人脑胶质瘤Fas和Fas Ligand的表达
人脑胶质瘤Fas和Fas Ligand的表达
陈义军 章翔 步星耀 王占祥 张旭
摘 要：目的 探讨Fas受体配体系统在胶质瘤凋亡调变中的作用和意义. 方法 应用免疫组织化学技术对34例胶质瘤中Fas和Fas Ligand的表达及其意义进行了研究.其中低恶性胶质瘤18例，高恶性16例. 结果 Fas在部分胶质瘤中有表达，其在高分化的Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤的免疫反应阳性率明显低于Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤(P<0.01).FasL在各型胶质瘤中均有表达，其表达强度与胶质瘤的良、恶性程度无明显相关(P>0.05). 结论 Fas-FasL系统在胶质瘤凋亡调变的过程中可能起较重要的作用，Fas可辅助临床判断胶质瘤的良、恶性程度.
关键词：Fas；Fas Ligand；胶质瘤；免疫组织化学
0 引言
, http://www.100md.com
胶质瘤是最常见的颅内肿瘤. 近年来胶质瘤患者的预后并没有明显的改善，浸润性生长的 特性使得根治性外科手术、放疗、化疗及免疫治疗均无法彻底治愈患者. Fas受体-配体系 统 介导的凋亡过程在胶质瘤的研究中特别受到关注[1]，因此我们研究了Fas和Fas-L igand在脑胶质瘤中的表达及其意义.
1 材料和方法
1.1 标本收集 34例脑胶质瘤标本来自西京医院病理科1996～1997年取自神经 外科的手术标本 ，所有标本均经100 mL.L-1中性福尔马林固定，石蜡包埋. 其中胶质瘤Ⅰ级9例，Ⅱ 级9例，Ⅲ 级8例，Ⅳ级8例. 行5 μm连续切片贴于经APES处理的载玻片上. 本实验未选取病理诊断不 能明确分级的病例.
1.2 抗体和试剂 兔抗人Fas(工作浓度1∶100)， 兔抗Fa sL(工作浓度1∶100)均购自武汉博士德公司. ABC试剂盒为Vector公司产品.
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1.3 免疫组化ABC法步骤 ①切片脱蜡至水后经3 mL.L-1双氧水封闭30 min；②3 mol.L-1尿素消化3 0 min；③20 mL.L-1正常羊血清封闭30 min；④兔抗人Fas多克隆抗体(dilu tion 1∶100 )、兔抗人FasL单克隆抗体(dilution 1∶100)，4℃冰箱过夜；⑤滴加羊抗兔二抗(v ector公司，dilution 1∶200)，室温孵育3 h；⑥滴加AB复合物(vector公司，diluti o n 1∶100)，室温孵育4 h ；每步间均以0.01 mol.L-1 PBS (pH 7.4)振洗3次，每 次5 min；⑦DAB-H2O2显色5 min；苏木素衬染，脱水透明，DPX封固.
统计学方法： 采用SPLM统计软件包. 统计阳性标本例数，计算阳性率. 率间比较用卡方检验，P<0.05为统计学有意义.
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2 结果
Fas和Fas-L的免疫组化阳性物质呈棕黄色颗粒状，其表达情况见Tab 1. 5例正常脑组织F as和FasL均为阴性. Fas阳性物质主要位于阳性标本的胶质瘤细胞胞质和胞膜，以胞质为主 (Fig 1)，多为散在分布为主，部分可呈局灶性分布. 其中18例Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤中阳性4例 ，16例Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中阳性14例，其阳性率在两类胶质瘤中有明显差异(P<0.01).
表1 胶质瘤中Fas和 FasL蛋白的表达
Tab 1 Fas and FasL expression in human gliomas
Grade of
glioma
Cases
, 百拇医药
No. of
negative
No. of weakly
positive
No. of stro ng
positive
Fas
Fas-L
Fas
Fas-L
Fas
Fas-L
, 百拇医药
Ⅰ～Ⅱ
18
14
2
4
12
0
4
Ⅲ～Ⅳ
16
2
2
6
13
, 百拇医药
8
1
图1 胶质瘤Ⅳ级，Fas免疫反应阳性产物位于细胞质
Fig 1 Positive staining of Fas in the cytoplasms of a gradeⅣ glioma ABC ×40 0
Fas-L阳性物质主要位于阳性标本的胶质瘤细胞胞膜和胞质(Fig 2)，在癌组织中阳 性细 胞以弥漫性分布为主，部分可呈局灶性分布. 其中18例Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤中阳性16例，16例 Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中阳性14例，其阳性率在两类胶质瘤中无明显差异(P>0.05).
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图2 胶质瘤Ⅰ级，FasL免疫反应阳性产物位于细胞质
Fig 2 Positive staining of FasL in the cytoplasm of a gradeⅠ glioma ABC ×40 0
3 讨论
Fas在许多组织中均有表达，包括：胸腺、肝脏、心肌、皮肤以及卵巢，但在中枢神经系统 却没有表达[2]. 尽管正常脑组织不表达Fas，许多胶质瘤细胞株却表达Fas. Welle r等[3]发现Fas阳性的培养胶质瘤细胞在暴露给抗Fas抗体时，可激活胶质瘤细胞凋 亡的内源性死 亡途径. 这些发现为胶质瘤的免疫治疗提供了前景. Ohta等[4]发现用脂质体包裹 的抗Fas 抗体诱导胶质瘤凋亡的能力比单独使用抗Fas抗体要强，提示Fas诱导的凋亡并不要求细胞表 面Fas抗原的表达量很大，而主要决定于Fas信号转导的强度. Roth等[1]报道Fas- L对有Fa s表达的LN-229、LN-308和T98G胶质瘤细胞株有明显的杀伤作用，且这种死亡是凋亡. Fas -L诱导的胶质瘤凋亡可以被化学药物doxorubicin和vincristine加强.
, 百拇医药
在免疫系统的细胞调节过程以及T细胞介导的细胞毒性过程中，Fas可以介导凋亡 . Fas和 Fas-L相结合以及抗Fas抗体均可激活凋亡，后者被显示有用于肿瘤治疗的前景，在培养的 人 胶质瘤细胞中，Fas和抗Fas抗体结合可导致凋亡的发生，其敏感性和细胞表面的Fas的表达 量有关系[1]， 同时由于正常脑组织Fas表达为阴性 ，这就给应用抗Fas抗体对胶 质瘤行 免疫治疗提供了可行性，因为这样可以避免广泛的脑坏死，同时在现代不断发展的科技的支 持下，对肿瘤的超选择用药已成为可能，并越来越精细，超选择的用药可以避免抗Fas抗体 引起的全身副作用，因此这种免疫治疗具有良好的研究价值.
Fas在肿瘤中的表达是不同的：支气管肺癌，黑色素瘤及小细胞肺癌Fas/APO-1为阴性或弱 阳 性[5]，侵袭性结肠癌和肾细胞癌为阳性[6]，直肠癌可为阳性、弱阳性、 或阴性[7] . Tachibana等[8]使用反转录PCR的方法发现在脑肿瘤中有Fas mRNA的表达，且表 达程度 与肿瘤恶性程度呈正相关，提示Fas可能在胶质瘤的发病过程中起重要的作用. 我们发现 在部分胶质瘤中，主要是恶性胶质瘤中，Fas蛋白表达阳性，在绝大部分胶质瘤中，Fas-L 的 表达为阳性；而在5例正常脑组织中，Fas和Fas-L在脑胶质细胞中均为阴性. Fas蛋白在 高恶性度的胶质瘤中的表达明显高于低恶性程度的胶质瘤(P<0.05)，Fas-L蛋白的表 达程 度与胶质瘤的恶性程度之间无明显相关性(P>0.05). 提示Fas可能在胶质瘤从低级别 到间 变性或多形性胶质母细胞的演变过程中起作用. Fas表达可能反应了增加了的恶性程度或增 生能力. 另外，也发现在脑肿瘤中有Fas配体的表达. 这些结果提示Fas和Fas-L系统在胶质 瘤的凋亡调变中可能起较重要的作用，且在恶性程度较高的胶质瘤中的作用更明显. Fas有 用于临床辅助判断患者预后可能.
, http://www.100md.com
作者简介：陈义军(1971-)，男(汉族)，湖南省长沙市人.助教，硕士.Tel.(029)3375328 Email.weixia@fmmu.edu.cn
陈义军(第四军医大学：西京医院神经外科，陕西 西安 710033)
章翔(第四军医大学：西京医院神经外科，陕西 西安 710033)
步星耀(第四军医大学：西京医院神经外科，陕西 西安 710033)
王占祥(第四军医大学：西京医院神经外科，陕西 西安 710033)
张旭(第四军医大学：全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
参考文献
[1] Roth W, Fontana A, Trepel M et al. Immunochemotherapy of malignant glioma: Synergistic activity of CD95 ligand and chemotherapeutics [J]. Cancer Immunol Immunoth er, 1997; 44(1): 55-63.
, http://www.100md.com
[2]Nagata S, Golstein P. The Fas death factor [J]. Science,1995;2 67(5203):1449-1456.
[3]Weller M,Malipiero U,Rensing Ehl A. Fas/APO-1 gene trans-fer for human malignant glioma [J]. Cancer Res, 1995; 55(13): 2936-2944.
[4]Ohta S, Mizuno M, Takaoka T. Augmentation of anti-Fas antibody-mediated apoptosis on human glioma cells by liposomes associated with the antibody [J]. J Neurooncol, 1997; 35(1): 7-11.
, 百拇医药
[5]Lebel M, Bertrand R, MesMasson AM. Decreased Fas antigen receptor expression in testicular tumor cell lines derived from polymavirus large T-antigen transgenic mice [J]. Oncogene, 1996;12(5):1127-1135.
[6]Keane MM, Ettenberg SA, Russell E et al. Fas expression and function in normal and malignant breast epithelial cells [J]. Proc Am Asso Cancer Res,1996;37(1) :21.
[7]Nonomura N, Miki T, Yokoyama M et al. Fas/APO-1-mediated apoptosis of human renal cell carcinoma [J]. Biochem Biophys Res Commun,1996;229(3):945-951.
[8]Tachibana O, Nakazawa H, Lampe J. Expression of Fas/APO-1 during the progression of astrocytomas [J]. Cancer Res, 1995; 55(23): 5528-5530., http://www.100md.com
陈义军 章翔 步星耀 王占祥 张旭
摘 要：目的 探讨Fas受体配体系统在胶质瘤凋亡调变中的作用和意义. 方法 应用免疫组织化学技术对34例胶质瘤中Fas和Fas Ligand的表达及其意义进行了研究.其中低恶性胶质瘤18例，高恶性16例. 结果 Fas在部分胶质瘤中有表达，其在高分化的Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤的免疫反应阳性率明显低于Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤(P<0.01).FasL在各型胶质瘤中均有表达，其表达强度与胶质瘤的良、恶性程度无明显相关(P>0.05). 结论 Fas-FasL系统在胶质瘤凋亡调变的过程中可能起较重要的作用，Fas可辅助临床判断胶质瘤的良、恶性程度.
关键词：Fas；Fas Ligand；胶质瘤；免疫组织化学
0 引言
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胶质瘤是最常见的颅内肿瘤. 近年来胶质瘤患者的预后并没有明显的改善，浸润性生长的 特性使得根治性外科手术、放疗、化疗及免疫治疗均无法彻底治愈患者. Fas受体-配体系 统 介导的凋亡过程在胶质瘤的研究中特别受到关注[1]，因此我们研究了Fas和Fas-L igand在脑胶质瘤中的表达及其意义.
1 材料和方法
1.1 标本收集 34例脑胶质瘤标本来自西京医院病理科1996～1997年取自神经 外科的手术标本 ，所有标本均经100 mL.L-1中性福尔马林固定，石蜡包埋. 其中胶质瘤Ⅰ级9例，Ⅱ 级9例，Ⅲ 级8例，Ⅳ级8例. 行5 μm连续切片贴于经APES处理的载玻片上. 本实验未选取病理诊断不 能明确分级的病例.
1.2 抗体和试剂 兔抗人Fas(工作浓度1∶100)， 兔抗Fa sL(工作浓度1∶100)均购自武汉博士德公司. ABC试剂盒为Vector公司产品.
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1.3 免疫组化ABC法步骤 ①切片脱蜡至水后经3 mL.L-1双氧水封闭30 min；②3 mol.L-1尿素消化3 0 min；③20 mL.L-1正常羊血清封闭30 min；④兔抗人Fas多克隆抗体(dilu tion 1∶100 )、兔抗人FasL单克隆抗体(dilution 1∶100)，4℃冰箱过夜；⑤滴加羊抗兔二抗(v ector公司，dilution 1∶200)，室温孵育3 h；⑥滴加AB复合物(vector公司，diluti o n 1∶100)，室温孵育4 h ；每步间均以0.01 mol.L-1 PBS (pH 7.4)振洗3次，每 次5 min；⑦DAB-H2O2显色5 min；苏木素衬染，脱水透明，DPX封固.
统计学方法： 采用SPLM统计软件包. 统计阳性标本例数，计算阳性率. 率间比较用卡方检验，P<0.05为统计学有意义.
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2 结果
Fas和Fas-L的免疫组化阳性物质呈棕黄色颗粒状，其表达情况见Tab 1. 5例正常脑组织F as和FasL均为阴性. Fas阳性物质主要位于阳性标本的胶质瘤细胞胞质和胞膜，以胞质为主 (Fig 1)，多为散在分布为主，部分可呈局灶性分布. 其中18例Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤中阳性4例 ，16例Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中阳性14例，其阳性率在两类胶质瘤中有明显差异(P<0.01).
表1 胶质瘤中Fas和 FasL蛋白的表达
Tab 1 Fas and FasL expression in human gliomas
Grade of
glioma
Cases
, 百拇医药
No. of
negative
No. of weakly
positive
No. of stro ng
positive
Fas
Fas-L
Fas
Fas-L
Fas
Fas-L
, 百拇医药
Ⅰ～Ⅱ
18
14
2
4
12
0
4
Ⅲ～Ⅳ
16
2
2
6
13
, 百拇医药
8
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图1 胶质瘤Ⅳ级，Fas免疫反应阳性产物位于细胞质
Fig 1 Positive staining of Fas in the cytoplasms of a gradeⅣ glioma ABC ×40 0
Fas-L阳性物质主要位于阳性标本的胶质瘤细胞胞膜和胞质(Fig 2)，在癌组织中阳 性细 胞以弥漫性分布为主，部分可呈局灶性分布. 其中18例Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤中阳性16例，16例 Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中阳性14例，其阳性率在两类胶质瘤中无明显差异(P>0.05).
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图2 胶质瘤Ⅰ级，FasL免疫反应阳性产物位于细胞质
Fig 2 Positive staining of FasL in the cytoplasm of a gradeⅠ glioma ABC ×40 0
3 讨论
Fas在许多组织中均有表达，包括：胸腺、肝脏、心肌、皮肤以及卵巢，但在中枢神经系统 却没有表达[2]. 尽管正常脑组织不表达Fas，许多胶质瘤细胞株却表达Fas. Welle r等[3]发现Fas阳性的培养胶质瘤细胞在暴露给抗Fas抗体时，可激活胶质瘤细胞凋 亡的内源性死 亡途径. 这些发现为胶质瘤的免疫治疗提供了前景. Ohta等[4]发现用脂质体包裹 的抗Fas 抗体诱导胶质瘤凋亡的能力比单独使用抗Fas抗体要强，提示Fas诱导的凋亡并不要求细胞表 面Fas抗原的表达量很大，而主要决定于Fas信号转导的强度. Roth等[1]报道Fas- L对有Fa s表达的LN-229、LN-308和T98G胶质瘤细胞株有明显的杀伤作用，且这种死亡是凋亡. Fas -L诱导的胶质瘤凋亡可以被化学药物doxorubicin和vincristine加强.
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在免疫系统的细胞调节过程以及T细胞介导的细胞毒性过程中，Fas可以介导凋亡 . Fas和 Fas-L相结合以及抗Fas抗体均可激活凋亡，后者被显示有用于肿瘤治疗的前景，在培养的 人 胶质瘤细胞中，Fas和抗Fas抗体结合可导致凋亡的发生，其敏感性和细胞表面的Fas的表达 量有关系[1]， 同时由于正常脑组织Fas表达为阴性 ，这就给应用抗Fas抗体对胶 质瘤行 免疫治疗提供了可行性，因为这样可以避免广泛的脑坏死，同时在现代不断发展的科技的支 持下，对肿瘤的超选择用药已成为可能，并越来越精细，超选择的用药可以避免抗Fas抗体 引起的全身副作用，因此这种免疫治疗具有良好的研究价值.
Fas在肿瘤中的表达是不同的：支气管肺癌，黑色素瘤及小细胞肺癌Fas/APO-1为阴性或弱 阳 性[5]，侵袭性结肠癌和肾细胞癌为阳性[6]，直肠癌可为阳性、弱阳性、 或阴性[7] . Tachibana等[8]使用反转录PCR的方法发现在脑肿瘤中有Fas mRNA的表达，且表 达程度 与肿瘤恶性程度呈正相关，提示Fas可能在胶质瘤的发病过程中起重要的作用. 我们发现 在部分胶质瘤中，主要是恶性胶质瘤中，Fas蛋白表达阳性，在绝大部分胶质瘤中，Fas-L 的 表达为阳性；而在5例正常脑组织中，Fas和Fas-L在脑胶质细胞中均为阴性. Fas蛋白在 高恶性度的胶质瘤中的表达明显高于低恶性程度的胶质瘤(P<0.05)，Fas-L蛋白的表 达程 度与胶质瘤的恶性程度之间无明显相关性(P>0.05). 提示Fas可能在胶质瘤从低级别 到间 变性或多形性胶质母细胞的演变过程中起作用. Fas表达可能反应了增加了的恶性程度或增 生能力. 另外，也发现在脑肿瘤中有Fas配体的表达. 这些结果提示Fas和Fas-L系统在胶质 瘤的凋亡调变中可能起较重要的作用，且在恶性程度较高的胶质瘤中的作用更明显. Fas有 用于临床辅助判断患者预后可能.
, http://www.100md.com
作者简介：陈义军(1971-)，男(汉族)，湖南省长沙市人.助教，硕士.Tel.(029)3375328 Email.weixia@fmmu.edu.cn
陈义军(第四军医大学：西京医院神经外科，陕西 西安 710033)
章翔(第四军医大学：西京医院神经外科，陕西 西安 710033)
步星耀(第四军医大学：西京医院神经外科，陕西 西安 710033)
王占祥(第四军医大学：西京医院神经外科，陕西 西安 710033)
张旭(第四军医大学：全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
参考文献
[1] Roth W, Fontana A, Trepel M et al. Immunochemotherapy of malignant glioma: Synergistic activity of CD95 ligand and chemotherapeutics [J]. Cancer Immunol Immunoth er, 1997; 44(1): 55-63.
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[2]Nagata S, Golstein P. The Fas death factor [J]. Science,1995;2 67(5203):1449-1456.
[3]Weller M,Malipiero U,Rensing Ehl A. Fas/APO-1 gene trans-fer for human malignant glioma [J]. Cancer Res, 1995; 55(13): 2936-2944.
[4]Ohta S, Mizuno M, Takaoka T. Augmentation of anti-Fas antibody-mediated apoptosis on human glioma cells by liposomes associated with the antibody [J]. J Neurooncol, 1997; 35(1): 7-11.
, 百拇医药
[5]Lebel M, Bertrand R, MesMasson AM. Decreased Fas antigen receptor expression in testicular tumor cell lines derived from polymavirus large T-antigen transgenic mice [J]. Oncogene, 1996;12(5):1127-1135.
[6]Keane MM, Ettenberg SA, Russell E et al. Fas expression and function in normal and malignant breast epithelial cells [J]. Proc Am Asso Cancer Res,1996;37(1) :21.
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[8]Tachibana O, Nakazawa H, Lampe J. Expression of Fas/APO-1 during the progression of astrocytomas [J]. Cancer Res, 1995; 55(23): 5528-5530., http://www.100md.com