白色念珠菌肠内定植导致局部调节因子表达增加
白色念珠菌肠内定植导致局部调节因子表达增加
白晓东 刘贤华 肖光夏
摘 要： 目的 观察白色念珠菌肠腔内定植后局部调节因子表达变化。方法 采用无特殊病原菌小鼠定植白色念珠菌，分别于定植后3 d，7 d，14 d活杀，观察如下指标：盲肠内白色念珠菌总数；潘氏结(PP)中斑点杂交观测IL-4，IL-6表达变化；通过原位杂交反映固有层中(LP)IL-6表达变化；ELISA测定肠匀浆中IL-6水平。结果 白色念珠菌总数以定植3 d，7 d较高，14 d则明显下降；PP中IL-4表达以定植14 d最高；LP中IL-6阳性细胞数增加以定植7 d最高。结论 肠内白色念珠菌定植能引起局部IL-4，IL-6表达增加。
关键词：细胞因子；白色念株菌；粘膜免疫
, 百拇医药
局部粘膜免疫在肠粘膜局部屏障中起重要作用，其中slgA是屏障作用的主体成分之一。无菌动物肠腔内种植细菌后[1]，局部粘膜免疫作出明显反应，表现为潘氏结(Pyer′s patch，PP)增殖活跃，固有层浆细胞分化增加且局部特异性IgA抗体水平升高。PP是粘膜免疫诱导部位，在其内前体B细胞转型为表面IgA阳性B细胞，IL-4是最重要的调节因子；表面IgA阳性B细胞进入固有层后，在IL-6等因子作用下分化成熟[2]。在普通带菌个体肠腔内致病菌如痢疾杆菌定植后，局部免疫细胞的比例发生变化[3]。而带菌个体肠内定植条件致病菌后，能否引起局部免疫应答，目前尚无文献报道。白色念珠菌是较常见的条件致病真菌，大剂量抗生素使用后引起的二重感染是临床上较常见的并发症，治疗特感困难。肠腔是条件致病菌的主要来源之一，因此本文通过观察肠腔内白色念珠菌定植后IL-4，IL-6在粘膜局部的表达变化，探讨白色念珠菌与宿主相互之间作用的机制，为从粘膜免疫角度寻找预防措施提供思路。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 动物 SPF小鼠，第三军医大学动物中心提供，4周～5周，20±2 g，雌雄不限。设对照组及定植组。白色念珠菌定植及培养：白色念珠菌(cmcc44104，本所保存菌种)沙氏平板上增菌，生理盐水冲洗收集，调浓度至1.5×109 CFU/ml。定植组一次性经口给入白色念珠菌悬液0.5 ml/只，在本所实验动物中心隔离饲养。分别于给菌后3 d，7 d，14 d(PCD3，PCD7，PCD14)脱颈活杀，分别取盲肠及小肠。同时活杀对照组取材。盲肠经称重匀浆，涂于选择培养板上，72 h，37℃；计数白色念珠菌数；并换算出组织中的白色念珠菌数。
1.2 PP单细胞制备及RNA提取 取小肠PP，连续5次漂洗，经200目不锈钢网碾磨，制成单细胞悬液，总约107～108。采用Tripure isolation试剂盒提取总RNA。
, 百拇医药 1.3 特异性探针的制备 转入DH5 a菌，筛选后扩增质粒。质粒扩增、提取及探针回收按常规进行。采用随机引物法标记地戈辛。
1.4 IL-4及IL-6斑点杂交 以一定行列形式在尼龙膜上点印提取PP RNA。按常规步骤进行杂交。将碱性磷酸酶标记的抗地戈辛抗体与标记地戈辛的探针反应，最后加入NBT显色。采用图象系统测定阳性斑点OD值，以半定量形式反应阳性程度。
1.5 IE-6原位杂交 各时相动物活杀后，取肠段冲洗，卷肠后固定于4%多聚甲醛中，石蜡切片。按常规步骤进行杂交，NBT显色，核固红复染，于镜下计数每个肠绒毛中的阳性细胞数。每个时相共计数100个肠绒毛。设阴性对照(省去探针)。
1.6 肠组织IL-6 ELISA测定 取肠段，彻底冲洗肠腔后，称重后，1 ml PBS匀浆，5 000 r/min，4℃，10 min，收集上清。按步骤检测IL-6水平。按质量换算出每克肠组织中的IL-6水平。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 给菌后盲肠白色念珠菌数量的变化 对照组无白色念珠菌定植。在给菌后3d为(34.70±86.37)×106 CFU/(g.t)，给菌后7d为(3.91±6.93)×106 CFU/(g.t)，给菌后14d为(3.23±7.63)×106 CFU/(g.t)。给菌初期菌量较多，随着时间后延，菌量逐渐减少。
2.2 PP结IL-4斑点杂交表达变化 对照组为0.0322±0.0029。PCD3为0.0416±0.0011，稍有增多；PCD7为0.032±0.002；PCD14为0.1058±0.0076(P<0.01 vs 对照组)，明显高于正常组。
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2.3 PP中IL-6斑点杂交 正常对照组及定植组动物均无表达。
2.4 肠组织中IL-6含量变化 对照组为46.15±38.19 U/(g.t)定植后3 d(PCD3)为30.08±16.45；PCD7为15.07+11.30，稍低于对照组；PCD14为38.19±30.32 U/(g.t)。定植白色念珠菌后肠匀浆中IL-6含量变化不大。
2.5 肠固有层中IL-6原位杂交阳性细胞计数 阳性细胞主要分布于肠上皮层及肠固有层中。随机计数100个肠绒毛固有层中阳性细胞数，以反映IL-6阳性细胞的变化。对照组为1.27±0.71(个/绒毛)，PCD3为1.75±1.21(个/绒毛)，明显高于对照组(P<0.01)；PCD7为1.82±1.09(个/绒毛)，明显高于对照组(P<0.01)；PCD14为1.06±0.81(个/肠绒毛)，与正常无明显差别(P>0.05)。
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3 讨 论
局部免疫与肠内菌群相互作用的机制十分复杂。目前认为致病菌如霍乱菌、痢疾杆菌等进入肠腔后，可引起一系列的粘膜免疫变化，最终表现为特异性分泌抗体的水平增加。然而，某些抗原进入肠腔后并不引起分泌抗体水平增高，称之为“免疫耐受”。在严重创伤、及其他免疫力低下的宿主体内，以条件致病菌感染危害更严重。而肠腔内条件致病菌数量增加是否能引起局部抗体水平升高及相关因子的水平上调，目前尚无文献报道。本文利用SPF小鼠观察白色念珠菌肠内定植后，能导致局部PP中IL-4表达固有层中IL-6表达不同程度增加，但IL-4，IL-6的高峰时间不同。LP中IL-6阳性细胞调控可能以旁分泌为主，肠匀浆中IL-6包括血液及局部两部分，因此LP中阳性细胞数量增加并不明显导致肠匀浆中测定值上升。IL-4，IL-6局部表达增加，无疑可促进B细胞向IgA型浆细胞的成熟分化，对于提高局部抗体水平有积极作用。此外，通过观察发现IL-6主要由肠上皮细胞及肠固有层中淋巴细胞分泌，PP中淋巴细胞不表达IL-6，再次证明LP是局部免疫中B细胞的主要分化部位。
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白色念珠菌是常见的条件致病菌，肠腔内优势定植是其深部感染的前提之一[4，5]。结果表明，在肠粘膜表面优势定植可诱导局部粘膜免疫应答，调节B细胞增殖和分化的IL-4和IL-6局部表达上升。IL-4和IL-6有利于提高肠分泌抗体IgA的水平。随着IL-4和IL-6表达上升，肠内白色念珠菌总数逐渐减少。提示能否通过局部应用IL-4和IL-6来提高分泌型抗体水平以抑制肠内条件致病菌。
军队“九五”攻关项目“感染与免疫”资助
白晓东(第三军医大学西南医院烧伤研究所， 四川 重庆 400038)
肖光夏(第三军医大学西南医院烧伤研究所， 四川 重庆 400038)
刘贤华(第三军医大学预防系复合伤研究所， 四川 重庆 400038)
, 百拇医药 参考文献
1，Shroff KE, Meslin K, Cebra JJ. Commensal enteric bacteria engender a self-limiting humoral mucosal immune response while permanently colonizing the gut[J].Infect Immun, 1995, 63(10): 3904.
2，Lomm ME. Interaction of antigens and antibodies at mucosal surface[J]. Annu Rev Microbiol, 1997, 51: 311.
3，杨贵波, 彭虹, 高杰英. 口服痢疾杆菌免疫后小白鼠GALT中L3T4+和Lyt2+细胞亚群的研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 1997, 17(4): 247.
4，陈淑敏, 傅冠峰, 刘苏. 医院真菌感染34例调查分析[J]. 中华医院感染学杂志, 1997, 7(1): 21.
5，陈萍, 邓光贵. 肾移植术后真菌感染的危险因素分析[J]. 中华医院感染学杂志, 1998, 8(1): 4., 百拇医药
白晓东 刘贤华 肖光夏
摘 要： 目的 观察白色念珠菌肠腔内定植后局部调节因子表达变化。方法 采用无特殊病原菌小鼠定植白色念珠菌，分别于定植后3 d，7 d，14 d活杀，观察如下指标：盲肠内白色念珠菌总数；潘氏结(PP)中斑点杂交观测IL-4，IL-6表达变化；通过原位杂交反映固有层中(LP)IL-6表达变化；ELISA测定肠匀浆中IL-6水平。结果 白色念珠菌总数以定植3 d，7 d较高，14 d则明显下降；PP中IL-4表达以定植14 d最高；LP中IL-6阳性细胞数增加以定植7 d最高。结论 肠内白色念珠菌定植能引起局部IL-4，IL-6表达增加。
关键词：细胞因子；白色念株菌；粘膜免疫
, 百拇医药
局部粘膜免疫在肠粘膜局部屏障中起重要作用，其中slgA是屏障作用的主体成分之一。无菌动物肠腔内种植细菌后[1]，局部粘膜免疫作出明显反应，表现为潘氏结(Pyer′s patch，PP)增殖活跃，固有层浆细胞分化增加且局部特异性IgA抗体水平升高。PP是粘膜免疫诱导部位，在其内前体B细胞转型为表面IgA阳性B细胞，IL-4是最重要的调节因子；表面IgA阳性B细胞进入固有层后，在IL-6等因子作用下分化成熟[2]。在普通带菌个体肠腔内致病菌如痢疾杆菌定植后，局部免疫细胞的比例发生变化[3]。而带菌个体肠内定植条件致病菌后，能否引起局部免疫应答，目前尚无文献报道。白色念珠菌是较常见的条件致病真菌，大剂量抗生素使用后引起的二重感染是临床上较常见的并发症，治疗特感困难。肠腔是条件致病菌的主要来源之一，因此本文通过观察肠腔内白色念珠菌定植后IL-4，IL-6在粘膜局部的表达变化，探讨白色念珠菌与宿主相互之间作用的机制，为从粘膜免疫角度寻找预防措施提供思路。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 动物 SPF小鼠，第三军医大学动物中心提供，4周～5周，20±2 g，雌雄不限。设对照组及定植组。白色念珠菌定植及培养：白色念珠菌(cmcc44104，本所保存菌种)沙氏平板上增菌，生理盐水冲洗收集，调浓度至1.5×109 CFU/ml。定植组一次性经口给入白色念珠菌悬液0.5 ml/只，在本所实验动物中心隔离饲养。分别于给菌后3 d，7 d，14 d(PCD3，PCD7，PCD14)脱颈活杀，分别取盲肠及小肠。同时活杀对照组取材。盲肠经称重匀浆，涂于选择培养板上，72 h，37℃；计数白色念珠菌数；并换算出组织中的白色念珠菌数。
1.2 PP单细胞制备及RNA提取 取小肠PP，连续5次漂洗，经200目不锈钢网碾磨，制成单细胞悬液，总约107～108。采用Tripure isolation试剂盒提取总RNA。
, 百拇医药 1.3 特异性探针的制备 转入DH5 a菌，筛选后扩增质粒。质粒扩增、提取及探针回收按常规进行。采用随机引物法标记地戈辛。
1.4 IL-4及IL-6斑点杂交 以一定行列形式在尼龙膜上点印提取PP RNA。按常规步骤进行杂交。将碱性磷酸酶标记的抗地戈辛抗体与标记地戈辛的探针反应，最后加入NBT显色。采用图象系统测定阳性斑点OD值，以半定量形式反应阳性程度。
1.5 IE-6原位杂交 各时相动物活杀后，取肠段冲洗，卷肠后固定于4%多聚甲醛中，石蜡切片。按常规步骤进行杂交，NBT显色，核固红复染，于镜下计数每个肠绒毛中的阳性细胞数。每个时相共计数100个肠绒毛。设阴性对照(省去探针)。
1.6 肠组织IL-6 ELISA测定 取肠段，彻底冲洗肠腔后，称重后，1 ml PBS匀浆，5 000 r/min，4℃，10 min，收集上清。按步骤检测IL-6水平。按质量换算出每克肠组织中的IL-6水平。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 给菌后盲肠白色念珠菌数量的变化 对照组无白色念珠菌定植。在给菌后3d为(34.70±86.37)×106 CFU/(g.t)，给菌后7d为(3.91±6.93)×106 CFU/(g.t)，给菌后14d为(3.23±7.63)×106 CFU/(g.t)。给菌初期菌量较多，随着时间后延，菌量逐渐减少。
2.2 PP结IL-4斑点杂交表达变化 对照组为0.0322±0.0029。PCD3为0.0416±0.0011，稍有增多；PCD7为0.032±0.002；PCD14为0.1058±0.0076(P<0.01 vs 对照组)，明显高于正常组。
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2.3 PP中IL-6斑点杂交 正常对照组及定植组动物均无表达。
2.4 肠组织中IL-6含量变化 对照组为46.15±38.19 U/(g.t)定植后3 d(PCD3)为30.08±16.45；PCD7为15.07+11.30，稍低于对照组；PCD14为38.19±30.32 U/(g.t)。定植白色念珠菌后肠匀浆中IL-6含量变化不大。
2.5 肠固有层中IL-6原位杂交阳性细胞计数 阳性细胞主要分布于肠上皮层及肠固有层中。随机计数100个肠绒毛固有层中阳性细胞数，以反映IL-6阳性细胞的变化。对照组为1.27±0.71(个/绒毛)，PCD3为1.75±1.21(个/绒毛)，明显高于对照组(P<0.01)；PCD7为1.82±1.09(个/绒毛)，明显高于对照组(P<0.01)；PCD14为1.06±0.81(个/肠绒毛)，与正常无明显差别(P>0.05)。
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3 讨 论
局部免疫与肠内菌群相互作用的机制十分复杂。目前认为致病菌如霍乱菌、痢疾杆菌等进入肠腔后，可引起一系列的粘膜免疫变化，最终表现为特异性分泌抗体的水平增加。然而，某些抗原进入肠腔后并不引起分泌抗体水平增高，称之为“免疫耐受”。在严重创伤、及其他免疫力低下的宿主体内，以条件致病菌感染危害更严重。而肠腔内条件致病菌数量增加是否能引起局部抗体水平升高及相关因子的水平上调，目前尚无文献报道。本文利用SPF小鼠观察白色念珠菌肠内定植后，能导致局部PP中IL-4表达固有层中IL-6表达不同程度增加，但IL-4，IL-6的高峰时间不同。LP中IL-6阳性细胞调控可能以旁分泌为主，肠匀浆中IL-6包括血液及局部两部分，因此LP中阳性细胞数量增加并不明显导致肠匀浆中测定值上升。IL-4，IL-6局部表达增加，无疑可促进B细胞向IgA型浆细胞的成熟分化，对于提高局部抗体水平有积极作用。此外，通过观察发现IL-6主要由肠上皮细胞及肠固有层中淋巴细胞分泌，PP中淋巴细胞不表达IL-6，再次证明LP是局部免疫中B细胞的主要分化部位。
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白色念珠菌是常见的条件致病菌，肠腔内优势定植是其深部感染的前提之一[4，5]。结果表明，在肠粘膜表面优势定植可诱导局部粘膜免疫应答，调节B细胞增殖和分化的IL-4和IL-6局部表达上升。IL-4和IL-6有利于提高肠分泌抗体IgA的水平。随着IL-4和IL-6表达上升，肠内白色念珠菌总数逐渐减少。提示能否通过局部应用IL-4和IL-6来提高分泌型抗体水平以抑制肠内条件致病菌。
军队“九五”攻关项目“感染与免疫”资助
白晓东(第三军医大学西南医院烧伤研究所， 四川 重庆 400038)
肖光夏(第三军医大学西南医院烧伤研究所， 四川 重庆 400038)
刘贤华(第三军医大学预防系复合伤研究所， 四川 重庆 400038)
, 百拇医药 参考文献
1，Shroff KE, Meslin K, Cebra JJ. Commensal enteric bacteria engender a self-limiting humoral mucosal immune response while permanently colonizing the gut[J].Infect Immun, 1995, 63(10): 3904.
2，Lomm ME. Interaction of antigens and antibodies at mucosal surface[J]. Annu Rev Microbiol, 1997, 51: 311.
3，杨贵波, 彭虹, 高杰英. 口服痢疾杆菌免疫后小白鼠GALT中L3T4+和Lyt2+细胞亚群的研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 1997, 17(4): 247.
4，陈淑敏, 傅冠峰, 刘苏. 医院真菌感染34例调查分析[J]. 中华医院感染学杂志, 1997, 7(1): 21.
5，陈萍, 邓光贵. 肾移植术后真菌感染的危险因素分析[J]. 中华医院感染学杂志, 1998, 8(1): 4., 百拇医药