江浙沪地区HLA-DQB1基因对重症肌无力的遗传易感性研究
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江浙沪地区HLA-DQB1基因对重症肌无力的遗传易感性研究
杜可明 张可雄 陈秀珍 左及 夏培莉 吕传真 郝中顺
摘 要 目的：探讨中国汉人MG易感性与HLA-DQB1基因多态性的相关性。方法：运用PCR-RFLP 法进行HLA-DQB1 基因分型。结果：MG病例组(包括亚组)与对照组比较都有DQB1*0303频率的明显增高，DQB1*0601和DQB1*0602频率的明显降低，差异都有显著性。结论：DQB1*0303参与中国汉人MG的易感性，而DQB1*0601和DQB1*0602是保护基因。
关键词：重症肌无力；HLA-DQB1；基因多态性；遗传易感性
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人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen, HLA)是已知人类遗传系统中最具多态性的。它的Ⅱ类基因的DQ亚区基因多态性主要由DQA1、DQB1位点基因第2外显子DNA多态性所决定。目前已认识到HLA-DQ基因多态性在许多自身免疫性疾病的发生中起非常重要的作用[1]，重症肌无力(Myasthenia Gravis, MG)是神经肌肉接头处乙酰胆碱受体自身致敏和破坏所致的自身免疫性疾病，其确切的发病机制迄今尚不清楚。近年的研究表明，MG的易感性与HLA抗原、乙酰胆碱受体和T细胞受体等基因表达有关，具有多基因控制的特点。MG与DQ基因多态性相关联在白人已有报道，并对相关联的DQ抗原分子结构进行了研究，提出了可能的易感肽链结合区[2]。然而，国内这方面的研究刚刚起步，为进一步了解中国人MG的易感机制，本文采用PCR-RFLP方法进行了HLA-DQB1基因多态性与MG易感的相关研究。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 病例 由在上海医科大学华山医院神经内科门诊确诊，并辅以抗乙酰胆碱受体抗体和抗突触前膜受体抗体测定、胸腺CT等检查。本组样本共计60例，其中男性27名，女性33名，年龄最小18岁，最大59岁，胸腺异常以术后病理组织学为确定标准，籍贯分布于江浙沪3个地区的汉人，都无其它自身免疫疾病史和家族史。临床资料不全者统计时不计在内。
1.2 健康对照组 HLA-DQB1的对照组引自文献[3]。
1.3 基因组DNA的提取 按Miller法进行，PCR扩增DQB1目的基因及RFLP按照第11届国际组织相容性会议(1991)推荐方法进行[4，5]。
1.4 统计分析
1.4.1 H-W吻合度测验 为估计病例组和健康组调查资料的可靠性，先按文献[6]所述方法进行H-W吻合度测验。
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1.4.2 关联分析 比较不同组别MG患者与健康对照组表型频率差异时，用Epi Info(version 6.02)软件进行计算，显著性用χ2检验(必要时用Yates公式)校正并直接求出P值；如果四格表中有期望值小于5时，则计算Fisher精确的P值；相对危险度(RR)用Waolf公式计算并用Hadane公式修正。当多项比较时校正的PC＝P值×相比较的等位基因数，PC<0.05时，确认有显著性统计学意义。
2 结果
2.1 资料的可靠性 所有MG患者的HLA-DQB位点检14种等位基因，该位点的基因型期望值和观察值H-W吻合度测验的结果表明两者间差异无显著性(P>0.05)。
2.2 关联分析 将MG病例组以及不同亚型组与对照组比较结果发现都有DQB1*0601和DQB1*0602频率明显降低，DQB1*0303频率明显增高，差别都有显著性意义。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 资料的可靠性 人类主要组织相容性复合体(HLA)是人类最具复杂性的一个遗传系统，其分布具有种族差异，不同种族和不同地区甚至同一地区不同人群，其分布也不相同。由于我国大陆HLA多态性分布以长江为界，大致分为南北两大群体，其HLA抗原分布有明显差异[7]。本课题所有研究资料均来自江浙沪地区，在HLA遗传学上可认为来自同一地区，另外对研究资料进行H-W平衡吻合度测验的结果表明，DQB1位点基因型观察值和期望值之间无统计学意义(P>0.05)，两者的吻合程度高，符合H-W遗传平衡定律，这说明所取样本资料具有代表性，资料可靠。PCR-RFLP分型方法适合于HLA多态性分析。
3.2 关联性分析 人类主要组织相容性复合体(MHC)的Ⅱ类抗原是表达于淋巴细胞、巨噬细胞等表面的糖蛋白，能结合抗原肽并且将它们提呈抗原给T淋巴细胞，这需要T细胞受体在识别抗原肽的同时，细胞表面的其他辅助分子还要与Ⅱ类抗原分子其他区域相互作用，才能共同完成这一过程，MHC-Ⅱ类抗原分子对于免疫反应的启动和调节具有非常重要的作用[8]。MG的易感性与HLA相关联，由Pirskanen等于1972年首先报道，随后引起学者们对此的广泛研究。早期血清学方法已证实与HLA相关联抗原可因种族、性别、发病年龄、临床类型等不同而异，如在白人，MG与HLA-B8和DR3相关联，在日本人，HLA-B12在MG患者中的频率比正常对照组显著增加，在中国、香港和台湾华人MG患者相关抗原为HLA-A2、Bw46和DR9，大陆南北汉人MG患者主要与DR4和DR9抗原相关[9-11]。随着分子生物学方法的应用，国外学者已在DQB1位点发现与MG相关联的易感基因。如白人，与DR3连锁不平衡的DQB1*0201和发病较早的女性MG患者明显相关，伴胸腺增生；而DQB1*0604与胸腺瘤MG患者呈负相关[12-14]；Horiki等报道HLA-DPB1和DQB1基因共同决定日本早发MG的易感性[15]；而牙买加MG与HLA-B8、B13和DQ4呈强相关，在30岁以下发病的女性MG患者与健康对照比较都有DQB1*03频率的明显升高[16]。本文结果表明，MG病例组及其不同亚型组与对照组比较都有DQB1*0303频率显著增加(P<0.05)，与MG呈正相关，这与本室曾发现MG病例组与对照组比较有DQB1*0302频率显著增加的结果不一致[3]，但两者并不矛盾。早年中国血清学研究曾表明，汉人MG患者主要与DR4和DR9相关联，另据文献报道在DQB1位点与DR4连锁是DQB1*0302，与DR9连锁是DQB1*0303[17]，这说明本文结果与前人结果能相互吻合。另外本文还发现DQB1*0601和DQB1*0602与MG呈负相关，而白人MG与DQB1*0604呈负相关，这证实种族间存在差异，但是否也提示种族间可能存在共同保护基因DQB1*06，有待进一步证实。
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3.3 MG的HLA易感单体 根据中国汉人连锁格局，从本文结果可推测MG的易感单体是DQB1*0303 -DQA1*0301。潘星华等曾报道HLA-DQA1*0301 基因参与非胸腺瘤型MG的遗传作用[18]，本文发现DQB1*0303与胸腺增生型MG易感性相关，因而可以说中国汉人胸腺增生型MG易感单体很可能是DQB1*0303 -DQA1*0301，这有待于研究DQA1 -DQB1 单体与MG的相关性来加以证实。
3.4 展望 目前最新研究认为HLA-DQ分子对MG易感性起着非常重要的作用。Hjelmstrom等运用同源模型技术对相关联DQ2(DQB1*02)和DQ6(DQB1*0603)分子进行构建分析，提出锚定肽链结合区P7和P9可能在结合致病肽链时起着重要的作用[2]。Khali等认为由DQA1*01-DQB1*0201 或DQA1*01-DQB1*0201 反式编码的DQ α β异二聚体与MG明显相关，并推测这种异二聚体是MG易感分子[19]。由此可见，研究中国汉人MG的DQA1-DQB1单体和分析相关联基因所编码分子结构是将来研究的方向。
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致谢：感谢日本东海大学Inoko教授在技术方法上的指导。
本课题由国家青年自然科学基金资助(No.39500049)
作者简介：杜可明，33岁，硕士，讲师；
陈秀珍，62岁，教授，硕士生导师，主要从事神经遗传研究
杜可明(山东省泰山医学院医学遗传学教研室，泰安271000)
张可雄(上海医科大学医学遗传学教研室，上海200032)
陈秀珍(上海医科大学医学遗传学教研室，上海200032)
左及(上海医科大学医学遗传学教研室，上海200032)
, 百拇医药 夏培莉(上海医科大学医学遗传学教研室，上海200032)
吕传真(上海医科大学华山医院神经内科，上海 200040)
郝中顺(上海医科大学华山医院神经内科，上海 200040)
参考文献
1，Altmann D M, Sanson D, Marsh S G.What is basis for HLA-DQ associations with autoimmune disease. Immunol Today,1991；12：267
2，Hjelmstrom P,Deweese-Scott C,Penzotti J E et al.Structural differences between HLA-DQ molecules associated with myasthenia gravis characterized by molecular modeling.J Neuroimmunol,1998；85(1)：102
, 百拇医药
3，张克雄，李 霞，左 及 et al.HLA-DQ β遗传多态与重症肌无力遗传易感的易感性.中华神经科杂志，1998；31(3)：348
4，Miller S A,Dykes D D D, Polesky H F et al. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleared cells.Nucl Aci Res,1988；16：1215
5，Inoko H, Ota M. PCR-RFLP.In:Hui K M,Bidwell J L. Handbook of HLA typing technique.Boca Raton:CRC Press，1993：9
6，赵桐茂主编.HLA 分型原理和应用.上海：上海科技出版社，1984：155-157，208
, 百拇医药
7，陈仁彪，赵桐茂，叶根耀 et al.中国大陆HLA多态性联合报告.上海免疫学杂志，1987；7(6)：321
8，Claybergger C, Lyur S C, Dekruyff P et al. Peptides corrsponding to the CD8 and CD4 binding domains of HLA molecules block T lymphocyte immune response in vitro.J Immunol,1994；153：946
9，徐星培，汪超英，郑从义 et al.HLA与重症肌无力相关的研究.中华神经精神科杂志，1987；20(5)：296
10，徐令撰，李建国，张贵忠 et al.12例重症肌无力患者的HLA抗
原分布.北京医学院学报，1985；17(3)：205
, 百拇医药
11，张新根，安家兵，黄若君 et al.儿童重症肌无力患者HLA超型的研究.中华神经精神科杂志，1992；25(6)：385
12，Hjelmstron P, Giscombe R,Lefvert A K et al.Different HLA-DQ are positively and negatively associated in Swedish patients with Myasthenia gravis.Autoimmunity,1995；2(1)：59
13，Spukland A, Gilhus N E, Ronningen K S et al. Myasthenia gravis patients with thymus hyperplasia and myasthenia gravis patients with thymona display differernt HLA association.Tissue Antigens, 1991；37：90
, 百拇医药
14，Vieira M L, Caillat-Zucman S, Gajdond V et al.Identification by genomic typing of non-DR3 HLA class genes associated with myasthenia gravis.J Neuroimmunol ，1993；47：115
15，Horiki T， Inoko H，Moriuchi J et al.Combination of HLA-DPB1 and HLA-DQB1 alleles determine susceptibility to early-onset myasthenia gravis in Japan.Autoimmunity, 1994；19：49
16，Barton E N M, Smikle M, Morgan O S. Myasthenia gravis and HLA phenotype in Jamaicans.Soth Med J, 1992；85：904
, 百拇医药
17，Fernander-vina M A,Gao X, Morase M E et al. Alleles at four HLA class loci determinationed by oligo-nucleotied hybridization and their association in five ethnic groups.Immunogenet, 1991；34：299
18，潘星华，陆建荣，猎子英俊 et al.江浙沪地区汉人HLA-DQA1基因对重症肌无力遗传易感性研究.中华医学遗传学杂志，1995；12(6)：354
19，Khali I,Berrinn-Aknin S,Lepeage V et al. Transencoded DQ α β heterodimers comfer susceptiblity to myasthenia gravis disease C R. Acad Sci Paris，1993；316：652, http://www.100md.com
杜可明 张可雄 陈秀珍 左及 夏培莉 吕传真 郝中顺
摘 要 目的：探讨中国汉人MG易感性与HLA-DQB1基因多态性的相关性。方法：运用PCR-RFLP 法进行HLA-DQB1 基因分型。结果：MG病例组(包括亚组)与对照组比较都有DQB1*0303频率的明显增高，DQB1*0601和DQB1*0602频率的明显降低，差异都有显著性。结论：DQB1*0303参与中国汉人MG的易感性，而DQB1*0601和DQB1*0602是保护基因。
关键词：重症肌无力；HLA-DQB1；基因多态性；遗传易感性
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人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen, HLA)是已知人类遗传系统中最具多态性的。它的Ⅱ类基因的DQ亚区基因多态性主要由DQA1、DQB1位点基因第2外显子DNA多态性所决定。目前已认识到HLA-DQ基因多态性在许多自身免疫性疾病的发生中起非常重要的作用[1]，重症肌无力(Myasthenia Gravis, MG)是神经肌肉接头处乙酰胆碱受体自身致敏和破坏所致的自身免疫性疾病，其确切的发病机制迄今尚不清楚。近年的研究表明，MG的易感性与HLA抗原、乙酰胆碱受体和T细胞受体等基因表达有关，具有多基因控制的特点。MG与DQ基因多态性相关联在白人已有报道，并对相关联的DQ抗原分子结构进行了研究，提出了可能的易感肽链结合区[2]。然而，国内这方面的研究刚刚起步，为进一步了解中国人MG的易感机制，本文采用PCR-RFLP方法进行了HLA-DQB1基因多态性与MG易感的相关研究。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 病例 由在上海医科大学华山医院神经内科门诊确诊，并辅以抗乙酰胆碱受体抗体和抗突触前膜受体抗体测定、胸腺CT等检查。本组样本共计60例，其中男性27名，女性33名，年龄最小18岁，最大59岁，胸腺异常以术后病理组织学为确定标准，籍贯分布于江浙沪3个地区的汉人，都无其它自身免疫疾病史和家族史。临床资料不全者统计时不计在内。
1.2 健康对照组 HLA-DQB1的对照组引自文献[3]。
1.3 基因组DNA的提取 按Miller法进行，PCR扩增DQB1目的基因及RFLP按照第11届国际组织相容性会议(1991)推荐方法进行[4，5]。
1.4 统计分析
1.4.1 H-W吻合度测验 为估计病例组和健康组调查资料的可靠性，先按文献[6]所述方法进行H-W吻合度测验。
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1.4.2 关联分析 比较不同组别MG患者与健康对照组表型频率差异时，用Epi Info(version 6.02)软件进行计算，显著性用χ2检验(必要时用Yates公式)校正并直接求出P值；如果四格表中有期望值小于5时，则计算Fisher精确的P值；相对危险度(RR)用Waolf公式计算并用Hadane公式修正。当多项比较时校正的PC＝P值×相比较的等位基因数，PC<0.05时，确认有显著性统计学意义。
2 结果
2.1 资料的可靠性 所有MG患者的HLA-DQB位点检14种等位基因，该位点的基因型期望值和观察值H-W吻合度测验的结果表明两者间差异无显著性(P>0.05)。
2.2 关联分析 将MG病例组以及不同亚型组与对照组比较结果发现都有DQB1*0601和DQB1*0602频率明显降低，DQB1*0303频率明显增高，差别都有显著性意义。
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3 讨论
3.1 资料的可靠性 人类主要组织相容性复合体(HLA)是人类最具复杂性的一个遗传系统，其分布具有种族差异，不同种族和不同地区甚至同一地区不同人群，其分布也不相同。由于我国大陆HLA多态性分布以长江为界，大致分为南北两大群体，其HLA抗原分布有明显差异[7]。本课题所有研究资料均来自江浙沪地区，在HLA遗传学上可认为来自同一地区，另外对研究资料进行H-W平衡吻合度测验的结果表明，DQB1位点基因型观察值和期望值之间无统计学意义(P>0.05)，两者的吻合程度高，符合H-W遗传平衡定律，这说明所取样本资料具有代表性，资料可靠。PCR-RFLP分型方法适合于HLA多态性分析。
3.2 关联性分析 人类主要组织相容性复合体(MHC)的Ⅱ类抗原是表达于淋巴细胞、巨噬细胞等表面的糖蛋白，能结合抗原肽并且将它们提呈抗原给T淋巴细胞，这需要T细胞受体在识别抗原肽的同时，细胞表面的其他辅助分子还要与Ⅱ类抗原分子其他区域相互作用，才能共同完成这一过程，MHC-Ⅱ类抗原分子对于免疫反应的启动和调节具有非常重要的作用[8]。MG的易感性与HLA相关联，由Pirskanen等于1972年首先报道，随后引起学者们对此的广泛研究。早期血清学方法已证实与HLA相关联抗原可因种族、性别、发病年龄、临床类型等不同而异，如在白人，MG与HLA-B8和DR3相关联，在日本人，HLA-B12在MG患者中的频率比正常对照组显著增加，在中国、香港和台湾华人MG患者相关抗原为HLA-A2、Bw46和DR9，大陆南北汉人MG患者主要与DR4和DR9抗原相关[9-11]。随着分子生物学方法的应用，国外学者已在DQB1位点发现与MG相关联的易感基因。如白人，与DR3连锁不平衡的DQB1*0201和发病较早的女性MG患者明显相关，伴胸腺增生；而DQB1*0604与胸腺瘤MG患者呈负相关[12-14]；Horiki等报道HLA-DPB1和DQB1基因共同决定日本早发MG的易感性[15]；而牙买加MG与HLA-B8、B13和DQ4呈强相关，在30岁以下发病的女性MG患者与健康对照比较都有DQB1*03频率的明显升高[16]。本文结果表明，MG病例组及其不同亚型组与对照组比较都有DQB1*0303频率显著增加(P<0.05)，与MG呈正相关，这与本室曾发现MG病例组与对照组比较有DQB1*0302频率显著增加的结果不一致[3]，但两者并不矛盾。早年中国血清学研究曾表明，汉人MG患者主要与DR4和DR9相关联，另据文献报道在DQB1位点与DR4连锁是DQB1*0302，与DR9连锁是DQB1*0303[17]，这说明本文结果与前人结果能相互吻合。另外本文还发现DQB1*0601和DQB1*0602与MG呈负相关，而白人MG与DQB1*0604呈负相关，这证实种族间存在差异，但是否也提示种族间可能存在共同保护基因DQB1*06，有待进一步证实。
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3.3 MG的HLA易感单体 根据中国汉人连锁格局，从本文结果可推测MG的易感单体是DQB1*0303 -DQA1*0301。潘星华等曾报道HLA-DQA1*0301 基因参与非胸腺瘤型MG的遗传作用[18]，本文发现DQB1*0303与胸腺增生型MG易感性相关，因而可以说中国汉人胸腺增生型MG易感单体很可能是DQB1*0303 -DQA1*0301，这有待于研究DQA1 -DQB1 单体与MG的相关性来加以证实。
3.4 展望 目前最新研究认为HLA-DQ分子对MG易感性起着非常重要的作用。Hjelmstrom等运用同源模型技术对相关联DQ2(DQB1*02)和DQ6(DQB1*0603)分子进行构建分析，提出锚定肽链结合区P7和P9可能在结合致病肽链时起着重要的作用[2]。Khali等认为由DQA1*01-DQB1*0201 或DQA1*01-DQB1*0201 反式编码的DQ α β异二聚体与MG明显相关，并推测这种异二聚体是MG易感分子[19]。由此可见，研究中国汉人MG的DQA1-DQB1单体和分析相关联基因所编码分子结构是将来研究的方向。
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致谢：感谢日本东海大学Inoko教授在技术方法上的指导。
本课题由国家青年自然科学基金资助(No.39500049)
作者简介：杜可明，33岁，硕士，讲师；
陈秀珍，62岁，教授，硕士生导师，主要从事神经遗传研究
杜可明(山东省泰山医学院医学遗传学教研室，泰安271000)
张可雄(上海医科大学医学遗传学教研室，上海200032)
陈秀珍(上海医科大学医学遗传学教研室，上海200032)
左及(上海医科大学医学遗传学教研室，上海200032)
, 百拇医药 夏培莉(上海医科大学医学遗传学教研室，上海200032)
吕传真(上海医科大学华山医院神经内科，上海 200040)
郝中顺(上海医科大学华山医院神经内科，上海 200040)
参考文献
1，Altmann D M, Sanson D, Marsh S G.What is basis for HLA-DQ associations with autoimmune disease. Immunol Today,1991；12：267
2，Hjelmstrom P,Deweese-Scott C,Penzotti J E et al.Structural differences between HLA-DQ molecules associated with myasthenia gravis characterized by molecular modeling.J Neuroimmunol,1998；85(1)：102
, 百拇医药
3，张克雄，李 霞，左 及 et al.HLA-DQ β遗传多态与重症肌无力遗传易感的易感性.中华神经科杂志，1998；31(3)：348
4，Miller S A,Dykes D D D, Polesky H F et al. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleared cells.Nucl Aci Res,1988；16：1215
5，Inoko H, Ota M. PCR-RFLP.In:Hui K M,Bidwell J L. Handbook of HLA typing technique.Boca Raton:CRC Press，1993：9
6，赵桐茂主编.HLA 分型原理和应用.上海：上海科技出版社，1984：155-157，208
, 百拇医药
7，陈仁彪，赵桐茂，叶根耀 et al.中国大陆HLA多态性联合报告.上海免疫学杂志，1987；7(6)：321
8，Claybergger C, Lyur S C, Dekruyff P et al. Peptides corrsponding to the CD8 and CD4 binding domains of HLA molecules block T lymphocyte immune response in vitro.J Immunol,1994；153：946
9，徐星培，汪超英，郑从义 et al.HLA与重症肌无力相关的研究.中华神经精神科杂志，1987；20(5)：296
10，徐令撰，李建国，张贵忠 et al.12例重症肌无力患者的HLA抗
原分布.北京医学院学报，1985；17(3)：205
, 百拇医药
11，张新根，安家兵，黄若君 et al.儿童重症肌无力患者HLA超型的研究.中华神经精神科杂志，1992；25(6)：385
12，Hjelmstron P, Giscombe R,Lefvert A K et al.Different HLA-DQ are positively and negatively associated in Swedish patients with Myasthenia gravis.Autoimmunity,1995；2(1)：59
13，Spukland A, Gilhus N E, Ronningen K S et al. Myasthenia gravis patients with thymus hyperplasia and myasthenia gravis patients with thymona display differernt HLA association.Tissue Antigens, 1991；37：90
, 百拇医药
14，Vieira M L, Caillat-Zucman S, Gajdond V et al.Identification by genomic typing of non-DR3 HLA class genes associated with myasthenia gravis.J Neuroimmunol ，1993；47：115
15，Horiki T， Inoko H，Moriuchi J et al.Combination of HLA-DPB1 and HLA-DQB1 alleles determine susceptibility to early-onset myasthenia gravis in Japan.Autoimmunity, 1994；19：49
16，Barton E N M, Smikle M, Morgan O S. Myasthenia gravis and HLA phenotype in Jamaicans.Soth Med J, 1992；85：904
, 百拇医药
17，Fernander-vina M A,Gao X, Morase M E et al. Alleles at four HLA class loci determinationed by oligo-nucleotied hybridization and their association in five ethnic groups.Immunogenet, 1991；34：299
18，潘星华，陆建荣，猎子英俊 et al.江浙沪地区汉人HLA-DQA1基因对重症肌无力遗传易感性研究.中华医学遗传学杂志，1995；12(6)：354
19，Khali I,Berrinn-Aknin S,Lepeage V et al. Transencoded DQ α β heterodimers comfer susceptiblity to myasthenia gravis disease C R. Acad Sci Paris，1993；316：652, http://www.100md.com