应用PCR-RFLP方法进行载脂蛋白E基因分型的研究
作者：李芳芳
单位：广东省深圳市人民医院检验科 518001
关键词：载脂蛋白；基因型；多聚酶链反应-限制性片段长度多态；性
中国现代医学杂志001119 目的：对134例患者随机进行载脂蛋白E (ApoE)基因分型分析初探。方法：应用PCR-RFLP技术用特异性探针对氨基酸112和158多形 基因区基因组的DNA扩增，产物用Hhal进行酶切后，聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳和银染进行结 果分析。结果：经聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳和银染的ApoE片段：E2/E2为91，81和38bp ，E 3/E3为91，48，38和33bp。E2/E3为91，81，48，38和33bp，E3/E4为91，7 2，48，38和33bp。134例其ApoE分布频率分别是：E2/E2 1%，E3/E354%，E2/E 339% ，E3/E43%，E4/E4和E2/E4均为0。结论：应用PCR-RFLP方法进行ApoE 基因分型是一种简便 、可靠、快速的方法。
, http://www.100md.com
分类号 R446.11+2
载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)作为ApoE受体和低密度脂蛋白受体配基，在代谢中起重 要作用。ApoE基因位于第19号染色体上， 与AoCI，CⅡ紧密连锁[1]。1980年Utermann[2]首次报道血清经超速离 心 后，密度<1.006kg/L的部分用等电聚焦电泳分离，发现ApoE存在3种异构体，即E2，E3 和E4。用等电聚焦电泳分析ApoE和异构体，首先要通过超速离心，将极低密度脂蛋 白分离，然后再作等电聚焦电泳分析。此方法用血量多，超速离心时间长，费用高，判断结 果也不清楚。1990年Hixson等[3]发现，ApoE 3种异构体E2，E3和 E4分别由ApoE 3个等位基因所决定。对ApoE分型从PCR-RFLP方法为主，以聚丙烯酰 胺凝胶电泳，银染分析结果。现将我们的分析结果报告如下
, 百拇医药
1 资料和方法1.1 资料
1999年期间在我院神经内科住院的患者随机抽样，年龄24～81岁，其中男性89例，女性45例 。
1.2 方法
1.2.1 样品采集及处理 取50μl全血或抗凝血到0.5ml管中，加溶血剂裂 解 红细胞后，13?000r/min离心2min，再用溶血剂洗2遍，加40μl样品提取液，混匀，100℃ 煮10 min，13?000r/min离心5min，取上清2μl进行PCR反应；加40μl样品提取液到阳性模板管 中，100℃煮10min，13?000r/min离心5min，取上清2μl作PCR阳性对照。
1.2.2 PCR扩增 取主反应管1支，先加18μl反应缓冲液，再加提取的样 品或阳性模板2μl，离心数秒后，按下列条件扩增：95℃变性5min然后95℃，30s；65℃， 30 s；70℃，1min循环35次，最后70℃保温5min;从扩增管中取5μl管产物到一新的0.5ml管中 ，再 加内切酶1μl，混匀后离心数秒。置37℃酶切2h。然后每管加6μl上样缓冲液，混匀，室 温10min后全部用于上样。
, http://www.100md.com
1.2.3 电泳和银染 (详情请见实验操作说明书，试剂由珠海黑马生物公 司提供)。电泳结果见图1。将电泳结果与附表对照，做出分型结果。
图1 不同基因片段电泳分离结果
2 结果
在134例中ApoE基因型分别是：E2/E2 2例占1%；E3/E3 72例占54%；E2/E3 52 例占39%；E3/E4 4例占3%。其电泳检测图谱见图2。
图2 经电泳分离后不同ApoE基因片段
, 百拇医药 3 讨论
ApoE基因位于第19号染色体上，全长为3.7Kb，它的遗传多态性主要由位于同一基因位 点上的3个 等位基因(E2，E3和E4)所控制，分别编码 血浆中3种异构体，构成6种不同的基因型：3种纯合子(E2/E2、E3/E3、E4/E4) ，3种杂合子(E2/E3，E2/E4和E 3/E4)。血浆表现以等显型形式遗传为E2/E2，E3/E3，E4/E4，E2/E3 和E3/E4。
, http://www.100md.com
ApoE多态性的分子基础是112位点上半胱氨酸TGC(Cys)和158位点上精氨酸CGC(Arg)的互换 ，其DNA序列分别是TGC(Cys)和CGC(Arg)，ApoE2均为Cys{(G)TGC}。而ApoE3112位是C ys(G)，158位是Arg[(G)CGC]，ApoE4中二点为Arg[(G)CGC]。由于限制性内切酶Hhal 特异性地识别GCGC序列，故Hhal酶可以识别Arg位点DNA序列(前面也有一个G)，而不能识别C ys位点DNA序列(前面也有一个G)，ApoE 基因PCR-RFLP原理为用特异性引物扩增，包括2位 点DNA序列，扩增物(246bp)进一步用Hhal酶切，由于E2，E3和E4的2位点GCGC(Cys)- GTGC(Arg)差异，产生不同的限制性片断长度多态性E2，E3和E4，并分别产生如图所 示片段，由此产生6种不同的电泳图谱。
, http://www.100md.com
我们所随机检测134例，其中以E3/E3最高占72%，其次是E2/E3占39%因此用本方法 来测定ApoE基因型可成早期诊断人类动脉粥样硬化和冠状动脉疾病的主要指标。同时对研究 人 的ApoE基因以及 ApoE基因型在脂肪代谢中的作用与疾病的关系提供了一个有效的手段。是 目前最简单、可靠、快速方法之一。
参 考 文 献
1，刘华欣，付桂莲，付松滨，等.载脂蛋白E基因多态性与冠心病、脑血栓疾病的 相关性探讨.中国现代学杂志，1999；6(9)：1～2
2，Uterman G,Kinderman L,Stenmetz A,et al.Apolipoprotein E phenotypes and hyperlipdenmia.Hum Genet,1984；65:232～236
3，Hixson JE,Vernier DT.Restriction isotyping of human apolipoprotein E b y geneamplification and cleavage with HhaI.J Lip Res，1990；3:545～548
(2000-07-29收稿), 百拇医药
单位：广东省深圳市人民医院检验科 518001
关键词：载脂蛋白；基因型；多聚酶链反应-限制性片段长度多态；性
中国现代医学杂志001119 目的：对134例患者随机进行载脂蛋白E (ApoE)基因分型分析初探。方法：应用PCR-RFLP技术用特异性探针对氨基酸112和158多形 基因区基因组的DNA扩增，产物用Hhal进行酶切后，聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳和银染进行结 果分析。结果：经聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳和银染的ApoE片段：E2/E2为91，81和38bp ，E 3/E3为91，48，38和33bp。E2/E3为91，81，48，38和33bp，E3/E4为91，7 2，48，38和33bp。134例其ApoE分布频率分别是：E2/E2 1%，E3/E354%，E2/E 339% ，E3/E43%，E4/E4和E2/E4均为0。结论：应用PCR-RFLP方法进行ApoE 基因分型是一种简便 、可靠、快速的方法。
, http://www.100md.com
分类号 R446.11+2
载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)作为ApoE受体和低密度脂蛋白受体配基，在代谢中起重 要作用。ApoE基因位于第19号染色体上， 与AoCI，CⅡ紧密连锁[1]。1980年Utermann[2]首次报道血清经超速离 心 后，密度<1.006kg/L的部分用等电聚焦电泳分离，发现ApoE存在3种异构体，即E2，E3 和E4。用等电聚焦电泳分析ApoE和异构体，首先要通过超速离心，将极低密度脂蛋 白分离，然后再作等电聚焦电泳分析。此方法用血量多，超速离心时间长，费用高，判断结 果也不清楚。1990年Hixson等[3]发现，ApoE 3种异构体E2，E3和 E4分别由ApoE 3个等位基因所决定。对ApoE分型从PCR-RFLP方法为主，以聚丙烯酰 胺凝胶电泳，银染分析结果。现将我们的分析结果报告如下
, 百拇医药
1 资料和方法1.1 资料
1999年期间在我院神经内科住院的患者随机抽样，年龄24～81岁，其中男性89例，女性45例 。
1.2 方法
1.2.1 样品采集及处理 取50μl全血或抗凝血到0.5ml管中，加溶血剂裂 解 红细胞后，13?000r/min离心2min，再用溶血剂洗2遍，加40μl样品提取液，混匀，100℃ 煮10 min，13?000r/min离心5min，取上清2μl进行PCR反应；加40μl样品提取液到阳性模板管 中，100℃煮10min，13?000r/min离心5min，取上清2μl作PCR阳性对照。
1.2.2 PCR扩增 取主反应管1支，先加18μl反应缓冲液，再加提取的样 品或阳性模板2μl，离心数秒后，按下列条件扩增：95℃变性5min然后95℃，30s；65℃， 30 s；70℃，1min循环35次，最后70℃保温5min;从扩增管中取5μl管产物到一新的0.5ml管中 ，再 加内切酶1μl，混匀后离心数秒。置37℃酶切2h。然后每管加6μl上样缓冲液，混匀，室 温10min后全部用于上样。
, http://www.100md.com
1.2.3 电泳和银染 (详情请见实验操作说明书，试剂由珠海黑马生物公 司提供)。电泳结果见图1。将电泳结果与附表对照，做出分型结果。
图1 不同基因片段电泳分离结果
2 结果
在134例中ApoE基因型分别是：E2/E2 2例占1%；E3/E3 72例占54%；E2/E3 52 例占39%；E3/E4 4例占3%。其电泳检测图谱见图2。
图2 经电泳分离后不同ApoE基因片段
, 百拇医药 3 讨论
ApoE基因位于第19号染色体上，全长为3.7Kb，它的遗传多态性主要由位于同一基因位 点上的3个 等位基因(E2，E3和E4)所控制，分别编码 血浆中3种异构体，构成6种不同的基因型：3种纯合子(E2/E2、E3/E3、E4/E4) ，3种杂合子(E2/E3，E2/E4和E 3/E4)。血浆表现以等显型形式遗传为E2/E2，E3/E3，E4/E4，E2/E3 和E3/E4。
, http://www.100md.com
ApoE多态性的分子基础是112位点上半胱氨酸TGC(Cys)和158位点上精氨酸CGC(Arg)的互换 ，其DNA序列分别是TGC(Cys)和CGC(Arg)，ApoE2均为Cys{(G)TGC}。而ApoE3112位是C ys(G)，158位是Arg[(G)CGC]，ApoE4中二点为Arg[(G)CGC]。由于限制性内切酶Hhal 特异性地识别GCGC序列，故Hhal酶可以识别Arg位点DNA序列(前面也有一个G)，而不能识别C ys位点DNA序列(前面也有一个G)，ApoE 基因PCR-RFLP原理为用特异性引物扩增，包括2位 点DNA序列，扩增物(246bp)进一步用Hhal酶切，由于E2，E3和E4的2位点GCGC(Cys)- GTGC(Arg)差异，产生不同的限制性片断长度多态性E2，E3和E4，并分别产生如图所 示片段，由此产生6种不同的电泳图谱。
, http://www.100md.com
我们所随机检测134例，其中以E3/E3最高占72%，其次是E2/E3占39%因此用本方法 来测定ApoE基因型可成早期诊断人类动脉粥样硬化和冠状动脉疾病的主要指标。同时对研究 人 的ApoE基因以及 ApoE基因型在脂肪代谢中的作用与疾病的关系提供了一个有效的手段。是 目前最简单、可靠、快速方法之一。
参 考 文 献
1，刘华欣，付桂莲，付松滨，等.载脂蛋白E基因多态性与冠心病、脑血栓疾病的 相关性探讨.中国现代学杂志，1999；6(9)：1～2
2，Uterman G,Kinderman L,Stenmetz A,et al.Apolipoprotein E phenotypes and hyperlipdenmia.Hum Genet,1984；65:232～236
3，Hixson JE,Vernier DT.Restriction isotyping of human apolipoprotein E b y geneamplification and cleavage with HhaI.J Lip Res，1990；3:545～548
(2000-07-29收稿), 百拇医药