白色念珠菌生物分型法的建立及应用
白色念珠菌生物分型法的建立及应用
温旺荣 王德春 朱忠勇
摘 要： 目的 建立白色念珠菌的生物分型法，并探讨其型别与毒力的关系。方法 临床标本直接接种在生物形态分型培养基上，30℃烛缸或CO2培养箱孵育5 d，立即观察条状菌苔周围的条纹和色素环特征，并用4个数字组成的编码记录型别。这4个数字分别依次表示条纹分布、宽度、质地和色素环宽度。结果 该法把700株临床分离白色念珠菌分成69个型，以0002型(20.6%)为最常见，分辨指数为0.931；红褐色色素环可能是白色念珠菌所特有的，而且不连续条纹与白色念珠菌的毒力相关。结论 生物分型法具有简单、经济、重复性好和分辨率高等优点，可作为一种有用的流行病学调查的工具以预防和监测白色念珠菌感染，尤其医院感染，而且它的型别可以指示白色念珠菌毒力。
, 百拇医药
关键词：白色念珠菌；生物分型法；感染
白色念珠菌是医院感染常见的病原菌，可引起医院感染的暴发流行[1～3]。而且已成为艾滋病、肿瘤、移植和吸毒等的免疫缺陷患者死亡原因之 一。因此，建立一种简单、经济、准确的白色念珠菌分型方法对研究白色念珠菌的致病性和预防、监测白色念珠菌感染的流行病学调查具有十分重要的意义。近年来，有关白色念珠菌分型的报道甚多，各种方法都有一定的应用范围和价值，其中1987年Phongpaichit等[4]报道了一种以菌落形态和条纹特征为基础的形态分型法，1989年Hunter等[5]加以简化且发现型别可能指示白色念珠菌毒力，具有简便、适用和分辨率高等优点。本研究参考该法并加以改进建立了生物分型法，并揭示型别与白色念珠菌毒力的关系。
1 材料与方法
1.1 试验菌株 700株临床分离白色念珠菌，是1990年10月～1996年1月在福建医科大学附属第一医院皮肤科和南京军区福州总院全军检验专科中心直接从疑似念珠菌感染患者的临床标本中分离鉴定获得的。其中痰363株，血液32株，脑脊液5株 ，尿液24株，粪便72株，阴道拭子48株，皮肤64株，口腔分泌物28株和鼻咽分泌物64株。它们的分离鉴定是按照孙氏简化法进行的。菌株以沙保弱琼脂斜面保存于4℃冰箱内。
, 百拇医药
1.2 培养基 生物形态分型培养基和沙保弱琼脂斜面。前者改进了Phongpaichit等报道的麦芽浸出琼脂的成分，增加了酵母浸膏粉、氯霉素和绵羊血。其配方(g/L)是麦芽糖12.75、糊精2.75、甘油2.75、蛋白胨0.28、酵母浸膏粉0.5、氯霉素0.05、琼脂1.7和5%脱纤维绵羊血。除绵羊血外的成分均先溶于pH4.4醋酸盐缓冲液，15磅15 min高压灭菌，待冷至45～50℃时加入5%绵羊血，混匀，立即倾倒灭菌平板，以每块平板倒入18～20 ml培养基。平板可贮存在4℃冰箱内，最好7 d内用完。
1.3 方法
1.3.1 接种 已鉴定好的白色念珠菌转种沙保弱琼脂斜面。30 ℃孵育2 d，取菌落制成浓度为106～107 CFU/ml的1 ml蒸馏水菌悬液，用灭菌棉拭子取菌悬液涂一长条于生物形态分型培养基表面。要求轻轻地以单一划线来回涂于琼脂表面，不要涂破。
, 百拇医药
1.3.2 孵育 划种好的培养基放烛缸或CO2培养箱(含5%～10% CO2)30℃孵育5 d。
1.3.3 观察并记录型别 孵育5 d后，可见不同分离株在菌苔周边的条纹和色素环特征不同。条纹是指菌苔边缘呈菌丝生长的绒毛状结构，有连续的，也有不连续的；有的呈扇形，有的呈树枝状，有的呈纤细平行，其宽度、粗细及占边界的比例也随菌株不同而异。色素环是指菌苔周边呈现的红褐色区带，其宽度随菌株不同而不同。色素环在孵育2 d后就可观察，随后时间里基本上不发生改变。根据条纹分布、宽度、质地和色素环宽度依次排列制定出4个数字组成的编码标准(表1)。按照编码标准记录菌株型别。
1.4 条件选择 取20株条纹和色素环兼有的白色念珠菌，改变试验条件如温度、气体环境和接种菌量，选出获得最佳结果的条件。
1.5 重现率测定 取临床分离株50株 ，用本法分型，重复检测3次。1年半后重测，按照编码标准记录型别，考察型别是否相同以评估重现率。
, 百拇医药
1.6 统计 卡方检验用于统计分析。P<0.05表示深部感染与表面感染之间存在显著性差别。
2 结 果
2.1 培养条件 不同孵育温度(42℃，35℃，30℃，25℃，20℃和4℃)或气体环境(需氧、厌氧和微需氧)被考察。结果显示20℃，25℃，30℃之间无差别。需氧环境，条纹出现要孵育6 d，色素环要3 d；厌氧环境时间更长；微需氧培养条纹出现最多5 d，色素环2 d，且特征明显。菌量在106～108 CFU/ml范围内最适宜，且同株特征在该范围内变化不大。
2.2 重现率测定 50株临床白色念珠菌的型别，当时重复检测3次结果一致，1年半后重测，49株型别完全相同，即重现率达98%。
2.3 不同部位分离菌株的型别 700株临床分离白色念珠菌被分为69个型，最多见的型别是0002型(占20.6%)，分辨指数[6]为0.931。其中363株痰的分离株分为58个型，以0002型为最常见，32株血液的分离株可分为8型，以3222为最多见，24株尿液的分离株可分为4型，以2132为最多见；5株脑脊液的分离株可分为3型，以3322为最多见；72株粪便的分离株可分为14型，以2132为最多见；48株阴道拭子的分离株可分为8型，以5212为最多见；64株皮肤的分离株可分为12型，以0002为最多见；28株口腔分泌物的分离株可分为5型，以7232为最多见；64株鼻咽分泌物的分离株可分为11型，以0002为最多见。
, 百拇医药
表1 分型培养基上生物学特征的编码标准
条纹特征
编 码
描述内容
分布
0
无条纹
1
不连续条纹，占边界<20%
2
不连续条纹，占边界20%～50%
3
, 百拇医药 不连续条纹，占边界50%～90%
4
连续条纹，呈扇形
5
连续条纹，呈树枝状
6
连续条纹，纤细且平行
7
连续条纹，树枝状和纤细平行
宽度
0
无条纹
1
, 百拇医药
≤2 mm
2
3～5 mm
3
≥6 mm
质地
0
无条纹
1
粗糙
2
粗糙、纤细兼有
3
, 百拇医药 纤细
色素环宽度
1
≤6 mm
2
7～10 mm
3
≥11 mm
2.4 不同感染部位分离白色念珠菌的生物型别 为便于简化分析，本研究将生物学特征归为6类即无条纹、不连续条纹、连续条纹和3种不同宽度的色素环特征(≤6 mm，7～10 mm和≥11 mm)。为此，也把感染部位分为两类即深部感染和表面感染。通过统计分析，发现不连续条纹特征分布在深部感染和表面感染菌株之间比例差别有显著性，深部感染中不连续者条纹比例高于表面感染者(P<0.05)见表2。
, 百拇医药
3 讨 论
Brown-Thomsen于1968年建立了以白色念珠菌在麦芽琼脂上生长的菌落表面特征为基础的分型系统。Slutsky等认为菌落形态学存在表型变异，该变异主要影响菌落表面特征。因此，这种方法是建立于这些潜在不稳定的表面特征基础之上的。
表2 不同感染部位分离白色念珠菌生物学特征的分布
条纹特征
不同感染部位分离株数(N)
表面感染
深部感染
皮肤
阴道
粪便
, 百拇医药
口腔
鼻咽
痰
血液
尿液
脑脊液
条纹
无
20
16
4
4
8
50
, http://www.100md.com
0
0
0
不连续
20
8
48
0
8
163
22
16
5
连续
, http://www.100md.com
24
24
20
24
48
150
10
8
0
色素环宽度
<6 mm
12
20
4
, 百拇医药
4
8
62
1
0
0
7～10 mm
40
24
52
24
52
240
28
, http://www.100md.com
24
4
≥11 mm
12
4
16
0
4
61
3
0
1
Phongpaichit等[3]于1987年建立了以菌苔边缘的条纹特征为基础，参考其他菌落表面特征等6个方面的差别。采用6个数字组成的编码来表示型别的分型系统。为了便于临床应用，Hunter等[4]简化了该分型系统，改6个数字为4个数字的编码。然而该法需要孵育10 d之久，难以满足临床快速的需要。为此，本研究对该法进行改良建立了生物分型法。改进了培养基成分，增加了酵母浸膏粉、绵羊血和氯霉素，并采用微需氧培养，加速了条纹特征的形成，使孵育时间由原来的10 d缩短到5 d。而且白色念珠菌在该分型培养基上孵育2 d后即可出现特征性的红褐色色素环，不同分离株有不同宽度的色素环。借此可以分型，作为分型依据之一。尽管类星形念珠菌、有些热带念珠菌和近平滑念珠菌也能形成色素环，但是它们的环颜色淡的多，可以分开。伪热带念珠菌、克柔念珠菌和高里念珠菌等均不能形成色素环。这些结果提示红褐色色素环可用于鉴定白色念珠菌(另文报道)。实验中在培养基里加入羧基蛋白酶抑制剂抑胃肽时，该色素环消失，提示该色素环是白色念珠菌分泌的酸性蛋白酶作用于培养基中的血红蛋白引起的。
, 百拇医药
生物分型法以菌苔条纹和色素环特征为依据，用4个数字组成的编码来表示型别。与Hunter等报道的简化形态学分型法比较[4]，弃掉了变异主要影响的菌落表面特征，增加了本研究发现的色素环特征。应用该法，700株白色念珠菌被分为69型，以0002型为最常见，占20.6%，分辨指数为0.931。1年半后重新检测50株先前已鉴定过的白色念珠菌型别，结果完全相同的49株，重现率达98%。Hunter 和 Gaston[6]认为一个分型系统，如分型可靠且易辨别，分辨指数大于0.90者可看作理想方法。本法达到上述要求。
不管条纹形成与毒力之间的关系机制如何，形态学分型都可以提供一种有用的体外指示白色念珠菌毒力的方法[4]。通过分析研究数据，发现不连续条纹特征分布在深部感染表面感染菌株之间比例差别有显著性，深部感染中不连续条纹者比例大大高于表面感染者(P<0.05)，提示不连续条纹与白色念珠菌的毒力相关，支持上述观点。本研究的结果还显示32株血液的分离株中的22株有不连续条纹特征，它们都来源于白血病患者，且这些患者死于白色念珠菌引起的感染。而且BALB/c小鼠毒力试验也显示不连续条纹的菌株致病性强于连续条纹或无条纹者。因此，我们认为不连续条纹特征可以指示白色念珠菌毒力。它们的机制有待进一步探讨。
, 百拇医药
Monod等[7]认为形态学分型法可作为一种流行病学研究的工具。本研究的数据也支持这一观点。本研究有9株临床分离株来自3名严重肾病患者即每3株来自同一患者的尿、粪和痰标本。这3名患者同在某医院泌尿外科肾病区住院，入院时均未检出白色念珠菌，也无潜伏症状。施行同种异体肾脏移植术后，均发生排异反应，用抗生素和免疫抑制剂治疗，虽排异反应有所控制但随后粪、尿和痰标本均相继分离出白色念珠菌，共9株。应用本法分型，发现9株型别均为2132型，提示不同患者感染有一共同来源，属于医院感染。病区环境立即被严格消毒，隔离患者使之获得有效保护，感染得到了有效控制。
温旺荣(福建医科大学临床微生物学教研室， 福建 福州 350004)
王德春(南京军区福州总院， 福建 福州 350001)
朱忠勇(南京军区福州总院， 福建 福州 350001)
, http://www.100md.com
参考文献
1，Burnie JP, Odds FC, Lee W, et al. Outbreak of systemic Candida albicans in intensive unit caused by cross infection[J]. Br Med J, 1985, 290: 746.
2，范润玉, 吴瑶. 医院内深部真菌感染166例分析[J]. 中华医院感染学杂志,1996, 6(3): 138.
3，郑峰, 王军. 手术后深部白色念珠菌感染的临床分析[J], 中华医院感染学杂志, 1998, 8(1): 1.
4，Phongpaichit S, Mackenzie DWR, Fraser C. Strains differentiation of Candida albicans by morphotyping[J]. Epidemiol Infect, 1987, 99: 421.
, 百拇医药
5，Hunter PR, Fraser CA, Mackenzie DWR. Morphotype markers of virulence in human candidal infections[J]. J Med Microbiol, 1989, 28: 85.
6，Hunter PR, Gaston MA. Numerical index of the discrimination ability of typing systems: an application of Simpson′s index of diversity[J]. J Clin Microbiol, 1998, 26: 2465.
7，Monod M, Porchet S, Baudraz-Rosselet F, et al. The identification of pathogenic yeast strains by electrophoretic analysis of their chromosomes[J]. J Med Microbiol, 1990, 32: 123., http://www.100md.com
温旺荣 王德春 朱忠勇
摘 要： 目的 建立白色念珠菌的生物分型法，并探讨其型别与毒力的关系。方法 临床标本直接接种在生物形态分型培养基上，30℃烛缸或CO2培养箱孵育5 d，立即观察条状菌苔周围的条纹和色素环特征，并用4个数字组成的编码记录型别。这4个数字分别依次表示条纹分布、宽度、质地和色素环宽度。结果 该法把700株临床分离白色念珠菌分成69个型，以0002型(20.6%)为最常见，分辨指数为0.931；红褐色色素环可能是白色念珠菌所特有的，而且不连续条纹与白色念珠菌的毒力相关。结论 生物分型法具有简单、经济、重复性好和分辨率高等优点，可作为一种有用的流行病学调查的工具以预防和监测白色念珠菌感染，尤其医院感染，而且它的型别可以指示白色念珠菌毒力。
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关键词：白色念珠菌；生物分型法；感染
白色念珠菌是医院感染常见的病原菌，可引起医院感染的暴发流行[1～3]。而且已成为艾滋病、肿瘤、移植和吸毒等的免疫缺陷患者死亡原因之 一。因此，建立一种简单、经济、准确的白色念珠菌分型方法对研究白色念珠菌的致病性和预防、监测白色念珠菌感染的流行病学调查具有十分重要的意义。近年来，有关白色念珠菌分型的报道甚多，各种方法都有一定的应用范围和价值，其中1987年Phongpaichit等[4]报道了一种以菌落形态和条纹特征为基础的形态分型法，1989年Hunter等[5]加以简化且发现型别可能指示白色念珠菌毒力，具有简便、适用和分辨率高等优点。本研究参考该法并加以改进建立了生物分型法，并揭示型别与白色念珠菌毒力的关系。
1 材料与方法
1.1 试验菌株 700株临床分离白色念珠菌，是1990年10月～1996年1月在福建医科大学附属第一医院皮肤科和南京军区福州总院全军检验专科中心直接从疑似念珠菌感染患者的临床标本中分离鉴定获得的。其中痰363株，血液32株，脑脊液5株 ，尿液24株，粪便72株，阴道拭子48株，皮肤64株，口腔分泌物28株和鼻咽分泌物64株。它们的分离鉴定是按照孙氏简化法进行的。菌株以沙保弱琼脂斜面保存于4℃冰箱内。
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1.2 培养基 生物形态分型培养基和沙保弱琼脂斜面。前者改进了Phongpaichit等报道的麦芽浸出琼脂的成分，增加了酵母浸膏粉、氯霉素和绵羊血。其配方(g/L)是麦芽糖12.75、糊精2.75、甘油2.75、蛋白胨0.28、酵母浸膏粉0.5、氯霉素0.05、琼脂1.7和5%脱纤维绵羊血。除绵羊血外的成分均先溶于pH4.4醋酸盐缓冲液，15磅15 min高压灭菌，待冷至45～50℃时加入5%绵羊血，混匀，立即倾倒灭菌平板，以每块平板倒入18～20 ml培养基。平板可贮存在4℃冰箱内，最好7 d内用完。
1.3 方法
1.3.1 接种 已鉴定好的白色念珠菌转种沙保弱琼脂斜面。30 ℃孵育2 d，取菌落制成浓度为106～107 CFU/ml的1 ml蒸馏水菌悬液，用灭菌棉拭子取菌悬液涂一长条于生物形态分型培养基表面。要求轻轻地以单一划线来回涂于琼脂表面，不要涂破。
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1.3.2 孵育 划种好的培养基放烛缸或CO2培养箱(含5%～10% CO2)30℃孵育5 d。
1.3.3 观察并记录型别 孵育5 d后，可见不同分离株在菌苔周边的条纹和色素环特征不同。条纹是指菌苔边缘呈菌丝生长的绒毛状结构，有连续的，也有不连续的；有的呈扇形，有的呈树枝状，有的呈纤细平行，其宽度、粗细及占边界的比例也随菌株不同而异。色素环是指菌苔周边呈现的红褐色区带，其宽度随菌株不同而不同。色素环在孵育2 d后就可观察，随后时间里基本上不发生改变。根据条纹分布、宽度、质地和色素环宽度依次排列制定出4个数字组成的编码标准(表1)。按照编码标准记录菌株型别。
1.4 条件选择 取20株条纹和色素环兼有的白色念珠菌，改变试验条件如温度、气体环境和接种菌量，选出获得最佳结果的条件。
1.5 重现率测定 取临床分离株50株 ，用本法分型，重复检测3次。1年半后重测，按照编码标准记录型别，考察型别是否相同以评估重现率。
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1.6 统计 卡方检验用于统计分析。P<0.05表示深部感染与表面感染之间存在显著性差别。
2 结 果
2.1 培养条件 不同孵育温度(42℃，35℃，30℃，25℃，20℃和4℃)或气体环境(需氧、厌氧和微需氧)被考察。结果显示20℃，25℃，30℃之间无差别。需氧环境，条纹出现要孵育6 d，色素环要3 d；厌氧环境时间更长；微需氧培养条纹出现最多5 d，色素环2 d，且特征明显。菌量在106～108 CFU/ml范围内最适宜，且同株特征在该范围内变化不大。
2.2 重现率测定 50株临床白色念珠菌的型别，当时重复检测3次结果一致，1年半后重测，49株型别完全相同，即重现率达98%。
2.3 不同部位分离菌株的型别 700株临床分离白色念珠菌被分为69个型，最多见的型别是0002型(占20.6%)，分辨指数[6]为0.931。其中363株痰的分离株分为58个型，以0002型为最常见，32株血液的分离株可分为8型，以3222为最多见，24株尿液的分离株可分为4型，以2132为最多见；5株脑脊液的分离株可分为3型，以3322为最多见；72株粪便的分离株可分为14型，以2132为最多见；48株阴道拭子的分离株可分为8型，以5212为最多见；64株皮肤的分离株可分为12型，以0002为最多见；28株口腔分泌物的分离株可分为5型，以7232为最多见；64株鼻咽分泌物的分离株可分为11型，以0002为最多见。
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表1 分型培养基上生物学特征的编码标准
条纹特征
编 码
描述内容
分布
0
无条纹
1
不连续条纹，占边界<20%
2
不连续条纹，占边界20%～50%
3
, 百拇医药 不连续条纹，占边界50%～90%
4
连续条纹，呈扇形
5
连续条纹，呈树枝状
6
连续条纹，纤细且平行
7
连续条纹，树枝状和纤细平行
宽度
0
无条纹
1
, 百拇医药
≤2 mm
2
3～5 mm
3
≥6 mm
质地
0
无条纹
1
粗糙
2
粗糙、纤细兼有
3
, 百拇医药 纤细
色素环宽度
1
≤6 mm
2
7～10 mm
3
≥11 mm
2.4 不同感染部位分离白色念珠菌的生物型别 为便于简化分析，本研究将生物学特征归为6类即无条纹、不连续条纹、连续条纹和3种不同宽度的色素环特征(≤6 mm，7～10 mm和≥11 mm)。为此，也把感染部位分为两类即深部感染和表面感染。通过统计分析，发现不连续条纹特征分布在深部感染和表面感染菌株之间比例差别有显著性，深部感染中不连续者条纹比例高于表面感染者(P<0.05)见表2。
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3 讨 论
Brown-Thomsen于1968年建立了以白色念珠菌在麦芽琼脂上生长的菌落表面特征为基础的分型系统。Slutsky等认为菌落形态学存在表型变异，该变异主要影响菌落表面特征。因此，这种方法是建立于这些潜在不稳定的表面特征基础之上的。
表2 不同感染部位分离白色念珠菌生物学特征的分布
条纹特征
不同感染部位分离株数(N)
表面感染
深部感染
皮肤
阴道
粪便
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口腔
鼻咽
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血液
尿液
脑脊液
条纹
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不连续
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连续
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色素环宽度
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Phongpaichit等[3]于1987年建立了以菌苔边缘的条纹特征为基础，参考其他菌落表面特征等6个方面的差别。采用6个数字组成的编码来表示型别的分型系统。为了便于临床应用，Hunter等[4]简化了该分型系统，改6个数字为4个数字的编码。然而该法需要孵育10 d之久，难以满足临床快速的需要。为此，本研究对该法进行改良建立了生物分型法。改进了培养基成分，增加了酵母浸膏粉、绵羊血和氯霉素，并采用微需氧培养，加速了条纹特征的形成，使孵育时间由原来的10 d缩短到5 d。而且白色念珠菌在该分型培养基上孵育2 d后即可出现特征性的红褐色色素环，不同分离株有不同宽度的色素环。借此可以分型，作为分型依据之一。尽管类星形念珠菌、有些热带念珠菌和近平滑念珠菌也能形成色素环，但是它们的环颜色淡的多，可以分开。伪热带念珠菌、克柔念珠菌和高里念珠菌等均不能形成色素环。这些结果提示红褐色色素环可用于鉴定白色念珠菌(另文报道)。实验中在培养基里加入羧基蛋白酶抑制剂抑胃肽时，该色素环消失，提示该色素环是白色念珠菌分泌的酸性蛋白酶作用于培养基中的血红蛋白引起的。
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生物分型法以菌苔条纹和色素环特征为依据，用4个数字组成的编码来表示型别。与Hunter等报道的简化形态学分型法比较[4]，弃掉了变异主要影响的菌落表面特征，增加了本研究发现的色素环特征。应用该法，700株白色念珠菌被分为69型，以0002型为最常见，占20.6%，分辨指数为0.931。1年半后重新检测50株先前已鉴定过的白色念珠菌型别，结果完全相同的49株，重现率达98%。Hunter 和 Gaston[6]认为一个分型系统，如分型可靠且易辨别，分辨指数大于0.90者可看作理想方法。本法达到上述要求。
不管条纹形成与毒力之间的关系机制如何，形态学分型都可以提供一种有用的体外指示白色念珠菌毒力的方法[4]。通过分析研究数据，发现不连续条纹特征分布在深部感染表面感染菌株之间比例差别有显著性，深部感染中不连续条纹者比例大大高于表面感染者(P<0.05)，提示不连续条纹与白色念珠菌的毒力相关，支持上述观点。本研究的结果还显示32株血液的分离株中的22株有不连续条纹特征，它们都来源于白血病患者，且这些患者死于白色念珠菌引起的感染。而且BALB/c小鼠毒力试验也显示不连续条纹的菌株致病性强于连续条纹或无条纹者。因此，我们认为不连续条纹特征可以指示白色念珠菌毒力。它们的机制有待进一步探讨。
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Monod等[7]认为形态学分型法可作为一种流行病学研究的工具。本研究的数据也支持这一观点。本研究有9株临床分离株来自3名严重肾病患者即每3株来自同一患者的尿、粪和痰标本。这3名患者同在某医院泌尿外科肾病区住院，入院时均未检出白色念珠菌，也无潜伏症状。施行同种异体肾脏移植术后，均发生排异反应，用抗生素和免疫抑制剂治疗，虽排异反应有所控制但随后粪、尿和痰标本均相继分离出白色念珠菌，共9株。应用本法分型，发现9株型别均为2132型，提示不同患者感染有一共同来源，属于医院感染。病区环境立即被严格消毒，隔离患者使之获得有效保护，感染得到了有效控制。
温旺荣(福建医科大学临床微生物学教研室， 福建 福州 350004)
王德春(南京军区福州总院， 福建 福州 350001)
朱忠勇(南京军区福州总院， 福建 福州 350001)
, http://www.100md.com
参考文献
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