼠肾、肝、脑等主要脏器的组织病理损害。故而，我们从定量病原菌角度得出1B5和3E8 2株单抗皆能降低白念感染小鼠肾、肝、脑等重要脏器组织中白念感染数目，明显改善由白念感染所致小鼠肾、肝、脑等主要脏器的病理损害。另外，我们还发现1B5、3E8 2株单抗能减少白念感染小鼠肾、肝、脑脏器组织的重量变化，推测这可能是单抗减轻感染小鼠主要脏器炎性水肿的结果。
, 百拇医药
在检测感染小鼠重要器官组织中白念cfu时，不论是阴性对照组中的肾、肝、脑，还是单抗注射组中肾、肝脏器，尽管各组以及因组织不同而白念cfu检测值不同，但皆有白念cfu阳性检出结果，而在相应组织病理学检查中，仅有阴性对照组中肾组织PAS染色发现白念孢子和菌丝，而阴性对照组的肝、脑组织以及单抗注射组的肾、肝、脑组织切片PAS染色均未发现孢子和菌丝，在这一点，我们也认为在保护性抗体筛选实验中，检测真菌cfu的敏感性要比检查相应组织病理学改变强[12]。
因此，通过抗白念珠菌单抗保护性实验，我们可以得出以下结论：2株抗白念珠菌胞壁外膜成份单克隆抗体1B5和3E8，皆能减少白念珠菌感染小鼠主要脏器组织中白念珠菌感染数目，减轻相应组织的病理损害，延长致死量白念珠菌感染小鼠的存活时间。故而，3E8和1B5皆是具有保护作用的抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体。
作者简介：王鲁(1963-)，男，山东省莱阳市人，博士，副主任医师，副教授，主要从事医学真菌学方面的研究，发表论文10篇。电话：(023)68754000-73080
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王鲁(第三军医大学附属西南医院皮肤科 重庆，400038)
刁庆春(第三军医大学附属西南医院皮肤科 重庆，400038)
刘荣卿(第三军医大学附属西南医院皮肤科 重庆，400038)
钟白玉(第三军医大学附属西南医院皮肤科 重庆，400038)
参考文献
[1] Jarvis W R. Epidemiology of nosocomial fungal infection with emphasis on candida species[J]. Clin Infect Dis,1995,20(4):1 526-1 530.
[2] Voss A, Le-Noble J, Verdugn F, et al. Candidemia in intensive care unit patients risk factor for mortality[J]. Infection,1997,25(1):8-11.
, 百拇医药
[3] Matthews R C. Pathogenicity determinants of candida albicans: potential targets for immunotherapy[J]. Microbiology,1994,140(8):1 505-1 511.
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[6] Allendoerfer R, Magee D, Smith J, et al. Induction of tumor necrosis factor-alpha in murine candida albicans infection[J]. J Infect Dis,1993,167(5):1 168-1 172.
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[10] Han Y, Kanbe T, Cherniak R, et al. Biochemical cheracterization of candida albicans epitopes that can elicit protective and nonprotective antibodies[J]. Infect Immun,1997,65(10):4 100-4 107.
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[12] Mwkherjee J, Scharff M, Casadevall A. Variable efficiency of passive antibody administration against diverse cryptococcus neaformans strains[J]. Infect Immun,1995,63(8):3 353- 3 359., 百拇医药