红毛五加多糖对体外人胃癌细胞的抑制作用
红毛五加多糖对体外人胃癌细胞的抑制作用
吕晓英 曾令福 李由 王维祥 王双印
摘 要： 目的 研究红毛五加多糖对人胃癌细胞、人胚腱细胞及正常人外周血淋巴细胞的选择性抑制作用特点。方法 采用细胞形态学方法和MTT法。结果 该多糖选择性地抑制了胃癌细胞的活性和功能状态，而对人胚腱细胞影响甚微，对正常人外周血淋巴细胞无影响。结论 该多糖选择性地抑制了人胃癌细胞，用于肿瘤的防治可能较为安全。
关键词：红毛五加多糖；胃癌
癌症严重威胁着人类的健康，胃癌是最常见的恶性肿瘤之一[1]。近年来，已研制出许多高效的抗癌药物，但毒副作用较强。所以研究和开发天然植物中的某些成分作为药品、保健食品来防癌、抗癌就显得尤为重要。红毛五加属五加科植物，红毛五加多糖(Acanthopanax giraldii Harms var.hispidus Hoo polysaccharides, AGP)是红毛五加植物的茎皮水溶性提取物。研究表明红毛五加多糖对S180实体瘤具有显著抑制作用[2]，对体外培养人白血病粒细胞K562具有严重破坏作用[3]。本研究采用人胃低分化腺癌细胞株SGC-7901，并以正常人外周血淋巴细胞和人胚腱细胞作对照，研究红毛五加多糖体外抑癌作用及其特点。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验样品 AGP是红毛五加茎皮的水提液经分离纯化得到的多糖成分，由华西医科大学药学院杨培全教授惠赠。AGPⅠ：分子量为8 900，由D-半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖及未知单糖组成。AGPⅡ：分子量为83 000，由D-半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖及未知单糖组成。AGPⅢ：分子量为42 000，由半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖及未知单糖组成。AGPⅣ：为一混合多糖样品，按上述3种多糖成分在天然红毛五加茎皮中的比例配制。
1.2 细胞株
人胃低分化腺癌细胞株SGC-7901，由华西医科大学肿瘤研究所提供：人胚腱细胞[4]，由华西医科大学分子生物学教研室提供：正常人外周血淋巴细胞，取自健康成年人。
1.3 主要试剂和仪器
, 百拇医药
四甲基偶氮唑盐[3-(4、5-二甲基噻唑-)-，5-苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝，简称MTT]：SIGMA公司产品；酶联免疫检测仪：华东电子管厂产品。
1.4 实验分组
空白对照组：不加任何处理的培养液；VitC对照组：VitC加入培养液中，使其终浓度为1.0×10-4 mol/L；顺铂(Cisplatin)对照组：将顺铂用生理盐水溶解，以1.0%(v/v)加入培养液中，使其终浓度为3.3×10-5 mol/L；通过预实验得知AGPⅣ使胃癌细胞在10-3 mol/L出现细胞毒性，在10-4 mol/L出现明显抑制作用，在10-5 mol/L出现一定抑制作用，在10-6 mol/L不出现抑制作用，故将10-6～10-4 mol/L AGPⅣ进一步细分，得6.4×10-6、1.6×10-5、4.0×10-5、1.0×10-4 mol/L 4个实验组。分别观察对胃癌细胞人胚腱细胞，人淋巴细胞的影响。
, 百拇医药
1.5 细胞形态
观察7组细胞形态，选培养4d的空白对照组、4.0×10-5 mol/L AGPⅣ剂量组、顺铂对照组的细胞经10%Giemsa染色后进行显微摄像。
1.6 MTT实验
取SGC-7901细胞、人胚腱细胞和正常人外周血淋巴细胞分别接种于96孔培养板，每板100 μl。SGC-7901细胞和正常人外周血淋巴细胞，每孔5.0×103个细胞；人胚肌腱细胞孔1.0×104个细胞。接种细胞24 h后再加入上述7个组的试验样品(100 μl/孔)，每组设4个平行孔。加入试剂后培养24 h，离心(1 000 r/min，5 min)，每孔弃上清液110 μl，加入MTT(浓度5 mg/ml，10 μl/孔)，继续培养4 h后，离心(1 000 r/min,5 min)，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物甲充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度(D490)值。计算平均D490值，抑制率。
, 百拇医药
1.7 统计学分析
在计算机上用SPSS软件进行结果的方差分析。
2 实验结果
2.1 细胞形态
空白对照组细胞生长良好，呈多角形、重叠相嵌排列的典型癌细胞生长状态，见图1；AGPⅣ处理4d后，最高剂量组和次高剂量组的细胞均生长不良，出现部分梭形细胞，与顺铂组形态相似，见图2、3；最低剂量组和次低剂量组细胞形态改变不明显。
图1 培养4 d后空白对照组细胞形态 (吉氏染色×400)
, 百拇医药
Fig 1 Morphology of the cells of blank control group after cultured for 4 days (Giemsa stain×400)
图2 培养4 d后4.0×10-5mol/L AGPⅣ组细胞形态 (吉氏染色×400)
Fig 2 Morphology of the cells of 4.0×10-5mol/L AGPⅣ group after cultured for 4 days (Giemsa stain×400)
, 百拇医药
图3 培养4 d后3.3×10-5mol/L顺铂组细胞形态 (吉氏染色×100)
Fig 3 Morphology of the cells of 3.3×10-5mol/L cisplatin group after cultured for 4 days (Giemsa stain×100)
2.2 红毛五加多糖对胃癌细胞正常人外周血淋巴细胞及人胚腱细胞活性和功能状态影响的比较，见表1
表1 AGPⅣ对SGC-7901细胞、正常人外周血淋巴细胞和人胚腱细胞活性和功能状态的影响
Tab 1 Effect of AGP Ⅳ on the activity and function of the SGC-7901 cell,the lymphocyte
, 百拇医药
of peripheral blood in healthy people and the human embryonic tenocyte
Cell type
Groups
Concentration(CB/mol.L-1)
D490 value
Suppressing rate(%)
SGC-7901
Blank
-
, 百拇医药
0.97±0.04
-
VitC
1.0×10-4
0.86±0.02ac
11.86
Cisplatin
3.3×10-5
0.66±0.03ab
31.96
AGPⅣ
, 百拇医药
6.4×10-6
0.92±0.06bc
5.15
AGPⅣ
1.6×10-5
0.85±0.04ac
12.37
AGPⅣ
4.0×10-5
0.78±0.01abc
, http://www.100md.com 19.07
AGPⅣ
1.0×10-4
0.76±0.01abc
21.39
Lymphocyte
Blank
-
0.73±0.01
-
Vitc
1.0×10-4
, 百拇医药
0.75±0.01c
-
Cisplatin
3.3×10-5
0.67±0.02ab
8.25
AGPⅣ
6.4×10-6
0.72±0.01c
-
AGPⅣ
, 百拇医药
1.6×10-5
0.70±0.03b
-
AGPⅣ
4.0×10-5
0.70±0.03b
-
AGPⅣ
1.0×10-4
0.69±0.01b
-
, 百拇医药
Human embryonic tenocyte
Bland
-
1.09±0.01
-
VitC
1.0×10-4
1.12±0.03c
-
Cisplatin
3.3×10-5
, http://www.100md.com
1.04±0.02a
4.11
AGPⅣ
6.4×10-6
1.11±0.03c
-
AGPⅣ
1.6×10-5
1.09±0.02c
-
AGPⅣ
, 百拇医药
4.0×10-5
1.10±0.03c
-
AGPⅣ
1.0×10-4
1.08±0.01c
-
a:P<0.05 vs blank group; b: P<0.05 vs VitC group; c: P<0.01 vs cisplatin group
3 讨论
MTT法通过比色测定光密度值反映活细胞数和功能状态，已广泛用于一些生物活性因子的活性检测。MTT法的特点是灵敏度高，重复性好，操作简便、经济快速、易自动化，无放射性污染，与其它检测细胞活力的方法(如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验和3H-TdR掺入试验等)有良好的相关性[5～7]。本研究通过MTT实验发现，红毛五加多糖能选择性地抑制胃癌细胞活性和功能状态，而对人胚腱实验发现，红毛五加多糖能选择性地抑制胃癌细胞活性和功能状态，而对人胚腱细胞影响甚微，对正常外周血淋巴细胞的活性和功能状态无影响。且AGPⅣ最高剂量组对胃癌细胞的抑制率远远高于其对人胚腱细胞的抑制率，表明该多糖用于防治癌症可能较为安全。AGPⅣ抗癌效果虽没有抗癌药物顺铂的作用强烈，但因其毒性极小、来源广泛、提取简便及经济而应受到重视，提示AGP具有防治癌症的开发价值，但尚须进一步进行体内实验加以确证。
, 百拇医药
基金项目： 国家自然科学基金资助项目(39070111)
作者简介： 吕晓英(1973-)，女，内蒙古伊克昭盟人，硕士，实习研究员，主要从事营养与食品卫生方面的研究，发表论文10篇。电话：(028)5502097
吕晓英(成都军区军事医学研究所，昆明 650032)
曾令福(华西医科大学，成都 610041)
李由(成都军区军事医学研究所，昆明 650032)
王维祥(成都军区军事医学研究所，昆明 650032)
王双印(成都军区军事医学研究所，昆明 650032)
参考文献
, http://www.100md.com
[1] Yanai H, Noguchi T, Mizumachi S. Adenovirus mediated p53 tumor suppressor gene therapy for human gastric cancer cells in vitro and in vivo[J]. Gut,1999，44(3):366-371.
[2] 陈 萍，张莅峡，刘 泓，等.红毛五加抗肿瘤作用及免疫作用[J].中国药学杂志，1993，28(6)：351-353.
[3] 王满霞，张莅峡，刘 泓.红毛五加茎皮多糖对体外培养人白血病粒细胞超微结构影响的观察[J].中国中医基础医学杂志，1995，1(3)：29-31.
[4] 蔚 ，杨志明，彭文珍.人胚腱细胞体外培养及生物学特征研究[J].中国修复重建外科杂志，1995，9(3)：161-164.
, 百拇医药
[5] Carmichael J, DeGraff W G, Gazdar A F, et al. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing[J].Cancer Res,1987,47(4):936-942.
[6] Pieters R, Huismans D R, Leyva A, et al. Adaptation of the rapid automated tetrazolium dye based(MTT)assay for chemosensitivity testing in childhood leukaemia[J]. Cancer Lett,1988,41(3):323-332.
[7] Sargent J M, Taylor C G. Appraisal of the MTT assay a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukaemia[J]. Br J Cancer, 1989,60(2):206-210., 百拇医药
吕晓英 曾令福 李由 王维祥 王双印
摘 要： 目的 研究红毛五加多糖对人胃癌细胞、人胚腱细胞及正常人外周血淋巴细胞的选择性抑制作用特点。方法 采用细胞形态学方法和MTT法。结果 该多糖选择性地抑制了胃癌细胞的活性和功能状态，而对人胚腱细胞影响甚微，对正常人外周血淋巴细胞无影响。结论 该多糖选择性地抑制了人胃癌细胞，用于肿瘤的防治可能较为安全。
关键词：红毛五加多糖；胃癌
癌症严重威胁着人类的健康，胃癌是最常见的恶性肿瘤之一[1]。近年来，已研制出许多高效的抗癌药物，但毒副作用较强。所以研究和开发天然植物中的某些成分作为药品、保健食品来防癌、抗癌就显得尤为重要。红毛五加属五加科植物，红毛五加多糖(Acanthopanax giraldii Harms var.hispidus Hoo polysaccharides, AGP)是红毛五加植物的茎皮水溶性提取物。研究表明红毛五加多糖对S180实体瘤具有显著抑制作用[2]，对体外培养人白血病粒细胞K562具有严重破坏作用[3]。本研究采用人胃低分化腺癌细胞株SGC-7901，并以正常人外周血淋巴细胞和人胚腱细胞作对照，研究红毛五加多糖体外抑癌作用及其特点。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验样品 AGP是红毛五加茎皮的水提液经分离纯化得到的多糖成分，由华西医科大学药学院杨培全教授惠赠。AGPⅠ：分子量为8 900，由D-半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖及未知单糖组成。AGPⅡ：分子量为83 000，由D-半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖及未知单糖组成。AGPⅢ：分子量为42 000，由半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖及未知单糖组成。AGPⅣ：为一混合多糖样品，按上述3种多糖成分在天然红毛五加茎皮中的比例配制。
1.2 细胞株
人胃低分化腺癌细胞株SGC-7901，由华西医科大学肿瘤研究所提供：人胚腱细胞[4]，由华西医科大学分子生物学教研室提供：正常人外周血淋巴细胞，取自健康成年人。
1.3 主要试剂和仪器
, 百拇医药
四甲基偶氮唑盐[3-(4、5-二甲基噻唑-)-，5-苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝，简称MTT]：SIGMA公司产品；酶联免疫检测仪：华东电子管厂产品。
1.4 实验分组
空白对照组：不加任何处理的培养液；VitC对照组：VitC加入培养液中，使其终浓度为1.0×10-4 mol/L；顺铂(Cisplatin)对照组：将顺铂用生理盐水溶解，以1.0%(v/v)加入培养液中，使其终浓度为3.3×10-5 mol/L；通过预实验得知AGPⅣ使胃癌细胞在10-3 mol/L出现细胞毒性，在10-4 mol/L出现明显抑制作用，在10-5 mol/L出现一定抑制作用，在10-6 mol/L不出现抑制作用，故将10-6～10-4 mol/L AGPⅣ进一步细分，得6.4×10-6、1.6×10-5、4.0×10-5、1.0×10-4 mol/L 4个实验组。分别观察对胃癌细胞人胚腱细胞，人淋巴细胞的影响。
, 百拇医药
1.5 细胞形态
观察7组细胞形态，选培养4d的空白对照组、4.0×10-5 mol/L AGPⅣ剂量组、顺铂对照组的细胞经10%Giemsa染色后进行显微摄像。
1.6 MTT实验
取SGC-7901细胞、人胚腱细胞和正常人外周血淋巴细胞分别接种于96孔培养板，每板100 μl。SGC-7901细胞和正常人外周血淋巴细胞，每孔5.0×103个细胞；人胚肌腱细胞孔1.0×104个细胞。接种细胞24 h后再加入上述7个组的试验样品(100 μl/孔)，每组设4个平行孔。加入试剂后培养24 h，离心(1 000 r/min，5 min)，每孔弃上清液110 μl，加入MTT(浓度5 mg/ml，10 μl/孔)，继续培养4 h后，离心(1 000 r/min,5 min)，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物甲充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度(D490)值。计算平均D490值，抑制率。
, 百拇医药
1.7 统计学分析
在计算机上用SPSS软件进行结果的方差分析。
2 实验结果
2.1 细胞形态
空白对照组细胞生长良好，呈多角形、重叠相嵌排列的典型癌细胞生长状态，见图1；AGPⅣ处理4d后，最高剂量组和次高剂量组的细胞均生长不良，出现部分梭形细胞，与顺铂组形态相似，见图2、3；最低剂量组和次低剂量组细胞形态改变不明显。
图1 培养4 d后空白对照组细胞形态 (吉氏染色×400)
, 百拇医药
Fig 1 Morphology of the cells of blank control group after cultured for 4 days (Giemsa stain×400)
图2 培养4 d后4.0×10-5mol/L AGPⅣ组细胞形态 (吉氏染色×400)
Fig 2 Morphology of the cells of 4.0×10-5mol/L AGPⅣ group after cultured for 4 days (Giemsa stain×400)
, 百拇医药
图3 培养4 d后3.3×10-5mol/L顺铂组细胞形态 (吉氏染色×100)
Fig 3 Morphology of the cells of 3.3×10-5mol/L cisplatin group after cultured for 4 days (Giemsa stain×100)
2.2 红毛五加多糖对胃癌细胞正常人外周血淋巴细胞及人胚腱细胞活性和功能状态影响的比较，见表1
表1 AGPⅣ对SGC-7901细胞、正常人外周血淋巴细胞和人胚腱细胞活性和功能状态的影响
Tab 1 Effect of AGP Ⅳ on the activity and function of the SGC-7901 cell,the lymphocyte
, 百拇医药
of peripheral blood in healthy people and the human embryonic tenocyte
Cell type
Groups
Concentration(CB/mol.L-1)
D490 value
Suppressing rate(%)
SGC-7901
Blank
-
, 百拇医药
0.97±0.04
-
VitC
1.0×10-4
0.86±0.02ac
11.86
Cisplatin
3.3×10-5
0.66±0.03ab
31.96
AGPⅣ
, 百拇医药
6.4×10-6
0.92±0.06bc
5.15
AGPⅣ
1.6×10-5
0.85±0.04ac
12.37
AGPⅣ
4.0×10-5
0.78±0.01abc
, http://www.100md.com 19.07
AGPⅣ
1.0×10-4
0.76±0.01abc
21.39
Lymphocyte
Blank
-
0.73±0.01
-
Vitc
1.0×10-4
, 百拇医药
0.75±0.01c
-
Cisplatin
3.3×10-5
0.67±0.02ab
8.25
AGPⅣ
6.4×10-6
0.72±0.01c
-
AGPⅣ
, 百拇医药
1.6×10-5
0.70±0.03b
-
AGPⅣ
4.0×10-5
0.70±0.03b
-
AGPⅣ
1.0×10-4
0.69±0.01b
-
, 百拇医药
Human embryonic tenocyte
Bland
-
1.09±0.01
-
VitC
1.0×10-4
1.12±0.03c
-
Cisplatin
3.3×10-5
, http://www.100md.com
1.04±0.02a
4.11
AGPⅣ
6.4×10-6
1.11±0.03c
-
AGPⅣ
1.6×10-5
1.09±0.02c
-
AGPⅣ
, 百拇医药
4.0×10-5
1.10±0.03c
-
AGPⅣ
1.0×10-4
1.08±0.01c
-
a:P<0.05 vs blank group; b: P<0.05 vs VitC group; c: P<0.01 vs cisplatin group
3 讨论
MTT法通过比色测定光密度值反映活细胞数和功能状态，已广泛用于一些生物活性因子的活性检测。MTT法的特点是灵敏度高，重复性好，操作简便、经济快速、易自动化，无放射性污染，与其它检测细胞活力的方法(如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验和3H-TdR掺入试验等)有良好的相关性[5～7]。本研究通过MTT实验发现，红毛五加多糖能选择性地抑制胃癌细胞活性和功能状态，而对人胚腱实验发现，红毛五加多糖能选择性地抑制胃癌细胞活性和功能状态，而对人胚腱细胞影响甚微，对正常外周血淋巴细胞的活性和功能状态无影响。且AGPⅣ最高剂量组对胃癌细胞的抑制率远远高于其对人胚腱细胞的抑制率，表明该多糖用于防治癌症可能较为安全。AGPⅣ抗癌效果虽没有抗癌药物顺铂的作用强烈，但因其毒性极小、来源广泛、提取简便及经济而应受到重视，提示AGP具有防治癌症的开发价值，但尚须进一步进行体内实验加以确证。
, 百拇医药
基金项目： 国家自然科学基金资助项目(39070111)
作者简介： 吕晓英(1973-)，女，内蒙古伊克昭盟人，硕士，实习研究员，主要从事营养与食品卫生方面的研究，发表论文10篇。电话：(028)5502097
吕晓英(成都军区军事医学研究所，昆明 650032)
曾令福(华西医科大学，成都 610041)
李由(成都军区军事医学研究所，昆明 650032)
王维祥(成都军区军事医学研究所，昆明 650032)
王双印(成都军区军事医学研究所，昆明 650032)
参考文献
, http://www.100md.com
[1] Yanai H, Noguchi T, Mizumachi S. Adenovirus mediated p53 tumor suppressor gene therapy for human gastric cancer cells in vitro and in vivo[J]. Gut,1999，44(3):366-371.
[2] 陈 萍，张莅峡，刘 泓，等.红毛五加抗肿瘤作用及免疫作用[J].中国药学杂志，1993，28(6)：351-353.
[3] 王满霞，张莅峡，刘 泓.红毛五加茎皮多糖对体外培养人白血病粒细胞超微结构影响的观察[J].中国中医基础医学杂志，1995，1(3)：29-31.
[4] 蔚 ，杨志明，彭文珍.人胚腱细胞体外培养及生物学特征研究[J].中国修复重建外科杂志，1995，9(3)：161-164.
, 百拇医药
[5] Carmichael J, DeGraff W G, Gazdar A F, et al. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing[J].Cancer Res,1987,47(4):936-942.
[6] Pieters R, Huismans D R, Leyva A, et al. Adaptation of the rapid automated tetrazolium dye based(MTT)assay for chemosensitivity testing in childhood leukaemia[J]. Cancer Lett,1988,41(3):323-332.
[7] Sargent J M, Taylor C G. Appraisal of the MTT assay a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukaemia[J]. Br J Cancer, 1989,60(2):206-210., 百拇医药