癌性胸水肿瘤浸润淋巴细胞的生物学特性研究
作者：蒋敬庭 吴昌平 邓海峰 吴爱珍 陈国瑾 孙文辉 邱国强 周建军
单位：苏州医学院附属第三医院肿瘤生物诊疗中心 常州 213003
关键词：胸腔积液；恶性；淋巴细胞；肿瘤浸润；增殖力；表型分析；杀伤细胞活性
中国现代医学杂志001118 目的：探讨癌性胸水肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的生物学特性，以便更 好 地应用于临床。方法：用低浓度白细胞介素2(IL-2)诱导培养癌性胸水TIL，按常规法计数TI L细胞增殖量，采用流式细胞仪分析TIL细胞表型及MTT法检测其杀伤细胞活性。结果：经 低 浓度IL-2(100IU/ml)诱导培养TIL 21d后：TIL增殖倍数为2?130±1?140，大于1?000倍 占 72%。CD3无显著性变化(P>0.05)，CD4、CD8有显著性差异(P<0.01)，而C D4/CD8 比值高达3.53±0.82，并且在21d时TIL具有较高的细胞毒性。结论：癌性胸水TIL体外诱导 培养3周时TIL具有较强的生物活性，此时进行胸水治疗可取得可靠的疗效。
, http://www.100md.com
分类号 R561
本室曾采用肿瘤浸润淋巴细胞(Tumour Infiltrating Lymphocytes,TI L)临床治疗癌性胸水取得了满意的疗效[1，2]。作者对36例肿瘤患者胸水TIL细 胞的增殖力、表型和杀伤细胞活性等作了进一步的系统研究，以更加掌握癌性胸水TIL细胞 生物学特性，旨在更好地选择最佳生物活性的TIL用于癌性胸水的临床治疗。
1 资料与方法1.1 病例
36例癌性胸水患者，男22例，女14例。年龄51～81岁，中位年龄67岁。肺癌伴胸膜转移22例 ，乳腺癌术后胸膜转移9例，贲门癌术后胸膜转移5例。36例均经病理学和(或)细胞学诊断为 癌性胸水，胸水量为中等量以上，由X线胸片及胸部B超观察胸水量的改变，均未接受癌性胸 水的其他常规治疗。原发癌治疗采用常规对症化疗处理。
, 百拇医药 1.2 实验材料和方法
1.2.1 材料 RPMI 1640(美国GIBCO)，细胞表型CD3、CD4、CD8分析 采用荧光 素标记的鼠抗人单克隆抗体试剂，用FACSCalibur型流式细胞仪测定(美国BD公司)，淋巴细 胞分离液(上海试剂二厂)，白细胞介素-2(IL-2，北京四环生物工程制品厂)，四甲基偶氮唑 盐(MTT)和十二烷基磺酸钠(SDS，华美生物工程公司)。
1.2.2 诱导方法 常规无菌采集每位患者癌性胸水500～1?000ml，肝素抗 凝(10IU/ml),用不连续密度法分离得到TIL细胞和肿瘤细胞，用含低浓度白细胞介素-2(10IU / ml)完全培养液调整TIL细胞浓度1.0×106/ml置6孔板中，在37℃，5%CO2条件下培 养，每隔48h加入倍量培养液扩增。
, 百拇医药 1.2.3 胸水TIL增殖力测定 按常规法每96小时计数TIL细胞增殖量。
1.2.4 胸水TIL细胞表型分析[3] 取培养于不同时期的胸水TIL 10 0μl，加入荧光抗体标记单抗20μl，混匀放置4℃30min，取出加溶血素3ml，混匀，放置5 min，1?200r/min，5min去掉液体加入0.5ml PBS溶液，混匀用FACS进行检测分析。
1.2.5 胸水TIL细胞毒活性测定 采用MTT比色法测定TIL细胞对自身肿瘤细 胞作为靶细胞的杀伤活性，郊靶比20∶1。计算TIL细胞活性，公式如下。
TIL细胞活性=(1-(实验组A值-效应细胞对照组A值)/(靶细胞对照组A值))×100%
1.3 统计处理
各组间采用方差分析及t检验。
, 百拇医药
2 结果2.1 癌性胸水TIL增殖力
采用常规法每96小时计数TIL细胞增殖量，根据不同情况加入适量的完全培养液，使细胞密 度维 持在2×106/ml。从36例癌性胸水中分离获得TIL数为4.0×105～10.5×1 06，经体外培养21d时细胞数量至5.7×108～2.4×109。增殖倍数大于 1?000倍以上有26例，占72%，平均增殖倍数2?130±1?140。其中22例肺癌伴胸膜转移 的癌性 胸水TIL扩增倍数明显大于5例贲门癌术后胸膜转移的癌性胸水TIL扩增倍数(P<0.05)， 其原因有待进一步探讨。
2.2 TIL表型分析
用FACS检测36例转移性胸水经体外诱导培养14,21,28d的T淋巴细胞表型，CD3经3次检测无 显 著性变化(P>0.05)，CD4、CD8 3次检测有显著性差异(P<0.01)，而CD4/C D8比值21d时为最高，结果见表1。
, 百拇医药
表1 36例转移性胸水T淋巴细胞表型与体外诱导时间的关系 (%)
培养时间(d)
CD3
CD4
CD8
CD4/CD8
14
91.37±5.53
41.71±3.75
23.15±2.86
, 百拇医药 1.41±0.53
21
93.55±4.781)
61.35±7.052)
16.92±3.772)
3.53 ±0.823)
28
92.53±6.34
51.25±5.13
21.66±3.12
2.18±0.78
, 百拇医药
注：1)t检验，同一表型比较P>0.05
2)t检验，同一表型比较P<0.01
3)t检验，同一表型比较P<0.05
2.3 胸水TIL杀伤细胞活性分析
杀伤细胞活性与肿瘤的发生、发展及转移呈负相关，是判断机体抗肿瘤水平和促使恶性胸腔 积液的吸收标志之一。三种不同病因引起的胸腔积液中的TIL细胞对自身肿瘤细胞杀伤 活性在21d时具有较高细胞毒性(均P<0.05)，结果见表2。
表2 TIL在不同时间对自身肿瘤细胞的杀伤活性变化 (%) 组别
例数
[(〗
, 百拇医药
时间(d)
7
14
21
28[)〗
肺癌伴胸膜转移
22
21.55±5.71
40.25±11.93
66.75±14.31
43.51±13.70
乳腺癌术后胸膜转移
, http://www.100md.com
9
19.61±4.35
38.54±10.11
62.55±12.67
40 .54±11.33
贲门癌术后胸膜转移
5
17.45±5.10
29.32±38.71
58.52±10.23
31 .69±9.25
, http://www.100md.com
注：t检验，同一疾病比较P<0.05
3 讨论
癌性胸水是某些晚期恶性肿瘤首发的临床表现，常规治疗常采取全身化疗、非抗癌硬化剂 、 胸腔内注射抗癌药物或单纯胸腔抽液等，但疗效较差。而癌性胸水中的淋巴细胞是一种特殊 形式的TIL细胞[4]，TIL抗肿瘤效果是LAK 50～100倍[5]，它能充分识 别 肿瘤细胞后杀伤肿瘤细胞，采用此法治疗癌性胸水的疗效已被临床证实[1，2]， 癌性胸水TIL细胞增殖力、表型及杀伤细胞活性与疗效有较强的相关性。因此对其生物学特 性的进一步研究将更加有助于临床的应用。
本室采用低浓度IL-2培养癌性胸水TIL细胞可获得较好的杀伤特异性，而高浓度IL -2培养可能更容易激活非特异性细胞毒细胞。检测经体外培养3周时癌性胸水TIL扩增后，72 %的TIL扩增1?000倍以上，而对自身肿瘤细胞的杀伤活性也增强(见表2)。同时CD4、CD 8细 胞表型与培养时间有显著的相关性，CD4/CD8比值于21d时达最高值，而CD4、CD8抗 原高表达 也是淋巴细胞功能活动增强的一个指征。因此，癌性胸水TIL 21～28d时比值明显增高， 此阶段是临床应用的最佳时间选择。自体胸水TIL的临床应用给癌症患者胸腔积液的治疗带 来了新的希望，且胸水TIL来源丰富，方法简便易行，无毒副作用，一般在3周时应用TIL治 疗癌性胸水可取得可靠的疗效。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，蒋敬庭，吴昌平，陈雪勤，等.肿瘤浸润淋巴细胞治疗老年人恶性胸水的疗效. 中华老年医学杂志，1999；18(1)：35
2，蒋敬庭，吴昌平，吴爱珍，等.TIL治疗癌性胸水的疗效观察.中国肿瘤临床杂志 ，1999；26(3)：226
3，蒋敬庭，吴时平，陈雪勤，等.癌性胸水肿瘤浸润淋巴细胞表型分析.上海医学检 验杂志，1999；14(3)：153
4，Rosenberg SA.The immunotheraphy and gene therapy of caner.J Clin Oncol ,1992;10:180～182
5，Rosenberg SA,et al.A new aprroach to the adoptive immunotheraphy of ca ncer with tumour infiltrating lymphocytes.Science,1986;233:1318
(2000-04-18收稿), 百拇医药
单位：苏州医学院附属第三医院肿瘤生物诊疗中心 常州 213003
关键词：胸腔积液；恶性；淋巴细胞；肿瘤浸润；增殖力；表型分析；杀伤细胞活性
中国现代医学杂志001118 目的：探讨癌性胸水肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的生物学特性，以便更 好 地应用于临床。方法：用低浓度白细胞介素2(IL-2)诱导培养癌性胸水TIL，按常规法计数TI L细胞增殖量，采用流式细胞仪分析TIL细胞表型及MTT法检测其杀伤细胞活性。结果：经 低 浓度IL-2(100IU/ml)诱导培养TIL 21d后：TIL增殖倍数为2?130±1?140，大于1?000倍 占 72%。CD3无显著性变化(P>0.05)，CD4、CD8有显著性差异(P<0.01)，而C D4/CD8 比值高达3.53±0.82，并且在21d时TIL具有较高的细胞毒性。结论：癌性胸水TIL体外诱导 培养3周时TIL具有较强的生物活性，此时进行胸水治疗可取得可靠的疗效。
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分类号 R561
本室曾采用肿瘤浸润淋巴细胞(Tumour Infiltrating Lymphocytes,TI L)临床治疗癌性胸水取得了满意的疗效[1，2]。作者对36例肿瘤患者胸水TIL细 胞的增殖力、表型和杀伤细胞活性等作了进一步的系统研究，以更加掌握癌性胸水TIL细胞 生物学特性，旨在更好地选择最佳生物活性的TIL用于癌性胸水的临床治疗。
1 资料与方法1.1 病例
36例癌性胸水患者，男22例，女14例。年龄51～81岁，中位年龄67岁。肺癌伴胸膜转移22例 ，乳腺癌术后胸膜转移9例，贲门癌术后胸膜转移5例。36例均经病理学和(或)细胞学诊断为 癌性胸水，胸水量为中等量以上，由X线胸片及胸部B超观察胸水量的改变，均未接受癌性胸 水的其他常规治疗。原发癌治疗采用常规对症化疗处理。
, 百拇医药 1.2 实验材料和方法
1.2.1 材料 RPMI 1640(美国GIBCO)，细胞表型CD3、CD4、CD8分析 采用荧光 素标记的鼠抗人单克隆抗体试剂，用FACSCalibur型流式细胞仪测定(美国BD公司)，淋巴细 胞分离液(上海试剂二厂)，白细胞介素-2(IL-2，北京四环生物工程制品厂)，四甲基偶氮唑 盐(MTT)和十二烷基磺酸钠(SDS，华美生物工程公司)。
1.2.2 诱导方法 常规无菌采集每位患者癌性胸水500～1?000ml，肝素抗 凝(10IU/ml),用不连续密度法分离得到TIL细胞和肿瘤细胞，用含低浓度白细胞介素-2(10IU / ml)完全培养液调整TIL细胞浓度1.0×106/ml置6孔板中，在37℃，5%CO2条件下培 养，每隔48h加入倍量培养液扩增。
, 百拇医药 1.2.3 胸水TIL增殖力测定 按常规法每96小时计数TIL细胞增殖量。
1.2.4 胸水TIL细胞表型分析[3] 取培养于不同时期的胸水TIL 10 0μl，加入荧光抗体标记单抗20μl，混匀放置4℃30min，取出加溶血素3ml，混匀，放置5 min，1?200r/min，5min去掉液体加入0.5ml PBS溶液，混匀用FACS进行检测分析。
1.2.5 胸水TIL细胞毒活性测定 采用MTT比色法测定TIL细胞对自身肿瘤细 胞作为靶细胞的杀伤活性，郊靶比20∶1。计算TIL细胞活性，公式如下。
TIL细胞活性=(1-(实验组A值-效应细胞对照组A值)/(靶细胞对照组A值))×100%
1.3 统计处理
各组间采用方差分析及t检验。
, 百拇医药
2 结果2.1 癌性胸水TIL增殖力
采用常规法每96小时计数TIL细胞增殖量，根据不同情况加入适量的完全培养液，使细胞密 度维 持在2×106/ml。从36例癌性胸水中分离获得TIL数为4.0×105～10.5×1 06，经体外培养21d时细胞数量至5.7×108～2.4×109。增殖倍数大于 1?000倍以上有26例，占72%，平均增殖倍数2?130±1?140。其中22例肺癌伴胸膜转移 的癌性 胸水TIL扩增倍数明显大于5例贲门癌术后胸膜转移的癌性胸水TIL扩增倍数(P<0.05)， 其原因有待进一步探讨。
2.2 TIL表型分析
用FACS检测36例转移性胸水经体外诱导培养14,21,28d的T淋巴细胞表型，CD3经3次检测无 显 著性变化(P>0.05)，CD4、CD8 3次检测有显著性差异(P<0.01)，而CD4/C D8比值21d时为最高，结果见表1。
, 百拇医药
表1 36例转移性胸水T淋巴细胞表型与体外诱导时间的关系 (%)
培养时间(d)
CD3
CD4
CD8
CD4/CD8
14
91.37±5.53
41.71±3.75
23.15±2.86
, 百拇医药 1.41±0.53
21
93.55±4.781)
61.35±7.052)
16.92±3.772)
3.53 ±0.823)
28
92.53±6.34
51.25±5.13
21.66±3.12
2.18±0.78
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注：1)t检验，同一表型比较P>0.05
2)t检验，同一表型比较P<0.01
3)t检验，同一表型比较P<0.05
2.3 胸水TIL杀伤细胞活性分析
杀伤细胞活性与肿瘤的发生、发展及转移呈负相关，是判断机体抗肿瘤水平和促使恶性胸腔 积液的吸收标志之一。三种不同病因引起的胸腔积液中的TIL细胞对自身肿瘤细胞杀伤 活性在21d时具有较高细胞毒性(均P<0.05)，结果见表2。
表2 TIL在不同时间对自身肿瘤细胞的杀伤活性变化 (%) 组别
例数
[(〗
, 百拇医药
时间(d)
7
14
21
28[)〗
肺癌伴胸膜转移
22
21.55±5.71
40.25±11.93
66.75±14.31
43.51±13.70
乳腺癌术后胸膜转移
, http://www.100md.com
9
19.61±4.35
38.54±10.11
62.55±12.67
40 .54±11.33
贲门癌术后胸膜转移
5
17.45±5.10
29.32±38.71
58.52±10.23
31 .69±9.25
, http://www.100md.com
注：t检验，同一疾病比较P<0.05
3 讨论
癌性胸水是某些晚期恶性肿瘤首发的临床表现，常规治疗常采取全身化疗、非抗癌硬化剂 、 胸腔内注射抗癌药物或单纯胸腔抽液等，但疗效较差。而癌性胸水中的淋巴细胞是一种特殊 形式的TIL细胞[4]，TIL抗肿瘤效果是LAK 50～100倍[5]，它能充分识 别 肿瘤细胞后杀伤肿瘤细胞，采用此法治疗癌性胸水的疗效已被临床证实[1，2]， 癌性胸水TIL细胞增殖力、表型及杀伤细胞活性与疗效有较强的相关性。因此对其生物学特 性的进一步研究将更加有助于临床的应用。
本室采用低浓度IL-2培养癌性胸水TIL细胞可获得较好的杀伤特异性，而高浓度IL -2培养可能更容易激活非特异性细胞毒细胞。检测经体外培养3周时癌性胸水TIL扩增后，72 %的TIL扩增1?000倍以上，而对自身肿瘤细胞的杀伤活性也增强(见表2)。同时CD4、CD 8细 胞表型与培养时间有显著的相关性，CD4/CD8比值于21d时达最高值，而CD4、CD8抗 原高表达 也是淋巴细胞功能活动增强的一个指征。因此，癌性胸水TIL 21～28d时比值明显增高， 此阶段是临床应用的最佳时间选择。自体胸水TIL的临床应用给癌症患者胸腔积液的治疗带 来了新的希望，且胸水TIL来源丰富，方法简便易行，无毒副作用，一般在3周时应用TIL治 疗癌性胸水可取得可靠的疗效。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，蒋敬庭，吴昌平，陈雪勤，等.肿瘤浸润淋巴细胞治疗老年人恶性胸水的疗效. 中华老年医学杂志，1999；18(1)：35
2，蒋敬庭，吴昌平，吴爱珍，等.TIL治疗癌性胸水的疗效观察.中国肿瘤临床杂志 ，1999；26(3)：226
3，蒋敬庭，吴时平，陈雪勤，等.癌性胸水肿瘤浸润淋巴细胞表型分析.上海医学检 验杂志，1999；14(3)：153
4，Rosenberg SA.The immunotheraphy and gene therapy of caner.J Clin Oncol ,1992;10:180～182
5，Rosenberg SA,et al.A new aprroach to the adoptive immunotheraphy of ca ncer with tumour infiltrating lymphocytes.Science,1986;233:1318
(2000-04-18收稿), 百拇医药