米非司酮用于足月孕鼠引产时孕鼠及胎鼠器官的病理学观察及形态定量分析
作者：张宁媛 胡娅莉 项小人
单位：张宁媛(南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科 210008)；胡娅莉(南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科 210008)；项小人(南京中医药大学形态研究室)
关键词：米非司酮 足月引产 图像分析
江苏医药001112 【摘要】 目的 探讨米非司酮用于足月孕鼠引产对胎鼠及孕鼠的安全性影响。方法 妊娠大鼠27只，随机分成3组，妊娠第18天分别给予不同剂量的米非司酮(0、1.6 mg/kg、10 mg/kg)，48小时后取重要脏器行组织学观察。结果 胎鼠的心、肺、肝、肾、大脑和孕鼠的心、肺、肝、肾、脾的镜检与图像分析结果，除图像分析显示大剂量组肾小球面积较对照组增大外，其余未发现统计学差异。结论 在选用的剂量范围和实验条件下，米非司酮用于足月孕鼠引产对胎仔是安全的。孕鼠大剂量组肾小球面积增大值得重视，米非司酮剂量选择应以能起促熟效果的最低剂量为适宜。
, http://www.100md.com
The quantitative analysis of mifepristone in induced labor at term on the organ morphoea of fetal and pregnant rats
ZHANG Ningyuan，HU Yali，XIAN Xiaoren.
(Drum Tower Hospital，Medical School of Nanjing University，Nanjing, 210008)
【Abstract】 Objective To study the safety of mifepristone in induced labor at term on fetal and pregnant rats.Methods 27 pregnant rats were divided into 3 groups，randomized to receive placebo or mifepristone 1.6mg/kg or 10mg/kg on pregnant day 18 and after 48 hours observed the change of histological targets.Results No significant changes were found regarding mifepristone doses to the morphologic observation and further the image analysis of hearts，lungs，livers，kidneys，cerebrums of fetal rats and hearts，lungs，livers，kidneys，spleens of pregnant rats among three groups，except enlarging pregnant renal corpuscles areas from image analysis comparing the large dose group to the placebo group.Conclusion According to dose limits and experimental conditions，it was safe for fetal rats using mifepristone in labor induction at term.Renal positive findings of pregnant rats should be taken seriously.Selecting the suitable mifepristone dose ought to bebased on the basis of the minimum dose promoting cervix ripeness.
, 百拇医药
【Key words】 Mifepriston Induced labor at term Image analysis
米非司酮用于足月妊娠引产的首次报道见于1991年。次年的双盲实验显示米非司酮能引起与自然分娩相似的宫颈促熟过程，起引产作用[1]。由于不直接引起宫缩，更无子宫过强收缩，故对胎儿宫内状况有利[2]。但米非司酮及其代谢产物能通过胎盘进入胎儿体内[3]，故在足月妊娠活胎引产中的安全性问题仍在探讨之中[4]。
资料与方法
一、研究对象
室温18℃～28℃，相对湿度40%～70%的开放系统内，清洁级SD雌性大鼠(体重200～220 g，购自南京军区南京总医院实验动物中心)与雄性大鼠2∶1同笼饲养，清晨阴道涂片发现大量精子或阴道栓脱落日定为妊娠第0天。将孕鼠27只随机分为三组，每组9只，妊娠第18天称重后腹腔注射给药，对照组标为组1给予对照溶剂、小剂量实验组标为组2给予米非司酮1.6 mg/kg、大剂量实验组标为组3给予米非司酮10 mg/kg，用药48小时后剖腹取胎。
, 百拇医药
二、研究方法
1.母鼠取心、肺、肝、肾、脾，胎鼠取心、肺、肝、肾、大脑固定于10%的中性甲醛，梯度酒精脱水、浸蜡、包埋、切片，常规HE染色，于40～400倍光镜下观察。
2.图像分析
采用CMIAS98A多功能真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学出品)。对肝脏的血窦采用单点彩色分割，利用体视分析模块计算出面积，将该面积与场总面积的比值作为量化指标。肝脏细胞与同一截面的心肌细胞，采用实域分割，分别标记细胞质与细胞核，利用细胞分析模块，计算出目标细胞的细胞核浆比。肾脏的肾小球组织采用肾小球分析模块，测定肾小球的面积。每张切片随机取互不重叠的5个视野。
三、统计学处理
采用SPSS统计分析软件进行方差分析。表中组别1、2、3分别代表对照组、小剂量实验组和大剂量实验组。统计结果以P<0.05为显著性差异。
, 百拇医药
结 果
一、米非司酮对胎鼠器官形态的影响
1.胎鼠心、肺、肝、肾、大脑的巨检与光镜下观察
各脏器大小、色泽、质地无异常。胎心：三组心肌细胞发育好，未见心肌纤维的变性坏死及增生肥大，间质无充血水肿及炎性细胞浸润。胎肺：三组肺泡发育成熟，未见明显肺泡上皮增生水肿，间质无炎性细胞浸润。胎肝：三组小叶和汇管区结构完整，未见肝细胞的变性。胎肾：三组肾小球、肾小管发育良好，未发现明显组织细胞肿胀、炎性细胞浸润。胎脑：三组胎鼠大脑均见皮质发育良好，分层清晰，细胞排列有序。
2.胎鼠心、肝、肾的图像分析
在相同的场总面积和相同的放大倍数的前提下，计算出心肌细胞、肝细胞和肾小球面积，分别经统计比较，没有发现米非司酮组与对照组之间有显著性差异。见表1。
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表1 三组胎鼠脏器图像分析的变化(
±s) 组别
例数
心肌细胞面积
肝细胞面积
肾小球面积
1
9
45.02±7.86
39.03±6.60
1 384±117
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2
9
40.82±6.85
44.89±5.76
1 371±213
3
9
46.22±7.73
44.36±7.30
1 497±128
二、米非司酮对孕鼠器官形态的影响
1.孕鼠心、肺、肝、肾、脾的巨检与光镜下观察
, 百拇医药
各脏器大小、色泽、质地无异常。心脏：三组均未见心肌纤维的变性坏死及增生肥大，间质无充血水肿及炎性细胞浸润。肺脏：三组均未见肺实变，无明显肺泡上皮增生水肿，间质无炎性细胞浸润。肝脏：三组小叶和汇管区结构完整，未见肝细胞的坏死、脂肪变、气球样变性、透明样变性、枯否氏细胞及淋巴细胞浸润。肾脏：三组肾小球正常，未见明显上皮细胞肿胀、空泡变性，未见系膜细胞增生及白细胞浸润。脾脏：三组均未见充血、炎性细胞增多。
2.孕鼠心、肝、肾的图像分析
利用细胞分析模块计算心肌细胞、肝细胞核浆比，利用体视分析模块计算肝脏血窦面积，没有发现米非司酮组与对照组之间有显著性差异。利用肾小球分析模块计算肾小球面积，小剂量组与对照组间未见显著性差异，但大剂量组的肾小球面积较对照组明显增大，P<0.05。见表2。表2 三组孕鼠脏器图像分析的变化(±s) 组
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别
例
数
心肌细胞核浆比
肝细胞核浆比
肝脏血窦
肾小球面积
1
9
0.1400±0.0600
0.2138±0.0598
14.16±5.31
5 737±1 741
, http://www.100md.com
2
9
0.1138±0.0674
0.2329±0.0594
13.71±4.46
7 241±1 834
3
9
0.1200±0.0464
0.2186±0.0438
12.85±5.47
7 971±2 615*
, 百拇医药
与组1比较*P<0.05讨 论
评价药物的安全性需观察重要脏器的形态学变化，而以往报道的米非司酮用于足月引产的安全性研究集中于人类学生化功能与胎盘形态的临床资料[5]，多采用米非司酮与宫缩剂的配伍应用，没有评价米非司酮不同剂量对完全性的相关性影响。在足月活胎重要脏器的系列形态学研究因为取材不易仍然是一个空白，已有报道只涉及中期妊娠[6]。基于弥补人类学研究中尚存不足之处，我们设计了严格控制条件的米非司酮足月妊娠引产安全性研究的动物实验。采用米非司酮单因素设计，没有配伍宫缩剂的使用，以排除其他药物引起强烈宫缩造成缺氧对胎鼠脏器形态功能的可能影响。根据临床报道米非司酮剂量控制于100 mg～600 mg[7，8]，以60 kg体重的换算，选用上下边界剂量1.6 mg/kg和10 mg/kg，观察安全性检测指标是否有剂量相关性改变。形态学改变是观察的重点，实验中对胎鼠及孕鼠的重要脏器进行取材，除常规巨检与镜检外，引入了病理图像分析系统，使形态学成为客观、可重复的定量研究。
, 百拇医药
米非司酮作用48小时，足月胎鼠的重要脏器心、肺、肝、肾、大脑的光镜形态学观察见各脏器发育成熟，无缺血缺氧改变。原担心米非司酮拮抗糖皮质激素是否会影响胎儿肺成熟，病理切片的结果未发现肺成熟不良。为进一步定量研究，引入图像分析系统，发现米非司酮剂量对胎鼠心肌、肝细胞与肾小球面积的量化指标无明显影响。提示米非司酮在选用的剂量范围和实验条件下，对胎仔是安全的。
对人类学研究往往无法提取的母体内脏标本，在本实验中对母鼠进行了取材，在镜下观察的基础上引入图像分析。细胞的核浆比作为反映细胞形态功能的单一指标，较细胞面积、核面积等更为全面。在心肌细胞、肝细胞核浆比的分析中，没有发现从数值上体现出来的细胞肿胀或核固缩现象。肝脏血窦作为反映肝脏组织学变化的常用指标，也无明显差异。对肾小球面积进行计算时，发现随着剂量的增加，肾小球面积有增大的趋势，大剂量组与对照组间有统计学差异(P<0.05)，但光镜下没有观察到大剂量组肾小球细胞结构明显异常。是否图像分析作为形态学定量分析方法，较常规镜检更为精确，在其他形态学手段尚未发现异常时，已从形态定量上反映出微小的变化。
, 百拇医药
米非司酮在体内的半衰期为20～25小时，平均潴留时间与剂量呈正相关。现用于足月引产的总剂量控制在100～600 mg，引产效果都见显效报道。通过本实验对米非司酮高低剂量用于足月孕鼠引产时孕鼠及胎仔的安全性研究，虽然没有发现米非司酮的剂量对胎鼠脏器形态的相关性影响，但图像分析大剂量下母鼠肾脏的改变仍然应引起重视，米非司酮用于足月妊娠引产的剂量选择应以能起促熟效果的最低剂量为适宜。
米非司酮在足月妊娠引产中的应用不足十年，安全性还要进一步评价，对婴儿的远期影响更待长期观察。对其启动分娩的细胞分子生物学机制、通过血胎屏障的方式、临床合理剂量的选择、高危妊娠中的应用等，仍是主要有待研究的问题。
参考文献
1，Frydman R，Lelaidier C，Baton-saint-Mleux C，et al.Labor induction in women at term with mifepristone (RU486)：A doubleblind，randomized，placebo-controlled study.Obstet Gynecol，1992，80：972-976.
, http://www.100md.com
2，Glacalone PL，Targosz V，Laffargue F，et al.Cervical ripening with mifepristone before labor induction：a randomized study.Obstet Gynecol，1998，92：487-492.
3，Thong KJ，Baird DT.A study of gemeprost alone，dilapan or mifepristone in combination with gemeprost for the termination of second trimester pregnancy.Contraception，1992，46：11-17.
4，张宁媛，胡娅莉.米非司酮用于足月妊娠引产的疗效及安全性.中华妇产科杂志，1999，34：751-753.
5，胡娅莉，周重宛，王志群，等.米非司酮用于足月妊娠引产胎盘电镜观察及定量分析.实用妇产科杂志，2000，16：202-204.
, 百拇医药
6，李明，杨菁，冯淑芝，等.米非司酮配伍米索前列醇终止中期妊娠时母儿安全性的研究.中华医学杂志，1997，77：221-222.
7，胡娅莉，周重宛，罗月娥，等.小剂量米非司酮用于足月高危妊娠引产的观察.江苏临床医学杂志，1999，3：520-522.
8，Hoffer MC，Charlier C，Giacalone PL，et al.Evaluation of combination RU 486-laminariatents-misoprostol-peridural anesthesia in second and third trimester induced abortions.J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris)，1998，27：83-86.
(收稿：2000-01-11 修回：2000-05-12), 百拇医药
单位：张宁媛(南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科 210008)；胡娅莉(南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科 210008)；项小人(南京中医药大学形态研究室)
关键词：米非司酮 足月引产 图像分析
江苏医药001112 【摘要】 目的 探讨米非司酮用于足月孕鼠引产对胎鼠及孕鼠的安全性影响。方法 妊娠大鼠27只，随机分成3组，妊娠第18天分别给予不同剂量的米非司酮(0、1.6 mg/kg、10 mg/kg)，48小时后取重要脏器行组织学观察。结果 胎鼠的心、肺、肝、肾、大脑和孕鼠的心、肺、肝、肾、脾的镜检与图像分析结果，除图像分析显示大剂量组肾小球面积较对照组增大外，其余未发现统计学差异。结论 在选用的剂量范围和实验条件下，米非司酮用于足月孕鼠引产对胎仔是安全的。孕鼠大剂量组肾小球面积增大值得重视，米非司酮剂量选择应以能起促熟效果的最低剂量为适宜。
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The quantitative analysis of mifepristone in induced labor at term on the organ morphoea of fetal and pregnant rats
ZHANG Ningyuan，HU Yali，XIAN Xiaoren.
(Drum Tower Hospital，Medical School of Nanjing University，Nanjing, 210008)
【Abstract】 Objective To study the safety of mifepristone in induced labor at term on fetal and pregnant rats.Methods 27 pregnant rats were divided into 3 groups，randomized to receive placebo or mifepristone 1.6mg/kg or 10mg/kg on pregnant day 18 and after 48 hours observed the change of histological targets.Results No significant changes were found regarding mifepristone doses to the morphologic observation and further the image analysis of hearts，lungs，livers，kidneys，cerebrums of fetal rats and hearts，lungs，livers，kidneys，spleens of pregnant rats among three groups，except enlarging pregnant renal corpuscles areas from image analysis comparing the large dose group to the placebo group.Conclusion According to dose limits and experimental conditions，it was safe for fetal rats using mifepristone in labor induction at term.Renal positive findings of pregnant rats should be taken seriously.Selecting the suitable mifepristone dose ought to bebased on the basis of the minimum dose promoting cervix ripeness.
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【Key words】 Mifepriston Induced labor at term Image analysis
米非司酮用于足月妊娠引产的首次报道见于1991年。次年的双盲实验显示米非司酮能引起与自然分娩相似的宫颈促熟过程，起引产作用[1]。由于不直接引起宫缩，更无子宫过强收缩，故对胎儿宫内状况有利[2]。但米非司酮及其代谢产物能通过胎盘进入胎儿体内[3]，故在足月妊娠活胎引产中的安全性问题仍在探讨之中[4]。
资料与方法
一、研究对象
室温18℃～28℃，相对湿度40%～70%的开放系统内，清洁级SD雌性大鼠(体重200～220 g，购自南京军区南京总医院实验动物中心)与雄性大鼠2∶1同笼饲养，清晨阴道涂片发现大量精子或阴道栓脱落日定为妊娠第0天。将孕鼠27只随机分为三组，每组9只，妊娠第18天称重后腹腔注射给药，对照组标为组1给予对照溶剂、小剂量实验组标为组2给予米非司酮1.6 mg/kg、大剂量实验组标为组3给予米非司酮10 mg/kg，用药48小时后剖腹取胎。
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二、研究方法
1.母鼠取心、肺、肝、肾、脾，胎鼠取心、肺、肝、肾、大脑固定于10%的中性甲醛，梯度酒精脱水、浸蜡、包埋、切片，常规HE染色，于40～400倍光镜下观察。
2.图像分析
采用CMIAS98A多功能真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学出品)。对肝脏的血窦采用单点彩色分割，利用体视分析模块计算出面积，将该面积与场总面积的比值作为量化指标。肝脏细胞与同一截面的心肌细胞，采用实域分割，分别标记细胞质与细胞核，利用细胞分析模块，计算出目标细胞的细胞核浆比。肾脏的肾小球组织采用肾小球分析模块，测定肾小球的面积。每张切片随机取互不重叠的5个视野。
三、统计学处理
采用SPSS统计分析软件进行方差分析。表中组别1、2、3分别代表对照组、小剂量实验组和大剂量实验组。统计结果以P<0.05为显著性差异。
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结 果
一、米非司酮对胎鼠器官形态的影响
1.胎鼠心、肺、肝、肾、大脑的巨检与光镜下观察
各脏器大小、色泽、质地无异常。胎心：三组心肌细胞发育好，未见心肌纤维的变性坏死及增生肥大，间质无充血水肿及炎性细胞浸润。胎肺：三组肺泡发育成熟，未见明显肺泡上皮增生水肿，间质无炎性细胞浸润。胎肝：三组小叶和汇管区结构完整，未见肝细胞的变性。胎肾：三组肾小球、肾小管发育良好，未发现明显组织细胞肿胀、炎性细胞浸润。胎脑：三组胎鼠大脑均见皮质发育良好，分层清晰，细胞排列有序。
2.胎鼠心、肝、肾的图像分析
在相同的场总面积和相同的放大倍数的前提下，计算出心肌细胞、肝细胞和肾小球面积，分别经统计比较，没有发现米非司酮组与对照组之间有显著性差异。见表1。
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表1 三组胎鼠脏器图像分析的变化(
±s) 组别例数
心肌细胞面积
肝细胞面积
肾小球面积
1
9
45.02±7.86
39.03±6.60
1 384±117
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2
9
40.82±6.85
44.89±5.76
1 371±213
3
9
46.22±7.73
44.36±7.30
1 497±128
二、米非司酮对孕鼠器官形态的影响
1.孕鼠心、肺、肝、肾、脾的巨检与光镜下观察
, 百拇医药
各脏器大小、色泽、质地无异常。心脏：三组均未见心肌纤维的变性坏死及增生肥大，间质无充血水肿及炎性细胞浸润。肺脏：三组均未见肺实变，无明显肺泡上皮增生水肿，间质无炎性细胞浸润。肝脏：三组小叶和汇管区结构完整，未见肝细胞的坏死、脂肪变、气球样变性、透明样变性、枯否氏细胞及淋巴细胞浸润。肾脏：三组肾小球正常，未见明显上皮细胞肿胀、空泡变性，未见系膜细胞增生及白细胞浸润。脾脏：三组均未见充血、炎性细胞增多。
2.孕鼠心、肝、肾的图像分析
利用细胞分析模块计算心肌细胞、肝细胞核浆比，利用体视分析模块计算肝脏血窦面积，没有发现米非司酮组与对照组之间有显著性差异。利用肾小球分析模块计算肾小球面积，小剂量组与对照组间未见显著性差异，但大剂量组的肾小球面积较对照组明显增大，P<0.05。见表2。表2 三组孕鼠脏器图像分析的变化(
±s) 组, http://www.100md.com
别
例
数
心肌细胞核浆比
肝细胞核浆比
肝脏血窦
肾小球面积
1
9
0.1400±0.0600
0.2138±0.0598
14.16±5.31
5 737±1 741
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2
9
0.1138±0.0674
0.2329±0.0594
13.71±4.46
7 241±1 834
3
9
0.1200±0.0464
0.2186±0.0438
12.85±5.47
7 971±2 615*
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与组1比较*P<0.05讨 论
评价药物的安全性需观察重要脏器的形态学变化，而以往报道的米非司酮用于足月引产的安全性研究集中于人类学生化功能与胎盘形态的临床资料[5]，多采用米非司酮与宫缩剂的配伍应用，没有评价米非司酮不同剂量对完全性的相关性影响。在足月活胎重要脏器的系列形态学研究因为取材不易仍然是一个空白，已有报道只涉及中期妊娠[6]。基于弥补人类学研究中尚存不足之处，我们设计了严格控制条件的米非司酮足月妊娠引产安全性研究的动物实验。采用米非司酮单因素设计，没有配伍宫缩剂的使用，以排除其他药物引起强烈宫缩造成缺氧对胎鼠脏器形态功能的可能影响。根据临床报道米非司酮剂量控制于100 mg～600 mg[7，8]，以60 kg体重的换算，选用上下边界剂量1.6 mg/kg和10 mg/kg，观察安全性检测指标是否有剂量相关性改变。形态学改变是观察的重点，实验中对胎鼠及孕鼠的重要脏器进行取材，除常规巨检与镜检外，引入了病理图像分析系统，使形态学成为客观、可重复的定量研究。
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米非司酮作用48小时，足月胎鼠的重要脏器心、肺、肝、肾、大脑的光镜形态学观察见各脏器发育成熟，无缺血缺氧改变。原担心米非司酮拮抗糖皮质激素是否会影响胎儿肺成熟，病理切片的结果未发现肺成熟不良。为进一步定量研究，引入图像分析系统，发现米非司酮剂量对胎鼠心肌、肝细胞与肾小球面积的量化指标无明显影响。提示米非司酮在选用的剂量范围和实验条件下，对胎仔是安全的。
对人类学研究往往无法提取的母体内脏标本，在本实验中对母鼠进行了取材，在镜下观察的基础上引入图像分析。细胞的核浆比作为反映细胞形态功能的单一指标，较细胞面积、核面积等更为全面。在心肌细胞、肝细胞核浆比的分析中，没有发现从数值上体现出来的细胞肿胀或核固缩现象。肝脏血窦作为反映肝脏组织学变化的常用指标，也无明显差异。对肾小球面积进行计算时，发现随着剂量的增加，肾小球面积有增大的趋势，大剂量组与对照组间有统计学差异(P<0.05)，但光镜下没有观察到大剂量组肾小球细胞结构明显异常。是否图像分析作为形态学定量分析方法，较常规镜检更为精确，在其他形态学手段尚未发现异常时，已从形态定量上反映出微小的变化。
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米非司酮在体内的半衰期为20～25小时，平均潴留时间与剂量呈正相关。现用于足月引产的总剂量控制在100～600 mg，引产效果都见显效报道。通过本实验对米非司酮高低剂量用于足月孕鼠引产时孕鼠及胎仔的安全性研究，虽然没有发现米非司酮的剂量对胎鼠脏器形态的相关性影响，但图像分析大剂量下母鼠肾脏的改变仍然应引起重视，米非司酮用于足月妊娠引产的剂量选择应以能起促熟效果的最低剂量为适宜。
米非司酮在足月妊娠引产中的应用不足十年，安全性还要进一步评价，对婴儿的远期影响更待长期观察。对其启动分娩的细胞分子生物学机制、通过血胎屏障的方式、临床合理剂量的选择、高危妊娠中的应用等，仍是主要有待研究的问题。
参考文献
1，Frydman R，Lelaidier C，Baton-saint-Mleux C，et al.Labor induction in women at term with mifepristone (RU486)：A doubleblind，randomized，placebo-controlled study.Obstet Gynecol，1992，80：972-976.
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2，Glacalone PL，Targosz V，Laffargue F，et al.Cervical ripening with mifepristone before labor induction：a randomized study.Obstet Gynecol，1998，92：487-492.
3，Thong KJ，Baird DT.A study of gemeprost alone，dilapan or mifepristone in combination with gemeprost for the termination of second trimester pregnancy.Contraception，1992，46：11-17.
4，张宁媛，胡娅莉.米非司酮用于足月妊娠引产的疗效及安全性.中华妇产科杂志，1999，34：751-753.
5，胡娅莉，周重宛，王志群，等.米非司酮用于足月妊娠引产胎盘电镜观察及定量分析.实用妇产科杂志，2000，16：202-204.
, 百拇医药
6，李明，杨菁，冯淑芝，等.米非司酮配伍米索前列醇终止中期妊娠时母儿安全性的研究.中华医学杂志，1997，77：221-222.
7，胡娅莉，周重宛，罗月娥，等.小剂量米非司酮用于足月高危妊娠引产的观察.江苏临床医学杂志，1999，3：520-522.
8，Hoffer MC，Charlier C，Giacalone PL，et al.Evaluation of combination RU 486-laminariatents-misoprostol-peridural anesthesia in second and third trimester induced abortions.J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris)，1998，27：83-86.
(收稿：2000-01-11 修回：2000-05-12), 百拇医药