催化信号放大系统的制备及其在免疫组化和原位杂交中的应用
催化信号放大系统的制备及其在免疫组化和原位杂交中的应用
倪灿荣 郑建明 朱明华 马大烈 戴益民
摘 要 目的：应用本实验室制备的催化信号放大(catalyzed signal amplification,CSA)试剂，提高免疫组化(IHC)和原位杂交(ISH)的敏感性。方法：CSA法应用于IHC检测50例10种不同类型的肿瘤切片中40种不同的抗原和ISH检测6种不同的RNA成分，并与相应的常规方法进行敏感性比较。同时分析了存在的问题。结果：CSA-IHC法较传统的PAP法、ABC法和LSAB法敏感500～1 000倍，较EnVision法敏感20～100倍。CSA-ISH法可使探针浓度从3 μg/ml降到0.5～1μg/ml，杂交时间从2 d缩短到1 d，杂交阳性率明显提高。结论：本实验室制备的CSA系统与常规方法相比具有较高的敏感性、稳定性和低背景等优点，完全可取代进口试剂，非常适合于一抗昂贵、抗原性弱的IHC检测，还可作为常规ISH染色方法。
, 百拇医药
关键词：催化信号放大；免疫组组织化学；原位杂交
催化信号放大(CSA)法首次由Bobrow等[1]应用于免疫酶联等的检测，Adams等[2]和Kerstens等[3]将该方法分别应用于免疫组化(IHC)和原位杂交(ISH)。该系统的核心试剂是酪胺盐(tyramide)交联上一种标记物，例如生物素、地高辛、荧光素、重金属离子等。其主要原理是辣根过氧化物酶(HRP)在H2O2存在下催化酪胺盐，形成共价键结合位点，在15 min内大量的标记物沉积在要放大的信号位点上，使原始信号得到几何级数的放大。本文主要介绍酪胺盐与生物素的交联，CSA系统应用于IHC和ISH的检测，并与Dako公司的CSA系统进行比较，对存在的问题也作了详细的论述。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 主要试剂 生物素-N-羟基丁二酸亚胺酯、酪胺盐、二甲基甲酰胺(DMF)、三乙醇胺(TEA)均购自美国Sigma公司；Gene Point盒，LSAB盒，EnVision试剂(兔和鼠)均购自丹麦Dako公司；Dig-RNA标记盒，Bio-11-dUTP,dNTPs,Taq聚合酶，PCR扩增盒生物素标记小鼠抗Dig抗体均购自德国宝灵曼公司；DEPC购自上海华美公司进口分装产品；第一抗体的来源，稀释度及处理方式见表1。
表 1 3种IHC方法第一抗体的稀释度、来源及处理方式
Tab 1 The optimal dilutions of primary antibodies,source and process way of 3 methods
Primary
antibodies
, 百拇医药
Process way
Dilution
Source
LSAB
EnVision
CSA
nm23(M)
MWI 80℃ 5 min
1∶50
1∶150
1∶150
Fuzhou Maxim Brotech
, 百拇医药
c-myc(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶200
1∶10 000
Fuzhou Maxim Brotech
fas(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶70
1∶200
1∶10 000
Fuzhou Maxim Brotech
, 百拇医药
Fas-L(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶80
1∶200
1∶10 000
Fuzhou Maxim Brotech
C-jun(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶150
1∶20 000
Fuzhou Maxim Brotech
, 百拇医药
C-erB-2(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶300
1∶12 000
Fuzhou Maxim Brotech
Bcl-2(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶200
1∶10 000
Immunotech
, 百拇医药
CD56(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶150
1∶5 000
Immunotech
Bax(M)
MWI 98℃ 10 min
Ready for use
1∶5
1∶2 000
Immunotech
, 百拇医药
Rb(M)
MWI 98℃ 10 min
Ready for use
1∶10
1∶30 000
Immunotech
p53(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶100
1∶8 000
Dako
, 百拇医药
ER(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶30
1∶150
1∶3 000
Dako
Ki-67(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶30
1∶80
1∶8 000
Dako
, http://www.100md.com
PR(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶40
1∶200
1∶3 200
Dako
p-gp(C219)(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶30
1∶80
1∶10 000
Dako
, 百拇医药
PcNA(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶300
1∶600
1∶20 000
Dako
GFAP(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶200
1∶800
1∶30 000
Dako
, 百拇医药
EGF(R)
Digestion
1∶100
1∶400
1∶10 000
Dako
EGFr(M)
Digestion
1∶50
1∶200
1∶8 000
Dako
, 百拇医药
TGFβ(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶150
1∶10 000
Dako
TGFα(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶200
1∶10 000
Dako
, http://www.100md.com
CD45RO(M)
NO
1∶50
1∶200
1∶5 000
Dako
Laminin(R)
Digestion
1∶1 000
1∶5 000
1∶200 000
Sigmal USA
, 百拇医药
Collagen Type IV(M)
Digestion
1∶200
1∶600
1∶80 000
Sigmal USA
Fibronectin(M)
Digestion
1∶300
1∶900
1∶80 000
Sigmal USA
, 百拇医药
ICAM-1(M)
Digestion
1∶30
1∶100
1∶10 000
Sigmal USA
Cateninα(R)
Digestion
1∶2 000
1∶5 000
1∶100 000
Sigmal USA
, http://www.100md.com
Cateninβ(R)
Digestion
1∶1 000
1∶4 000
1∶100 000
Sigmal USA
E-Cadherin(M)
Digestion
1∶100
1∶500
1∶50 000
Sigmal USA
, 百拇医药
PDGF(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶200
1∶10 000
Santa Cruz USA
NOS1(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶300
1∶10 000
Santa Cruz USA
, 百拇医药
NOS2(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶300
1∶10 000
Santa Cruz USA
NOS3(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶300
1∶10 000
Santa Cruz USA
, http://www.100md.com
VGEF(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶200
1∶8 000
Santa Cruz USA
p16(R)
Digestion
1∶80
1∶250
1∶10 000
Santa Cruz USA
, 百拇医药
CD44s(M)
NO
1∶80
1∶400
1∶50 000
Gift
CD44v4(M)
NO
1∶80
1∶400
1∶50 000
Gift
CD44v6(M)
, 百拇医药
NO
1∶80
1∶400
1∶50 000
Gift
CD44v9(M)
NO
1∶80
1∶400
1∶50 000
Gift
CD44(R)
NO
, http://www.100md.com
1∶500
1∶500
1∶100 000
Sigmal USA
MWI:Microwave irradiation;M:Mouse;R:Rabbit1.2 组织标本 ISH用组织标本为肝细胞癌及癌周肝、胃癌、肺癌、食食癌和喉癌各5例，IHC所用组织标本为肺癌、肝细胞癌、食食癌、胃癌、结肠癌、脑胶质瘤、恶性淋巴瘤、膀胱癌、喉癌、乳腺癌各5例，均来自长海和东方肝胆外科医院，为手术切除标本，取其1/2标本在30 min内入液氮内速冻并保存在-80℃冰箱中，临用前冰冻切片。另1/2标本浸入4%多聚甲醛中固定18 h，系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 μm石蜡切片，贴在经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理，180℃烤4 h，并涂有多聚赖氨酸的载玻片上，60℃烤24 h。
, 百拇医药
1.3 探针标记 nm23，p16，HPV(人乳头状瘤病毒) cRNA探针的制备按体外转录试剂盒说明书操作，Sp6 RNA聚合酶指导反义RNA合成Dig-cRNA探针，片段长分别为971，872，1 320 bp，生物素标记Bcl-2 cRNA探针购自武汉博士德公司；HBV和多药耐药(MDR)探针用PCR法标记，按PCR探针标记盒说明书操作。
1.4 酪胺盐-生物素复合物的制备 A液：临用前将10 mg生物素-N-羟基丁二酸亚胺酯溶在1 ml DMF中(10 mg/ml)；B液：10 mg酪胺盐溶在1 ml DMF中(10 mg/ml，相当于58 μmol/L)，加入10 μl TEA(7.5 mol/L 10 μl),相当于72.5 μmol/L，为酪胺盐的1.25倍；C液：在A液中加入B液(A液与B液的摩尔比为1∶1.1)使其充分酰化2 h(暗处)。合成好酪胺盐-生物素复合物用乙醇稀释到1 mg/ml，在4℃至少可保存8个月，其稳定性不受影响。
, http://www.100md.com 1.5 IHC-LSAB，EnVisionn,CSA法 参阅相关文献[3～5] 操作。
1.6 ISH方法 杂交前后洗脱所用试剂均用0.1%DEPC处理水配制。(1)杂交前处理参阅文献[6] 。(2)杂交 探针浓度500 ng/ml～2 μg/ml，每片15 μl杂交液，cRNA探针盖上防蒸发的专用膜，48℃杂交12 h，cDNA探针盖经硅化盖玻片，95℃双变性15 min，42℃杂交4 h。(3)杂交后洗脱参阅文献[6]。(4)信号放大检测： Dig标记探针接生物素化抗Dig抗体1∶200，37℃ 30 min，生物素标记探针直接用抗生蛋白链菌素-HRP 1∶500，37℃ 20 min，生物素化酪胺分子(内含0.015% H2O2)1∶500,37℃ 15 min，PBS洗3×5 min，抗生蛋白链菌素-HRP 1∶1 000， 37℃ 30 min,PBS洗3×5 min(如有必要可进一步循环放大)。0.05% DAB+0.03% H2O2显色8～15 min，水洗，苏木精衬染，微波蓝化，常规封片。
, 百拇医药
1.7 结果判断标准 参阅文献[7]。
1.8 统计学处理 按χ2分析和参照单位分析(Ridit分析)，95%可信限不重叠为相差显著。
1.9 对照设计 ISH阳性对照均与Gene Point 试剂盒内配置阳性片为标准。经RNase消化1 h后，作杂交为阴性对照。杂交液中不加探针，结果为阴性。IHC阴性对照用PBS代替特异性一抗。
2 结 果
2.1 IHC检测结果 应用40种不同类型的第一抗体，50例10种器官肿瘤标本的石蜡包埋连续切片，分别用IHC CSA，EnVision和LSAB同时染色比较，结果从表1中可以看出，CSA法最为敏感，其次是EnVision法。CSA法较LSAB法敏感500～1 000倍，较EnVision法敏感20～100倍；EnVision法较LSAB法敏感3～6倍。背景染色3种方法基本一致，因CSA法中第一抗体高度稀释，背景染色要好于LSAB法，而EnVision法中，组织内无内源性葡聚糖多聚物存在，因此EnVision法略好于CSA和LSAB法。孵育染色时间EnVision法最短为165 min，其次是LSAB法，CSA法孵育时间最长。3种方法检测结果发现，利用3种方法的第一抗体最佳稀释后，其阳性率和阳性强度基本一致。但在肝癌、胶质瘤和喉癌中ki-67，P-gp,Bcl-2的阳性率，CSA法要高于LSAB和EnVision法10%；在乳腺癌中ER，PR的检测阳性细胞数，CSA法要高于LSAB和EnVision法5%。2例胃癌标本固定4 d，常规石蜡切片，分别检测ki-67,Rb,P-gp,PDGF,Bax,CD44,nm23,Bcl-2等抗原，结果LSAB和EnVision法均呈阴性，而用CSA法2个循环后，除ki-67，P-gp外均检测到阳性结果(图1A，B，见封四)。
, http://www.100md.com
2.2 ISH检测结果 应用CSA-ISH法分别检测5种不同类型的肿瘤，6种基因和病毒探针，同时应用冰冻和石蜡切片，常规ISH法(DIG-AKP，抗生蛋白链菌素-HRP)进行敏感性、阳性率的比较。5种肿瘤的总体阳性率冰冻切片为：nm23 mRNA 60%(15/25)；p16 mRNA 64%(16/25);Bcl-2 mRNA 52%(13/25);MDR mRNA 40%(10/25)；HPV mRNA在喉癌中为60%(3/5)；HBV在肝癌中60%(3/5)。石蜡切片：nm23 mRNA 20%(5/25)；p16 mRNA 24%(6/25)；Bcl-2 mRNA 20%(5/25)；MDR mRNA 16%(4/25)；HBV DNA 60%(3/5)；HPV mRNA 40%(2/5)。CSA-ISH法冰冻切片中上述6种探针的阳性率基本一致，仅 MDR mRNA可达52%(13/25)。但石蜡切片为：nm23 mRNA 56%(14/25)；p16 mRNA 60%(15/25)；Bcl-2 mRNA 56%(14/25);MDR mRNA 44%(11/25);HPV mRNA 60%(3/5);HBV DNA 60%(3/5)。常规ISH法探针浓度需2～4 μg/ml，而CSA-ISH法探针浓度仅需0.5～1 μg/ml即可获得理想的结果。杂交时间常规ISH法需24～48 h，CSA-ISH法RNA杂交需12 h，DNA杂交仅4 h。背景染色因探针浓度的降低和杂交时间的缩短而获得较大改善(图1C，D，见封四)。常规ISH和CSA-ISH方法阳性率相比较，在石蜡切片上nm23 cRNA的阳性检测率提高36%，二者相差显著(P<0.01)，p16 mRNA MDR cRNA和Bcl-2 cRNA二者相比也相差显著(P<0.05)。
, 百拇医药
2.3 自制CSA系统与Dako公司CSA系统的比
较 随机取5例标本，用相同的一抗和探针进行IHC和ISH检测放大比较，实验结果表明，本实验室制备的CSA系统与Dako公司CSA系统的敏感性、稳定性和背景染色基本一致。
图1 CSA系统应用于IHC和ISH的检测
, 百拇医药
Fig 1 Application of CSA on the determining IHC and ISH
A: CD44v6 expression in poor differentiated cell of astrocytoma (×400)；
B: P53 protein expression in breast cancer (×400);
C: MDR mRNA expression in esophageal carcinoma (×150);
D: nm23 mRNA expression in gastric carcinoma (×120)
3 讨 论
, http://www.100md.com 3.1 提高IHC和ISH检测的敏感性 CSA方法能大大提高IHC和ISH的敏感性。CSA的核心试剂是酪胺盐标记酶或荧光素或金属离子或DIG或生物素等复合物。本研究根据相关文献资料进行改进[8～11]，合成的酪胺盐生物素复合物的稳定性、敏感性与Dako公司CSA盒一致，但成本大大下降。
3.2 CSA在IHC中的应用 CSA法是一种全新IHC方法，敏感性可以和IGSS法媲美，但克服了IGSS法的高背景，操作也较IGSS简便，值得推广。近来推出的EnVision法有较高的敏感性，但CSA法比EnVision法还有敏感20～100倍，不过CSA法步骤流程多，孵育时间长，内源性生物素的干扰等原因，背景染色不如EnVision法。作者认为EnVision法非常适合于IHC的鉴别诊断，而CSA较适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性较弱的IHC检测。在使用CSA法过程中，生物素化酪胺分子的浓度不能太高，一般0.009～0.007 μmol/L，如高于0.01 μmol/常出现核内的高背景染色，同时酪胺分子是HRP在H2O2存在下进行催化反应，因此时间一般15 min即可。由于该方法仅开展了几十种抗体、部分肿瘤标本的检测，可能存在某些潜在的问题，只有通过大量的使用才能对该方法作一全面的评价。Sabattini等[12]报道IHC EnVision法检测53种抗体(均为CD系列)对各类淋巴瘤的检测结果，并与PAP法、ABC法、SABC法、LSAB法和CSA法进行比较，认为EnVision法较其他方法敏感5～6倍，与CSA法基本一致，而本研究所获得结果与该研究结果不一致，有待进一步探讨。另外，Sabattini还发现有5例标本因固定1周，时间太长，其他方法均为阴性结果，仅CSA法阳性表达，与本文2例胃癌固定10 d，其他方法均阴性，仅CSA法阳性表达的结果相符，认为CSA可作为抗原破坏严重，抗原量较少的组织细胞抗原的检测。
, 百拇医药
3.3 CSA在ISH中的应用 本研究利用CSA-ISH法分别在冰冻和石蜡切片上同时检测nm23,MDR,p16,Bcl-2,HPV mRNA和HBV DNA，结果发现，阳性检测率较传统方法有了显著的提高(P<0.01)，探针浓度可从微克水平下降到纳克水平，杂交时间从18 h缩短到4 h，1 d可完成杂交的检测和显示。可用于甲醛固定的石蜡切片，但常规的甲醛固定标本，因在固定、脱水包埋等处理过程中受RNA酶污染，mRNA降解严重，杂交信号仍然不够理想。因此，建议要想开展ISH诊断病理的单位，组织应尽量避免RNA酶的污染，在切片、贴片及烤片过程中应特别小心，例如可采用DEPC水展片，切片刀用一次性刀片，脱蜡用的二甲苯和乙醇必须是新鲜的。在应用CSA-ISH法时，第1次的抗生蛋白链菌素-HRP复合物应比常规浓度低，一般1∶500稀释，第2次可1∶1 000～1∶5 000稀释。生物素化酪胺盐0.007 μmol/L为最佳。
参考文献
, 百拇医药
[1]Bobrow MN,Harris TD,Shaughnessy KJ,et al.Catalyzed reporter deposition,a novel method of signal amplification.Application to immunoassys[J].J Immunol Methods,1989，125(1-2)：279-285.
[2]Adams JC.Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains[J].J Histochem Cytochem,1992，40(10)：1457-1463.
[3]Kerstens HMJ,Poddighe PJ,Hanselaar AGJM.A novel in situ hybridization signal amplification method based on the deposition of biotinylated tyramine[J].J Histochem Cytochem,1995，43(4)：347-352.
, 百拇医药
[4]Van der Loos CM,Naruko T,Becker AE.The use of enhanced polymer one-step staining reagents for immunoenzyme double-labelling[J].Histochem J,1996，28(10)：709-714.
[5]Chilosi M,Lestani M,Pedron S,et al.A rapid immunostaining method for frozen sections[J].Biotech Histochem,1994，69(4)：235-239.
[6]倪灿荣主编.免疫组织化学实验新技术及应用[M].北京：北京科学技术出版社，1993.268-276.
[7]王 江，倪灿荣.P53、rasp21、c-erbB-2癌基因蛋白在胃癌中的表达及分布特征[J].第二军医大学学报,1994，15(1)：20-24.
, 百拇医药
[8]Schmidt BF,Chao J,Zhu Z,et al.Signal amplification in the detection of single-copy DNA and RNA by enzyme-catalyzed deposition(CARD)of the novel fluorescent reporter substrate cy3.29-tyramide[J].J Histochem Cytochem,1997，45(3)：365-373.
[9]Hunyady B,Krempels K,Harta G,et al.Immunohistochemical signal amplification by catalyzed reporter deposition and its application in double immunostaining[J].J Histochem Cytochem,1996，44(12)：1353-1362.
, 百拇医药
[10] McNicol AM,Richmond JA.Optimizing immunohistochemistry：antigen retrieval and signal amplification[J].Histopathology,1998,32 (2)：97-103.
[11] Hopman AHN,Ramaekers FCS,Speel EJM.Rapid synthesis of biotin,digoxigenin-,trinitrophenyl-,and fluorochrome-labeled tyramides and their application for in situ hybridization using CARD amplification[J].J Histochem Cytochem,1998，46(6)：771-777.
[12] Sabattini E,Bisgaard K,Ascani S,et al.The EnVision TM+system：a new immunohistochemical method for diagnostics and research.Critical comparison with the APAAP,Chem MateTM,CSA,LSBC,and SABC techniques[J].J Clin Pathol,1998,51(7)：506-511., 百拇医药
倪灿荣 郑建明 朱明华 马大烈 戴益民
摘 要 目的：应用本实验室制备的催化信号放大(catalyzed signal amplification,CSA)试剂，提高免疫组化(IHC)和原位杂交(ISH)的敏感性。方法：CSA法应用于IHC检测50例10种不同类型的肿瘤切片中40种不同的抗原和ISH检测6种不同的RNA成分，并与相应的常规方法进行敏感性比较。同时分析了存在的问题。结果：CSA-IHC法较传统的PAP法、ABC法和LSAB法敏感500～1 000倍，较EnVision法敏感20～100倍。CSA-ISH法可使探针浓度从3 μg/ml降到0.5～1μg/ml，杂交时间从2 d缩短到1 d，杂交阳性率明显提高。结论：本实验室制备的CSA系统与常规方法相比具有较高的敏感性、稳定性和低背景等优点，完全可取代进口试剂，非常适合于一抗昂贵、抗原性弱的IHC检测，还可作为常规ISH染色方法。
, 百拇医药
关键词：催化信号放大；免疫组组织化学；原位杂交
催化信号放大(CSA)法首次由Bobrow等[1]应用于免疫酶联等的检测，Adams等[2]和Kerstens等[3]将该方法分别应用于免疫组化(IHC)和原位杂交(ISH)。该系统的核心试剂是酪胺盐(tyramide)交联上一种标记物，例如生物素、地高辛、荧光素、重金属离子等。其主要原理是辣根过氧化物酶(HRP)在H2O2存在下催化酪胺盐，形成共价键结合位点，在15 min内大量的标记物沉积在要放大的信号位点上，使原始信号得到几何级数的放大。本文主要介绍酪胺盐与生物素的交联，CSA系统应用于IHC和ISH的检测，并与Dako公司的CSA系统进行比较，对存在的问题也作了详细的论述。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 主要试剂 生物素-N-羟基丁二酸亚胺酯、酪胺盐、二甲基甲酰胺(DMF)、三乙醇胺(TEA)均购自美国Sigma公司；Gene Point盒，LSAB盒，EnVision试剂(兔和鼠)均购自丹麦Dako公司；Dig-RNA标记盒，Bio-11-dUTP,dNTPs,Taq聚合酶，PCR扩增盒生物素标记小鼠抗Dig抗体均购自德国宝灵曼公司；DEPC购自上海华美公司进口分装产品；第一抗体的来源，稀释度及处理方式见表1。
表 1 3种IHC方法第一抗体的稀释度、来源及处理方式
Tab 1 The optimal dilutions of primary antibodies,source and process way of 3 methods
Primary
antibodies
, 百拇医药
Process way
Dilution
Source
LSAB
EnVision
CSA
nm23(M)
MWI 80℃ 5 min
1∶50
1∶150
1∶150
Fuzhou Maxim Brotech
, 百拇医药
c-myc(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶200
1∶10 000
Fuzhou Maxim Brotech
fas(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶70
1∶200
1∶10 000
Fuzhou Maxim Brotech
, 百拇医药
Fas-L(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶80
1∶200
1∶10 000
Fuzhou Maxim Brotech
C-jun(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶150
1∶20 000
Fuzhou Maxim Brotech
, 百拇医药
C-erB-2(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶300
1∶12 000
Fuzhou Maxim Brotech
Bcl-2(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶200
1∶10 000
Immunotech
, 百拇医药
CD56(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶150
1∶5 000
Immunotech
Bax(M)
MWI 98℃ 10 min
Ready for use
1∶5
1∶2 000
Immunotech
, 百拇医药
Rb(M)
MWI 98℃ 10 min
Ready for use
1∶10
1∶30 000
Immunotech
p53(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶100
1∶8 000
Dako
, 百拇医药
ER(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶30
1∶150
1∶3 000
Dako
Ki-67(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶30
1∶80
1∶8 000
Dako
, http://www.100md.com
PR(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶40
1∶200
1∶3 200
Dako
p-gp(C219)(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶30
1∶80
1∶10 000
Dako
, 百拇医药
PcNA(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶300
1∶600
1∶20 000
Dako
GFAP(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶200
1∶800
1∶30 000
Dako
, 百拇医药
EGF(R)
Digestion
1∶100
1∶400
1∶10 000
Dako
EGFr(M)
Digestion
1∶50
1∶200
1∶8 000
Dako
, 百拇医药
TGFβ(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶150
1∶10 000
Dako
TGFα(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶200
1∶10 000
Dako
, http://www.100md.com
CD45RO(M)
NO
1∶50
1∶200
1∶5 000
Dako
Laminin(R)
Digestion
1∶1 000
1∶5 000
1∶200 000
Sigmal USA
, 百拇医药
Collagen Type IV(M)
Digestion
1∶200
1∶600
1∶80 000
Sigmal USA
Fibronectin(M)
Digestion
1∶300
1∶900
1∶80 000
Sigmal USA
, 百拇医药
ICAM-1(M)
Digestion
1∶30
1∶100
1∶10 000
Sigmal USA
Cateninα(R)
Digestion
1∶2 000
1∶5 000
1∶100 000
Sigmal USA
, http://www.100md.com
Cateninβ(R)
Digestion
1∶1 000
1∶4 000
1∶100 000
Sigmal USA
E-Cadherin(M)
Digestion
1∶100
1∶500
1∶50 000
Sigmal USA
, 百拇医药
PDGF(M)
MWI 98℃ 10 min
1∶50
1∶200
1∶10 000
Santa Cruz USA
NOS1(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶300
1∶10 000
Santa Cruz USA
, 百拇医药
NOS2(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶300
1∶10 000
Santa Cruz USA
NOS3(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶300
1∶10 000
Santa Cruz USA
, http://www.100md.com
VGEF(R)
MWI 98℃ 10 min
1∶100
1∶200
1∶8 000
Santa Cruz USA
p16(R)
Digestion
1∶80
1∶250
1∶10 000
Santa Cruz USA
, 百拇医药
CD44s(M)
NO
1∶80
1∶400
1∶50 000
Gift
CD44v4(M)
NO
1∶80
1∶400
1∶50 000
Gift
CD44v6(M)
, 百拇医药
NO
1∶80
1∶400
1∶50 000
Gift
CD44v9(M)
NO
1∶80
1∶400
1∶50 000
Gift
CD44(R)
NO
, http://www.100md.com
1∶500
1∶500
1∶100 000
Sigmal USA
MWI:Microwave irradiation;M:Mouse;R:Rabbit1.2 组织标本 ISH用组织标本为肝细胞癌及癌周肝、胃癌、肺癌、食食癌和喉癌各5例，IHC所用组织标本为肺癌、肝细胞癌、食食癌、胃癌、结肠癌、脑胶质瘤、恶性淋巴瘤、膀胱癌、喉癌、乳腺癌各5例，均来自长海和东方肝胆外科医院，为手术切除标本，取其1/2标本在30 min内入液氮内速冻并保存在-80℃冰箱中，临用前冰冻切片。另1/2标本浸入4%多聚甲醛中固定18 h，系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 μm石蜡切片，贴在经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理，180℃烤4 h，并涂有多聚赖氨酸的载玻片上，60℃烤24 h。
, 百拇医药
1.3 探针标记 nm23，p16，HPV(人乳头状瘤病毒) cRNA探针的制备按体外转录试剂盒说明书操作，Sp6 RNA聚合酶指导反义RNA合成Dig-cRNA探针，片段长分别为971，872，1 320 bp，生物素标记Bcl-2 cRNA探针购自武汉博士德公司；HBV和多药耐药(MDR)探针用PCR法标记，按PCR探针标记盒说明书操作。
1.4 酪胺盐-生物素复合物的制备 A液：临用前将10 mg生物素-N-羟基丁二酸亚胺酯溶在1 ml DMF中(10 mg/ml)；B液：10 mg酪胺盐溶在1 ml DMF中(10 mg/ml，相当于58 μmol/L)，加入10 μl TEA(7.5 mol/L 10 μl),相当于72.5 μmol/L，为酪胺盐的1.25倍；C液：在A液中加入B液(A液与B液的摩尔比为1∶1.1)使其充分酰化2 h(暗处)。合成好酪胺盐-生物素复合物用乙醇稀释到1 mg/ml，在4℃至少可保存8个月，其稳定性不受影响。
, http://www.100md.com 1.5 IHC-LSAB，EnVisionn,CSA法 参阅相关文献[3～5] 操作。
1.6 ISH方法 杂交前后洗脱所用试剂均用0.1%DEPC处理水配制。(1)杂交前处理参阅文献[6] 。(2)杂交 探针浓度500 ng/ml～2 μg/ml，每片15 μl杂交液，cRNA探针盖上防蒸发的专用膜，48℃杂交12 h，cDNA探针盖经硅化盖玻片，95℃双变性15 min，42℃杂交4 h。(3)杂交后洗脱参阅文献[6]。(4)信号放大检测： Dig标记探针接生物素化抗Dig抗体1∶200，37℃ 30 min，生物素标记探针直接用抗生蛋白链菌素-HRP 1∶500，37℃ 20 min，生物素化酪胺分子(内含0.015% H2O2)1∶500,37℃ 15 min，PBS洗3×5 min，抗生蛋白链菌素-HRP 1∶1 000， 37℃ 30 min,PBS洗3×5 min(如有必要可进一步循环放大)。0.05% DAB+0.03% H2O2显色8～15 min，水洗，苏木精衬染，微波蓝化，常规封片。
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1.7 结果判断标准 参阅文献[7]。
1.8 统计学处理 按χ2分析和参照单位分析(Ridit分析)，95%可信限不重叠为相差显著。
1.9 对照设计 ISH阳性对照均与Gene Point 试剂盒内配置阳性片为标准。经RNase消化1 h后，作杂交为阴性对照。杂交液中不加探针，结果为阴性。IHC阴性对照用PBS代替特异性一抗。
2 结 果
2.1 IHC检测结果 应用40种不同类型的第一抗体，50例10种器官肿瘤标本的石蜡包埋连续切片，分别用IHC CSA，EnVision和LSAB同时染色比较，结果从表1中可以看出，CSA法最为敏感，其次是EnVision法。CSA法较LSAB法敏感500～1 000倍，较EnVision法敏感20～100倍；EnVision法较LSAB法敏感3～6倍。背景染色3种方法基本一致，因CSA法中第一抗体高度稀释，背景染色要好于LSAB法，而EnVision法中，组织内无内源性葡聚糖多聚物存在，因此EnVision法略好于CSA和LSAB法。孵育染色时间EnVision法最短为165 min，其次是LSAB法，CSA法孵育时间最长。3种方法检测结果发现，利用3种方法的第一抗体最佳稀释后，其阳性率和阳性强度基本一致。但在肝癌、胶质瘤和喉癌中ki-67，P-gp,Bcl-2的阳性率，CSA法要高于LSAB和EnVision法10%；在乳腺癌中ER，PR的检测阳性细胞数，CSA法要高于LSAB和EnVision法5%。2例胃癌标本固定4 d，常规石蜡切片，分别检测ki-67,Rb,P-gp,PDGF,Bax,CD44,nm23,Bcl-2等抗原，结果LSAB和EnVision法均呈阴性，而用CSA法2个循环后，除ki-67，P-gp外均检测到阳性结果(图1A，B，见封四)。
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2.2 ISH检测结果 应用CSA-ISH法分别检测5种不同类型的肿瘤，6种基因和病毒探针，同时应用冰冻和石蜡切片，常规ISH法(DIG-AKP，抗生蛋白链菌素-HRP)进行敏感性、阳性率的比较。5种肿瘤的总体阳性率冰冻切片为：nm23 mRNA 60%(15/25)；p16 mRNA 64%(16/25);Bcl-2 mRNA 52%(13/25);MDR mRNA 40%(10/25)；HPV mRNA在喉癌中为60%(3/5)；HBV在肝癌中60%(3/5)。石蜡切片：nm23 mRNA 20%(5/25)；p16 mRNA 24%(6/25)；Bcl-2 mRNA 20%(5/25)；MDR mRNA 16%(4/25)；HBV DNA 60%(3/5)；HPV mRNA 40%(2/5)。CSA-ISH法冰冻切片中上述6种探针的阳性率基本一致，仅 MDR mRNA可达52%(13/25)。但石蜡切片为：nm23 mRNA 56%(14/25)；p16 mRNA 60%(15/25)；Bcl-2 mRNA 56%(14/25);MDR mRNA 44%(11/25);HPV mRNA 60%(3/5);HBV DNA 60%(3/5)。常规ISH法探针浓度需2～4 μg/ml，而CSA-ISH法探针浓度仅需0.5～1 μg/ml即可获得理想的结果。杂交时间常规ISH法需24～48 h，CSA-ISH法RNA杂交需12 h，DNA杂交仅4 h。背景染色因探针浓度的降低和杂交时间的缩短而获得较大改善(图1C，D，见封四)。常规ISH和CSA-ISH方法阳性率相比较，在石蜡切片上nm23 cRNA的阳性检测率提高36%，二者相差显著(P<0.01)，p16 mRNA MDR cRNA和Bcl-2 cRNA二者相比也相差显著(P<0.05)。
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2.3 自制CSA系统与Dako公司CSA系统的比
较 随机取5例标本，用相同的一抗和探针进行IHC和ISH检测放大比较，实验结果表明，本实验室制备的CSA系统与Dako公司CSA系统的敏感性、稳定性和背景染色基本一致。
图1 CSA系统应用于IHC和ISH的检测
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Fig 1 Application of CSA on the determining IHC and ISH
A: CD44v6 expression in poor differentiated cell of astrocytoma (×400)；
B: P53 protein expression in breast cancer (×400);
C: MDR mRNA expression in esophageal carcinoma (×150);
D: nm23 mRNA expression in gastric carcinoma (×120)
3 讨 论
, http://www.100md.com 3.1 提高IHC和ISH检测的敏感性 CSA方法能大大提高IHC和ISH的敏感性。CSA的核心试剂是酪胺盐标记酶或荧光素或金属离子或DIG或生物素等复合物。本研究根据相关文献资料进行改进[8～11]，合成的酪胺盐生物素复合物的稳定性、敏感性与Dako公司CSA盒一致，但成本大大下降。
3.2 CSA在IHC中的应用 CSA法是一种全新IHC方法，敏感性可以和IGSS法媲美，但克服了IGSS法的高背景，操作也较IGSS简便，值得推广。近来推出的EnVision法有较高的敏感性，但CSA法比EnVision法还有敏感20～100倍，不过CSA法步骤流程多，孵育时间长，内源性生物素的干扰等原因，背景染色不如EnVision法。作者认为EnVision法非常适合于IHC的鉴别诊断，而CSA较适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性较弱的IHC检测。在使用CSA法过程中，生物素化酪胺分子的浓度不能太高，一般0.009～0.007 μmol/L，如高于0.01 μmol/常出现核内的高背景染色，同时酪胺分子是HRP在H2O2存在下进行催化反应，因此时间一般15 min即可。由于该方法仅开展了几十种抗体、部分肿瘤标本的检测，可能存在某些潜在的问题，只有通过大量的使用才能对该方法作一全面的评价。Sabattini等[12]报道IHC EnVision法检测53种抗体(均为CD系列)对各类淋巴瘤的检测结果，并与PAP法、ABC法、SABC法、LSAB法和CSA法进行比较，认为EnVision法较其他方法敏感5～6倍，与CSA法基本一致，而本研究所获得结果与该研究结果不一致，有待进一步探讨。另外，Sabattini还发现有5例标本因固定1周，时间太长，其他方法均为阴性结果，仅CSA法阳性表达，与本文2例胃癌固定10 d，其他方法均阴性，仅CSA法阳性表达的结果相符，认为CSA可作为抗原破坏严重，抗原量较少的组织细胞抗原的检测。
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3.3 CSA在ISH中的应用 本研究利用CSA-ISH法分别在冰冻和石蜡切片上同时检测nm23,MDR,p16,Bcl-2,HPV mRNA和HBV DNA，结果发现，阳性检测率较传统方法有了显著的提高(P<0.01)，探针浓度可从微克水平下降到纳克水平，杂交时间从18 h缩短到4 h，1 d可完成杂交的检测和显示。可用于甲醛固定的石蜡切片，但常规的甲醛固定标本，因在固定、脱水包埋等处理过程中受RNA酶污染，mRNA降解严重，杂交信号仍然不够理想。因此，建议要想开展ISH诊断病理的单位，组织应尽量避免RNA酶的污染，在切片、贴片及烤片过程中应特别小心，例如可采用DEPC水展片，切片刀用一次性刀片，脱蜡用的二甲苯和乙醇必须是新鲜的。在应用CSA-ISH法时，第1次的抗生蛋白链菌素-HRP复合物应比常规浓度低，一般1∶500稀释，第2次可1∶1 000～1∶5 000稀释。生物素化酪胺盐0.007 μmol/L为最佳。
参考文献
, 百拇医药
[1]Bobrow MN,Harris TD,Shaughnessy KJ,et al.Catalyzed reporter deposition,a novel method of signal amplification.Application to immunoassys[J].J Immunol Methods,1989，125(1-2)：279-285.
[2]Adams JC.Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains[J].J Histochem Cytochem,1992，40(10)：1457-1463.
[3]Kerstens HMJ,Poddighe PJ,Hanselaar AGJM.A novel in situ hybridization signal amplification method based on the deposition of biotinylated tyramine[J].J Histochem Cytochem,1995，43(4)：347-352.
, 百拇医药
[4]Van der Loos CM,Naruko T,Becker AE.The use of enhanced polymer one-step staining reagents for immunoenzyme double-labelling[J].Histochem J,1996，28(10)：709-714.
[5]Chilosi M,Lestani M,Pedron S,et al.A rapid immunostaining method for frozen sections[J].Biotech Histochem,1994，69(4)：235-239.
[6]倪灿荣主编.免疫组织化学实验新技术及应用[M].北京：北京科学技术出版社，1993.268-276.
[7]王 江，倪灿荣.P53、rasp21、c-erbB-2癌基因蛋白在胃癌中的表达及分布特征[J].第二军医大学学报,1994，15(1)：20-24.
, 百拇医药
[8]Schmidt BF,Chao J,Zhu Z,et al.Signal amplification in the detection of single-copy DNA and RNA by enzyme-catalyzed deposition(CARD)of the novel fluorescent reporter substrate cy3.29-tyramide[J].J Histochem Cytochem,1997，45(3)：365-373.
[9]Hunyady B,Krempels K,Harta G,et al.Immunohistochemical signal amplification by catalyzed reporter deposition and its application in double immunostaining[J].J Histochem Cytochem,1996，44(12)：1353-1362.
, 百拇医药
[10] McNicol AM,Richmond JA.Optimizing immunohistochemistry：antigen retrieval and signal amplification[J].Histopathology,1998,32 (2)：97-103.
[11] Hopman AHN,Ramaekers FCS,Speel EJM.Rapid synthesis of biotin,digoxigenin-,trinitrophenyl-,and fluorochrome-labeled tyramides and their application for in situ hybridization using CARD amplification[J].J Histochem Cytochem,1998，46(6)：771-777.
[12] Sabattini E,Bisgaard K,Ascani S,et al.The EnVision TM+system：a new immunohistochemical method for diagnostics and research.Critical comparison with the APAAP,Chem MateTM,CSA,LSBC,and SABC techniques[J].J Clin Pathol,1998,51(7)：506-511., 百拇医药