SW-480裸鼠移植瘤模型的建立及其生物学特性
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SW-480裸鼠移植瘤模型的建立及其生物学特性
张胜本 黄显凯 饶本强
摘 要 目的：建立生物学特性稳定的结肠高分化腺癌 裸小鼠移植瘤模型。方法：建立人结肠高分化腺癌 细胞株SW-480裸小鼠移植瘤模型，并确定移植瘤生长 情况、组织学变化及细胞动力学改变等生物学特性 。结果：移植瘤体内传代稳定，潜伏期7～8d；保留 了人结肠腺癌的组织学特征；细胞动力学检测显示 以四倍体细胞为主；移植瘤细胞具有分泌CEA的功能。 结论：本移植瘤模型是一个生物学特性较稳定的人 结肠高分化腺癌裸小鼠移植瘤模型。
关键词：结肠肿瘤；移植瘤；SW-480细胞
, 百拇医药
本实验建立人结肠高分化腺癌裸小鼠移植瘤模型， 并对移植瘤的生物学特性进行鉴定，旨在为大肠癌 肿瘤生物学特性的研究、抗肿瘤药物的筛选、导向 治疗及基因治疗等提供一个生物学特性较稳定的结 肠癌裸小鼠移植瘤模型。
1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞株
人结肠高分化腺癌细胞株SW-480由美国纪念斯隆- 凯特林癌症中心制备，重庆医科大学病理生理学教 研室提供。
1.2 动物和饲养环境
第三军医大学实验动物中心提供BALB/c-nu/nu无胸腺裸 小鼠，鼠龄5～7周，体重(20±2)g，雌雄不拘；饲养于净 化室内，饲料、饮水、笼具和操作器材及其它用品 均灭菌处理后使用，实验时按无菌原则操作。
, 百拇医药 1.3 移植瘤模型建立
初代移植瘤采用对数生长期SW-480细胞消化后，调 整细胞浓度至4×105/ml，取0.2ml接种于裸小鼠腹部或颈 背部皮下，共3只。初代肿瘤长至1cm×1cm×1cm时，选择 接种成功的1只裸小鼠拉颈椎处死，无菌剥离瘤体， 用含双抗的Hank's液洗2次，剪成1mm×1mm×1mm至2mm×2mm×2 mm大小瘤块，经套管针接种于裸小鼠上述部位进行传 代。如此传代6次，每次接种裸小鼠2～3只。每次将剩 余肿瘤组织按常规处理后冻存于液氮中。
1.4 移植瘤生物学特性鉴定
1.4.1 移植瘤生长曲线 第6、7代移植瘤自接种日起，每周测量1次肿瘤长径(b)，短径(a)，按公式V=1/2a2b计算肿 瘤体积，共观察6周，绘制生长曲线图。
1.4.2 组织学观察 取1、3、5代移植瘤组织，10%福尔马 林固定，石蜡包埋，常规切片作HE染色，光镜下观察 。
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1.4.3 超微结构观察 切取3～4块1mm×1mm×1mm大小的第5代 移植瘤组织，2.5%戊二醛和1%OsO4后固定，丙酮脱水 ，Epon-812包埋，超薄切片(500～700
)，铀-铅双染色， 在300X型透射电子显微镜(SEM)下观察。
1.4.4 细胞周期动力学检测[1] 单细胞悬液制备：获取 第6代肿瘤组织，Hank's液冲洗3次，清除血污、脂肪及 坏死组织，将肿瘤剪切成1mm×1mm×1mm碎块，Hank's液冲 洗2次，消化液(0.25%胰蛋白酶与0.05%胶原酶1∶1)37°C 恒温箱中消化20～30min。800r/min离心5～8min，Hank's液漂洗2～ 3min。加入RPMI1640培养液，300目钢筛网以除去未充分消 化的组织，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至1×105/ml， 4°C、70%乙醇固定。
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染色：选用碘化丙啶(PI)DNA染色法，取浓度为1×105/ml的 单细胞悬液，加入PBS液洗去固定液，加入PI一步染液1 ml，室温放置30min，上机分析。
流式细胞仪测定：仪器为FACSstarplus型号流式细胞仪 ，测定前调整仪器变异系数(CV)在3%以下。测定时以 70mV的氩离子激光器为激发光源，激发波长为488nm。测 定物质(DNA，蛋白质)的荧光强度后，HP900/340型计算机工 作站收集样本的10000个细胞数据进行分析和处理，然 后以频道数直方图和数字显示结果，并自动绘图。
采用Barlogie细胞同期分析法，将处于不同时期的细胞 分为3部分：G0/G1期、S期、G2/M期细胞。以正常组织对照 按公式计算DNA指数(DNAindex,DI)：
, 百拇医药
DI反映DNA的“倍性(Ploidy)”关系，正常组织细胞DI=1.0， 为二倍体；DI=0.5为单倍体，DI=2.0为四倍体。
1.4.5 CEA测定 第2、4、6代荷瘤裸小鼠处死时眼球放血，分离血清，用放射-免疫法(CEA-RIA法)测定血清CEA含量 并与正常小鼠血清对比；同时将移植瘤剥离称重后 充分剪碎，加入定量PBS液，反复冻融3次，离心取上 清测定肿瘤组织CEA含量。
1.5 统计学处理
数据以
±s表示，统计学处理采用本校数学教研室 编制的SPMR程序包，进行t检验。
2 结果
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2.1 移植瘤生长情况
初代移植瘤接种成功2只，第2代以后接种成功率10% ，至第6代以后肿瘤生长速度稳定。潜伏期7～8d，第2周 末长径可达0.5～0.6cm，第3周肿瘤生长加快，至第5周末 长径平均可达1.9～2.2cm，此时表面呈结节状，个别肿 瘤表面有破溃及出血。
2.2 移植瘤组织学变化
1、3、5代移植瘤形态相似。瘤细胞呈巢状分布有腺 腔样结构，瘤细胞大小不等，多为柱状，核分裂相 多见，可见癌细胞向细胞外分泌粘液，符合结肠高 分化腺癌的特点，见图1。
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图1 第5代移植瘤组织，瘤细胞呈巢状分布，有腺腔样结构，瘤细胞大小不等，多为柱状，核分裂相多见，可见瘤细胞向细胞外分泌粘液(HE×400)
Fig1 The fifth generation of xenografted tumor.The tumorous cells distributed like nest,with column shape,inconsistent size and glandular cavity structure,and secreted mucus.Nuclear fission was common (HE×400)
2.3 移植瘤超微结构变化
第5代移植瘤，细胞外形不规则，少数呈椭圆形及 梭形，细胞表面有许多胞浆突起及微绒毛，细胞核 不规则，核膜凹陷明显，核大而清晰，以常染色质 为主，近腔面有丰富的线粒体、粗面内质网、多聚 核糖体。部分癌细胞近腔面胞浆内见大量分泌泡， 泡内有较多的粘液物质，常见泡内内容物向腺腔分 泌。细胞之间可见紧密连接，见图2。
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图2 第5代移植瘤细胞，细胞核不规则，核大而清晰，以常染色质为主，近腔面有丰富的线粒体、粗面内质网和分泌泡，细胞之间可见紧密连接(SEM×5000)
Fig2 The fifth generation of xenografted tumor.The tumorous cells linked closely,with large clear and irregular nuclei,and abundant mitochodria,rough surfaced endoplasmic reticulum and secrete bubbles near cavosurface (SEM×5000)
2.4 移植瘤的细胞动力学改变
第6代移植瘤第6周末G0/G1、S、G2/M期细胞分别占66.9%、16.7%、16.4%。以四倍体细胞为主。
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2.5 移植瘤及裸小鼠血清CEA含量变化
CEA-RIA法测定正常裸小鼠及荷瘤裸小鼠血清及癌组 织内CEA含量见表1。正常裸小鼠血清CEA含量为2.2μg/L， 荷瘤裸小鼠血清CEA含量三代平均15.2μg/L，移植瘤组织 内含量三代平均10.7μg/L,3次测定结果，均有随代数增 加而升高趋势。
表1 荷瘤小鼠血清和移植瘤组织中CEA含量(ρBμg.L-1)
Tab1 CEA level in xenografted tumor and serum of nude mice(ρBμg.L-1)
Generation
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Serum
Tumor
2
10.2±0.32#
7.1±0.42#
4
16.3±0.46#
11.4±0.53#
5
19.1±1.22#
13.6±0.62#
Normal
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2.2±0.31
——
#:P<0.01 vs normal
3 讨论
人结肠腺癌裸小鼠移植瘤模型具有可连续传代、代间差异小及能长期保持原始肿瘤特征等优点，是目 前较为理想的人结肠腺癌异种移植模型。但人结肠 高分化腺癌是较难移植成功的恶性肿瘤之一。国内 目前仅有结肠中分化、低分化腺癌裸小鼠移植瘤模 型成功建立的报道[2]。本研究采用培养的人结肠高分化腺癌细胞株SW-480细胞皮下接种传代、接种实验成 功率高，第2代以后皆为100%，而且潜伏期短，肿瘤 生长速度稳定。为实验提供了实用、可行的移植瘤 动物模型。
能否保持肿瘤的原有特征是移植瘤模型成功的关键。Blum等[3]观察到人肺癌裸小鼠移植瘤在传代过程中生 物学特征不稳定，在移植过程中原有标志物丢失，或产生了新的标记物，所以寻找和建立生物学特性 稳定的裸小鼠移植瘤，对开展人类肿瘤的研究十分重要。本实验所建立的人结肠高分化腺癌裸小鼠移 植瘤除在组织学、超微结构、倍性分析上与结肠高 分化腺癌一致外，并且始终保持了产生CEA的功能。由此，可以认为是一个生物学特征较稳定的人结肠高 分化腺癌裸小鼠移植瘤模型。对于肿瘤生物学特性的研究，抗肿瘤药物的筛选，导向治疗、基因治疗的研究具有一定的意义。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270656)
作者简介：张胜本(1933.4)，男，四川省富顺县人，主任医师，教授，主要从事肛肠疾病方面的研究，发表论文56篇。电话：(023)68757298
作者单位：张胜本(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)
黄显凯(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)
饶本强(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)
参考文献
[1]张胜本，张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性 [M].成都：四川科学技术出版社，1995.91-95.
[2]郑杰.免疫缺陷型动物实验研究的现状和展望[J].上 海实验动物科学，1989，9(1)：87-89.
[3] Blum U. Immunohistochemical detection of tumor markers in lung carcinomas: change of markers after heterotransplantation of the carcinomas in thymus aplastic mice[J]. Int J Immunopharmacol, 1995,17(2):257-259., 百拇医药
张胜本 黄显凯 饶本强
摘 要 目的：建立生物学特性稳定的结肠高分化腺癌 裸小鼠移植瘤模型。方法：建立人结肠高分化腺癌 细胞株SW-480裸小鼠移植瘤模型，并确定移植瘤生长 情况、组织学变化及细胞动力学改变等生物学特性 。结果：移植瘤体内传代稳定，潜伏期7～8d；保留 了人结肠腺癌的组织学特征；细胞动力学检测显示 以四倍体细胞为主；移植瘤细胞具有分泌CEA的功能。 结论：本移植瘤模型是一个生物学特性较稳定的人 结肠高分化腺癌裸小鼠移植瘤模型。
关键词：结肠肿瘤；移植瘤；SW-480细胞
, 百拇医药
本实验建立人结肠高分化腺癌裸小鼠移植瘤模型， 并对移植瘤的生物学特性进行鉴定，旨在为大肠癌 肿瘤生物学特性的研究、抗肿瘤药物的筛选、导向 治疗及基因治疗等提供一个生物学特性较稳定的结 肠癌裸小鼠移植瘤模型。
1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞株
人结肠高分化腺癌细胞株SW-480由美国纪念斯隆- 凯特林癌症中心制备，重庆医科大学病理生理学教 研室提供。
1.2 动物和饲养环境
第三军医大学实验动物中心提供BALB/c-nu/nu无胸腺裸 小鼠，鼠龄5～7周，体重(20±2)g，雌雄不拘；饲养于净 化室内，饲料、饮水、笼具和操作器材及其它用品 均灭菌处理后使用，实验时按无菌原则操作。
, 百拇医药 1.3 移植瘤模型建立
初代移植瘤采用对数生长期SW-480细胞消化后，调 整细胞浓度至4×105/ml，取0.2ml接种于裸小鼠腹部或颈 背部皮下，共3只。初代肿瘤长至1cm×1cm×1cm时，选择 接种成功的1只裸小鼠拉颈椎处死，无菌剥离瘤体， 用含双抗的Hank's液洗2次，剪成1mm×1mm×1mm至2mm×2mm×2 mm大小瘤块，经套管针接种于裸小鼠上述部位进行传 代。如此传代6次，每次接种裸小鼠2～3只。每次将剩 余肿瘤组织按常规处理后冻存于液氮中。
1.4 移植瘤生物学特性鉴定
1.4.1 移植瘤生长曲线 第6、7代移植瘤自接种日起，每周测量1次肿瘤长径(b)，短径(a)，按公式V=1/2a2b计算肿 瘤体积，共观察6周，绘制生长曲线图。
1.4.2 组织学观察 取1、3、5代移植瘤组织，10%福尔马 林固定，石蜡包埋，常规切片作HE染色，光镜下观察 。
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1.4.3 超微结构观察 切取3～4块1mm×1mm×1mm大小的第5代 移植瘤组织，2.5%戊二醛和1%OsO4后固定，丙酮脱水 ，Epon-812包埋，超薄切片(500～700
)，铀-铅双染色， 在300X型透射电子显微镜(SEM)下观察。1.4.4 细胞周期动力学检测[1] 单细胞悬液制备：获取 第6代肿瘤组织，Hank's液冲洗3次，清除血污、脂肪及 坏死组织，将肿瘤剪切成1mm×1mm×1mm碎块，Hank's液冲 洗2次，消化液(0.25%胰蛋白酶与0.05%胶原酶1∶1)37°C 恒温箱中消化20～30min。800r/min离心5～8min，Hank's液漂洗2～ 3min。加入RPMI1640培养液，300目钢筛网以除去未充分消 化的组织，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至1×105/ml， 4°C、70%乙醇固定。
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染色：选用碘化丙啶(PI)DNA染色法，取浓度为1×105/ml的 单细胞悬液，加入PBS液洗去固定液，加入PI一步染液1 ml，室温放置30min，上机分析。
流式细胞仪测定：仪器为FACSstarplus型号流式细胞仪 ，测定前调整仪器变异系数(CV)在3%以下。测定时以 70mV的氩离子激光器为激发光源，激发波长为488nm。测 定物质(DNA，蛋白质)的荧光强度后，HP900/340型计算机工 作站收集样本的10000个细胞数据进行分析和处理，然 后以频道数直方图和数字显示结果，并自动绘图。
采用Barlogie细胞同期分析法，将处于不同时期的细胞 分为3部分：G0/G1期、S期、G2/M期细胞。以正常组织对照 按公式计算DNA指数(DNAindex,DI)：
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DI反映DNA的“倍性(Ploidy)”关系，正常组织细胞DI=1.0， 为二倍体；DI=0.5为单倍体，DI=2.0为四倍体。
1.4.5 CEA测定 第2、4、6代荷瘤裸小鼠处死时眼球放血，分离血清，用放射-免疫法(CEA-RIA法)测定血清CEA含量 并与正常小鼠血清对比；同时将移植瘤剥离称重后 充分剪碎，加入定量PBS液，反复冻融3次，离心取上 清测定肿瘤组织CEA含量。
1.5 统计学处理
数据以
±s表示，统计学处理采用本校数学教研室 编制的SPMR程序包，进行t检验。2 结果
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2.1 移植瘤生长情况
初代移植瘤接种成功2只，第2代以后接种成功率10% ，至第6代以后肿瘤生长速度稳定。潜伏期7～8d，第2周 末长径可达0.5～0.6cm，第3周肿瘤生长加快，至第5周末 长径平均可达1.9～2.2cm，此时表面呈结节状，个别肿 瘤表面有破溃及出血。
2.2 移植瘤组织学变化
1、3、5代移植瘤形态相似。瘤细胞呈巢状分布有腺 腔样结构，瘤细胞大小不等，多为柱状，核分裂相 多见，可见癌细胞向细胞外分泌粘液，符合结肠高 分化腺癌的特点，见图1。
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图1 第5代移植瘤组织，瘤细胞呈巢状分布，有腺腔样结构，瘤细胞大小不等，多为柱状，核分裂相多见，可见瘤细胞向细胞外分泌粘液(HE×400)
Fig1 The fifth generation of xenografted tumor.The tumorous cells distributed like nest,with column shape,inconsistent size and glandular cavity structure,and secreted mucus.Nuclear fission was common (HE×400)
2.3 移植瘤超微结构变化
第5代移植瘤，细胞外形不规则，少数呈椭圆形及 梭形，细胞表面有许多胞浆突起及微绒毛，细胞核 不规则，核膜凹陷明显，核大而清晰，以常染色质 为主，近腔面有丰富的线粒体、粗面内质网、多聚 核糖体。部分癌细胞近腔面胞浆内见大量分泌泡， 泡内有较多的粘液物质，常见泡内内容物向腺腔分 泌。细胞之间可见紧密连接，见图2。
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图2 第5代移植瘤细胞，细胞核不规则，核大而清晰，以常染色质为主，近腔面有丰富的线粒体、粗面内质网和分泌泡，细胞之间可见紧密连接(SEM×5000)
Fig2 The fifth generation of xenografted tumor.The tumorous cells linked closely,with large clear and irregular nuclei,and abundant mitochodria,rough surfaced endoplasmic reticulum and secrete bubbles near cavosurface (SEM×5000)
2.4 移植瘤的细胞动力学改变
第6代移植瘤第6周末G0/G1、S、G2/M期细胞分别占66.9%、16.7%、16.4%。以四倍体细胞为主。
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2.5 移植瘤及裸小鼠血清CEA含量变化
CEA-RIA法测定正常裸小鼠及荷瘤裸小鼠血清及癌组 织内CEA含量见表1。正常裸小鼠血清CEA含量为2.2μg/L， 荷瘤裸小鼠血清CEA含量三代平均15.2μg/L，移植瘤组织 内含量三代平均10.7μg/L,3次测定结果，均有随代数增 加而升高趋势。
表1 荷瘤小鼠血清和移植瘤组织中CEA含量(ρBμg.L-1)
Tab1 CEA level in xenografted tumor and serum of nude mice(ρBμg.L-1)
Generation
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Serum
Tumor
2
10.2±0.32#
7.1±0.42#
4
16.3±0.46#
11.4±0.53#
5
19.1±1.22#
13.6±0.62#
Normal
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2.2±0.31
——
#:P<0.01 vs normal
3 讨论
人结肠腺癌裸小鼠移植瘤模型具有可连续传代、代间差异小及能长期保持原始肿瘤特征等优点，是目 前较为理想的人结肠腺癌异种移植模型。但人结肠 高分化腺癌是较难移植成功的恶性肿瘤之一。国内 目前仅有结肠中分化、低分化腺癌裸小鼠移植瘤模 型成功建立的报道[2]。本研究采用培养的人结肠高分化腺癌细胞株SW-480细胞皮下接种传代、接种实验成 功率高，第2代以后皆为100%，而且潜伏期短，肿瘤 生长速度稳定。为实验提供了实用、可行的移植瘤 动物模型。
能否保持肿瘤的原有特征是移植瘤模型成功的关键。Blum等[3]观察到人肺癌裸小鼠移植瘤在传代过程中生 物学特征不稳定，在移植过程中原有标志物丢失，或产生了新的标记物，所以寻找和建立生物学特性 稳定的裸小鼠移植瘤，对开展人类肿瘤的研究十分重要。本实验所建立的人结肠高分化腺癌裸小鼠移 植瘤除在组织学、超微结构、倍性分析上与结肠高 分化腺癌一致外，并且始终保持了产生CEA的功能。由此，可以认为是一个生物学特征较稳定的人结肠高 分化腺癌裸小鼠移植瘤模型。对于肿瘤生物学特性的研究，抗肿瘤药物的筛选，导向治疗、基因治疗的研究具有一定的意义。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270656)
作者简介：张胜本(1933.4)，男，四川省富顺县人，主任医师，教授，主要从事肛肠疾病方面的研究，发表论文56篇。电话：(023)68757298
作者单位：张胜本(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)
黄显凯(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)
饶本强(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)
参考文献
[1]张胜本，张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性 [M].成都：四川科学技术出版社，1995.91-95.
[2]郑杰.免疫缺陷型动物实验研究的现状和展望[J].上 海实验动物科学，1989，9(1)：87-89.
[3] Blum U. Immunohistochemical detection of tumor markers in lung carcinomas: change of markers after heterotransplantation of the carcinomas in thymus aplastic mice[J]. Int J Immunopharmacol, 1995,17(2):257-259., 百拇医药