子宫内膜异位症与细胞凋亡关系的研究
作者：李红霞 冷静 姚玉宇 李风山 彭韬 仓为民 钱宁
单位：李红霞(南京市妇幼保健院 210004)；李风山(南京市妇幼保健院 210004)；仓为民(南京市妇幼保健院 210004)；钱宁(南京市妇幼保健院 210004)；冷静(南京医科大学病理学教研室)；姚玉宇(南京医科大学病理学教研室)；彭韬(南京医科大学病理学教研室)
关键词：原位细胞凋亡标记 原位分子杂交 细胞凋亡 子宫内膜异位症
江苏医药001114 【摘要】 目的 从细胞凋亡水平和p53基因表达的差异探讨子宫内膜异位症(EM)的发病机理。方法 38例EM标本行HE染色、原位细胞凋亡标记实验(TUNEL)，p53mRNA的原位分子杂交实验。以正常子宫内膜作正常对照，经Dnase处理的子宫内膜为阳性对照，设空白阴性对照。结果 TUNEL实验结果，正常分泌期子宫内膜中细胞凋亡率为24.29%，EM的细胞凋亡率为3.64%。p53在EM的表达为7.43%，而正常对照组为28.51%，差异有显著性(P<0.05)。结论 EM的细胞凋亡水平和p53的表达水平明显低于正常对照组。EM的发病可能与子宫内膜的细胞凋亡水平降低有关。
, http://www.100md.com
A study of the relationship between endometriosis and apoptosis
LI Hongxia，LENG Jing，YAO Yuyu，et al.
(Nanjing Maternity and Child Health Hospital，Nanjing, 210004)
【Abstract】 Objective To study the pathogenesis of EM by detecting the cell apoptosis and the p53 gene expression of EM.Methods Morphological changes of 38 specimens of EM were examined by HE dying，while cell apoptosis and apoptotic associated gene expression of p53 in EM were studied by TUNEL and in situ hybridization respectively.Controls were set by normal endometrium，the sample treated by Dnase，and negative.Results The rate of apoptosis cells in normal endometrium is 24.29% and in EM is 3.64%.The expression of p53 gene in tissues of EM is 7.47 per 100 cells and in normal endometrium 28.51.The difference is marked(P<0.05).Conclusion The cell apoptosis and p53 gene expression level of EM are lower than normal endometrium.There may be a relationship between the low level cell apoptosis and pathogenesis of EM.
, 百拇医药
【Key words】 TUNEL In situ hybridization Apoptosis Endometriosis(EM)
用原位标记凋亡细胞实验和原位分子杂交实验对EM标本进行检测，观察EM内膜细胞凋亡的水平和p53基因的表达，从细胞凋亡的角度探讨EM的发病机理。
材料和方法
一、标本
38例新鲜EM标本取自南京市妇幼保健院1998年～1999年确诊EM病人。标本经中性福尔马林固定。患者平均年龄38岁(25～47岁)。取10例正常分泌期子宫内膜标本作处理。
二、试剂及方法
1.主要试剂：In Situ cell Death Detection Kit和DIG High Prime DNA labeling and detection Kit为宝灵曼公司产品；p53cDNA裸探针，1.8kb为北京中山公司产品。
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2.方法：石蜡切片分别进行HE染色、细胞凋亡原位标记和原位杂交试验，观察异位子宫内膜的细胞凋亡水平及凋亡相关基因的表达水平。
(1)细胞凋亡原位标记实验：采用末端转移酶(TdT)介导的dUTP的DNA缺口3′-OH端标记法TUNEL检测上述标本。主要步骤如下：石蜡切片经过0.3%过氧化氢处理、蛋白酶K 37℃10分钟。Dnase处理阳性对照片37℃10分钟。标记：TdT与标记缓冲液的比例为1∶39，37℃孵育1小时。阴性对照只加标记缓冲液，不加TdT酶。POD酶联抗体(1∶1000稀释)作用37℃30分钟。DAB显色。
(2)p53原位杂交：p53探针的标记采用试剂盒提供的方法，以随机引物法，用地高辛(Dig)标记的dUTP标记p53cDNA，标记后定量鉴定。
原位杂交的主要步骤为：石蜡切片经4%多聚甲醛后固定20分钟，加入预杂交液进行预杂交42℃3小时，加入含变性p53探针的杂交液50μl，42℃杂交20小时，加入抗Dig的碱性磷酸酶酶联抗体，37℃作用30分钟。最后以NBT/BCIP显色液显色。阴性对照不加探针，阳性对照为p53阳性表达的鼻咽癌组织。所有试剂及物品经Dnase灭活处理。
, 百拇医药
(3)光镜检查：EM常规病理组织学检查；TUNEL实验阳性标记细胞的百分率：记数5个高倍视野EM组织中细胞总数和凋亡阳性标记的细胞数，计算百分率；观察原位杂交实验p53mRNA的表达水平和定位，同上计算百分率。
(4)统计学处理：统计变量采用均数±标准差。
结 果
光镜下病理形态特征：HE染色的切片中，EM囊肿病灶标本见子宫内膜组织结构，可见子宫内膜上皮及间质。陈旧性病灶则可见玻璃样变。部分EM组织细胞可见细胞固缩、胞浆深染，核浓缩、碎裂，呈典型的凋亡小体，为凋亡细胞的形态特征，凋亡细胞周围无炎症反应。TUNEL实验：EM组织阳性标记的细胞占总细胞数的3.64%，正常子宫内膜的阳性标记的细胞为24.29%。差异有显著性(P<0.05)。EM组织中的细胞凋亡水平明显低于正常子宫内膜。
原位杂交实验：EM组织中p53mRNA的表达率为7.43%，而正常子宫内膜组为28.51%。
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讨 论
正常的子宫内膜呈周期性增生和脱落，由于受细胞凋亡的调控作用，脱落的内膜碎片，不再具有增殖能力而停止继续生长，从而维持组织器官的正常结构和功能[1]。EM的发病机理迄今不明，半个世纪以来，人们围绕EM的组织发生学进行了广泛的探索，提出许多推论与学说，到目前为止还没有一种学说能圆满解释EM的发病机理。雌激素水平增高可以促进本病的发生，但是怀孕时可以见到EM的退化，这种现象与服用雌激素而引起EM的现象矛盾。另一些学者则认为EM的发病可能与机体的体液和细胞免疫功能异常有关，在EM病人血清中子宫内膜抗体阳性，但此学说不能解释正常人群中子宫内膜抗体的检出率[2]。Sampson在1929年提出，具有生活力的内膜经输卵管逆流，能种植于输卵管或子宫直肠陷凹。Halban随后提出良性转移学说，认为远离盆腔的EM可能是经淋巴扩散，在淋巴管及血管中都能证实有子宫内膜细胞，这一学说认为子宫内膜可以象恶性肿瘤一样形成远处转移[3]。由于异位的子宫内膜具有与肿瘤细胞相类似的生物学特性，因此探讨是否在EM中也存在与恶性肿瘤相类似的细胞凋亡的抑制表现，并导致异位内膜细胞的“浸润性和长寿性”，是本实验的研究目的。
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细胞凋亡作为一种生理或病理性细胞消亡方式，普遍存在于生物界，机体通过凋亡消除衰老的细胞并代之以新的细胞，从而维持组织器官中细胞数量的稳定。子宫内膜的周期性增生与脱落就是通过细胞增殖与凋亡的方式来实现的[1]。细胞凋亡和细胞增殖的失衡可能是某些疾病发病的重要原因。Gebel等通过ELISA方法，对16例EM的子宫内膜组织的凋亡细胞进行定量分析，发现EM的细胞凋亡水平明显低于非异位症组。判断细胞凋亡的方法主要有两种，即形态学方法和生化指标[4]。凋亡的形态学指标在光镜下表现为核浓缩，胞浆酸性增强，或碎裂成嗜酸性的含有核质的小块(凋亡小体)。形态学观察有较高的特异性和可靠性，但其敏感性较低。而生化指标的敏感性高，目前最常用的方法是对凋亡早期形成的DNA断端的3′-OH末端进行标记(TUNEL)，此方法的优点是可在原位对凋亡细胞进行检测，既有较高的敏感性，又可了解凋亡细胞与周围组织的关系。虽然已有国外学者通过ELISA的方法对EM研究，但缺点是敏感性和准确性差。通过TUNEL实验，我们发现EM的细胞凋亡水平明显低于正常对照组，这或许可以解释异位的子宫内膜在离开宫腔后仍然可以继续生长的现象，推测EM的异位细胞的生存能力与细胞凋亡受抑制有关。由于细胞凋亡的抑制，异位的子宫内膜可以象恶性肿瘤一样，随血液、淋巴或直接播散到全身其他部位，形成异位病灶。
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细胞凋亡受其相关基因的调控，原位杂交实验结果显示EM中p53基因表达(p53mRNA)水平与正常对照组相比明显降低，并与细胞凋亡水平的降低是同步的。因此，EM内膜中细胞凋亡的抑制很可能与p53基因表达降低有关。是否EM的细胞凋亡仅受p53基因单一因素影响，尚需进一步研究。
参考文献
1，赵卫红，寿好长，阎福岭.细胞凋亡.河南：河南医科大学出版社，1997，32-48.
2，宋兰林，彭伟，刘国炳，等.子宫内膜异位症不孕妇女血清及腹腔液中子宫内膜抗体检测及临床应用.生殖医学杂志，1996，25：145.
3，王淑贞.子宫内膜异位症.实用妇产科学.北京：人民卫生出版社，1995，749-759.
4，Kerr JRF，Wylie AH，Currie AR.Apoptosis：a basic biologic phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetic.Br J Carcer，1992，26：239-241.
(收稿：1999-11-15 修回：2000-03-27), 百拇医药
单位：李红霞(南京市妇幼保健院 210004)；李风山(南京市妇幼保健院 210004)；仓为民(南京市妇幼保健院 210004)；钱宁(南京市妇幼保健院 210004)；冷静(南京医科大学病理学教研室)；姚玉宇(南京医科大学病理学教研室)；彭韬(南京医科大学病理学教研室)
关键词：原位细胞凋亡标记 原位分子杂交 细胞凋亡 子宫内膜异位症
江苏医药001114 【摘要】 目的 从细胞凋亡水平和p53基因表达的差异探讨子宫内膜异位症(EM)的发病机理。方法 38例EM标本行HE染色、原位细胞凋亡标记实验(TUNEL)，p53mRNA的原位分子杂交实验。以正常子宫内膜作正常对照，经Dnase处理的子宫内膜为阳性对照，设空白阴性对照。结果 TUNEL实验结果，正常分泌期子宫内膜中细胞凋亡率为24.29%，EM的细胞凋亡率为3.64%。p53在EM的表达为7.43%，而正常对照组为28.51%，差异有显著性(P<0.05)。结论 EM的细胞凋亡水平和p53的表达水平明显低于正常对照组。EM的发病可能与子宫内膜的细胞凋亡水平降低有关。
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A study of the relationship between endometriosis and apoptosis
LI Hongxia，LENG Jing，YAO Yuyu，et al.
(Nanjing Maternity and Child Health Hospital，Nanjing, 210004)
【Abstract】 Objective To study the pathogenesis of EM by detecting the cell apoptosis and the p53 gene expression of EM.Methods Morphological changes of 38 specimens of EM were examined by HE dying，while cell apoptosis and apoptotic associated gene expression of p53 in EM were studied by TUNEL and in situ hybridization respectively.Controls were set by normal endometrium，the sample treated by Dnase，and negative.Results The rate of apoptosis cells in normal endometrium is 24.29% and in EM is 3.64%.The expression of p53 gene in tissues of EM is 7.47 per 100 cells and in normal endometrium 28.51.The difference is marked(P<0.05).Conclusion The cell apoptosis and p53 gene expression level of EM are lower than normal endometrium.There may be a relationship between the low level cell apoptosis and pathogenesis of EM.
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【Key words】 TUNEL In situ hybridization Apoptosis Endometriosis(EM)
用原位标记凋亡细胞实验和原位分子杂交实验对EM标本进行检测，观察EM内膜细胞凋亡的水平和p53基因的表达，从细胞凋亡的角度探讨EM的发病机理。
材料和方法
一、标本
38例新鲜EM标本取自南京市妇幼保健院1998年～1999年确诊EM病人。标本经中性福尔马林固定。患者平均年龄38岁(25～47岁)。取10例正常分泌期子宫内膜标本作处理。
二、试剂及方法
1.主要试剂：In Situ cell Death Detection Kit和DIG High Prime DNA labeling and detection Kit为宝灵曼公司产品；p53cDNA裸探针，1.8kb为北京中山公司产品。
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2.方法：石蜡切片分别进行HE染色、细胞凋亡原位标记和原位杂交试验，观察异位子宫内膜的细胞凋亡水平及凋亡相关基因的表达水平。
(1)细胞凋亡原位标记实验：采用末端转移酶(TdT)介导的dUTP的DNA缺口3′-OH端标记法TUNEL检测上述标本。主要步骤如下：石蜡切片经过0.3%过氧化氢处理、蛋白酶K 37℃10分钟。Dnase处理阳性对照片37℃10分钟。标记：TdT与标记缓冲液的比例为1∶39，37℃孵育1小时。阴性对照只加标记缓冲液，不加TdT酶。POD酶联抗体(1∶1000稀释)作用37℃30分钟。DAB显色。
(2)p53原位杂交：p53探针的标记采用试剂盒提供的方法，以随机引物法，用地高辛(Dig)标记的dUTP标记p53cDNA，标记后定量鉴定。
原位杂交的主要步骤为：石蜡切片经4%多聚甲醛后固定20分钟，加入预杂交液进行预杂交42℃3小时，加入含变性p53探针的杂交液50μl，42℃杂交20小时，加入抗Dig的碱性磷酸酶酶联抗体，37℃作用30分钟。最后以NBT/BCIP显色液显色。阴性对照不加探针，阳性对照为p53阳性表达的鼻咽癌组织。所有试剂及物品经Dnase灭活处理。
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(3)光镜检查：EM常规病理组织学检查；TUNEL实验阳性标记细胞的百分率：记数5个高倍视野EM组织中细胞总数和凋亡阳性标记的细胞数，计算百分率；观察原位杂交实验p53mRNA的表达水平和定位，同上计算百分率。
(4)统计学处理：统计变量采用均数±标准差。
结 果
光镜下病理形态特征：HE染色的切片中，EM囊肿病灶标本见子宫内膜组织结构，可见子宫内膜上皮及间质。陈旧性病灶则可见玻璃样变。部分EM组织细胞可见细胞固缩、胞浆深染，核浓缩、碎裂，呈典型的凋亡小体，为凋亡细胞的形态特征，凋亡细胞周围无炎症反应。TUNEL实验：EM组织阳性标记的细胞占总细胞数的3.64%，正常子宫内膜的阳性标记的细胞为24.29%。差异有显著性(P<0.05)。EM组织中的细胞凋亡水平明显低于正常子宫内膜。
原位杂交实验：EM组织中p53mRNA的表达率为7.43%，而正常子宫内膜组为28.51%。
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讨 论
正常的子宫内膜呈周期性增生和脱落，由于受细胞凋亡的调控作用，脱落的内膜碎片，不再具有增殖能力而停止继续生长，从而维持组织器官的正常结构和功能[1]。EM的发病机理迄今不明，半个世纪以来，人们围绕EM的组织发生学进行了广泛的探索，提出许多推论与学说，到目前为止还没有一种学说能圆满解释EM的发病机理。雌激素水平增高可以促进本病的发生，但是怀孕时可以见到EM的退化，这种现象与服用雌激素而引起EM的现象矛盾。另一些学者则认为EM的发病可能与机体的体液和细胞免疫功能异常有关，在EM病人血清中子宫内膜抗体阳性，但此学说不能解释正常人群中子宫内膜抗体的检出率[2]。Sampson在1929年提出，具有生活力的内膜经输卵管逆流，能种植于输卵管或子宫直肠陷凹。Halban随后提出良性转移学说，认为远离盆腔的EM可能是经淋巴扩散，在淋巴管及血管中都能证实有子宫内膜细胞，这一学说认为子宫内膜可以象恶性肿瘤一样形成远处转移[3]。由于异位的子宫内膜具有与肿瘤细胞相类似的生物学特性，因此探讨是否在EM中也存在与恶性肿瘤相类似的细胞凋亡的抑制表现，并导致异位内膜细胞的“浸润性和长寿性”，是本实验的研究目的。
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细胞凋亡作为一种生理或病理性细胞消亡方式，普遍存在于生物界，机体通过凋亡消除衰老的细胞并代之以新的细胞，从而维持组织器官中细胞数量的稳定。子宫内膜的周期性增生与脱落就是通过细胞增殖与凋亡的方式来实现的[1]。细胞凋亡和细胞增殖的失衡可能是某些疾病发病的重要原因。Gebel等通过ELISA方法，对16例EM的子宫内膜组织的凋亡细胞进行定量分析，发现EM的细胞凋亡水平明显低于非异位症组。判断细胞凋亡的方法主要有两种，即形态学方法和生化指标[4]。凋亡的形态学指标在光镜下表现为核浓缩，胞浆酸性增强，或碎裂成嗜酸性的含有核质的小块(凋亡小体)。形态学观察有较高的特异性和可靠性，但其敏感性较低。而生化指标的敏感性高，目前最常用的方法是对凋亡早期形成的DNA断端的3′-OH末端进行标记(TUNEL)，此方法的优点是可在原位对凋亡细胞进行检测，既有较高的敏感性，又可了解凋亡细胞与周围组织的关系。虽然已有国外学者通过ELISA的方法对EM研究，但缺点是敏感性和准确性差。通过TUNEL实验，我们发现EM的细胞凋亡水平明显低于正常对照组，这或许可以解释异位的子宫内膜在离开宫腔后仍然可以继续生长的现象，推测EM的异位细胞的生存能力与细胞凋亡受抑制有关。由于细胞凋亡的抑制，异位的子宫内膜可以象恶性肿瘤一样，随血液、淋巴或直接播散到全身其他部位，形成异位病灶。
, http://www.100md.com
细胞凋亡受其相关基因的调控，原位杂交实验结果显示EM中p53基因表达(p53mRNA)水平与正常对照组相比明显降低，并与细胞凋亡水平的降低是同步的。因此，EM内膜中细胞凋亡的抑制很可能与p53基因表达降低有关。是否EM的细胞凋亡仅受p53基因单一因素影响，尚需进一步研究。
参考文献
1，赵卫红，寿好长，阎福岭.细胞凋亡.河南：河南医科大学出版社，1997，32-48.
2，宋兰林，彭伟，刘国炳，等.子宫内膜异位症不孕妇女血清及腹腔液中子宫内膜抗体检测及临床应用.生殖医学杂志，1996，25：145.
3，王淑贞.子宫内膜异位症.实用妇产科学.北京：人民卫生出版社，1995，749-759.
4，Kerr JRF，Wylie AH，Currie AR.Apoptosis：a basic biologic phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetic.Br J Carcer，1992，26：239-241.
(收稿：1999-11-15 修回：2000-03-27), 百拇医药