人类PU.1 cDNA的克隆及表达产物的生物活性
作者：范春 中村三千男
单位：范春(卫生部肝胆肠外科研究中心 长沙 410008)；中村三千男(日本长崎大学生物化学研究所)
关键词：重叠聚合酶链反应；cDNA；PU.1；生物活性
中国现代医学杂志001107 目的：重叠聚合酶链反应(Overlapping Polymerase Chain Reaction PC R)法是在上下游引物之间设计一对碱基互补的嵌套引物，第一轮PCR分别扩增5’端和3’端 片段，第二轮PCR以第一轮PCR的5’端和3’端片段混和物为模板，用上下游引物扩增出全长 片段。该文用逆转录-Overlapping PCR法快速高效地从前骨髓干细胞中扩增到人类PU.1全长 cD NA为442bp，酶切和测序证实完全与前人报道一致。构建的真核表达质粒pcDNA3.1-hPU.1可 以被特异的抗体识别，体外细胞株转染证实具有特异的激活启动子活性的功能。
, 百拇医药
分类号 R329.2
THE CLONING AND ITS BIOCHEMICAL ACTIVITY OF HUMAN PU.1 cDNA
Fan Chun
(National Hepatobiliary and Enteric Surgical Research Center, Ministry of Health,P.R.China )
Michio Nakamura
(Indtitute of Biochemistry, Nagasaki University, Japan)
Abstract: Overlapping Polymerase Chain Reaction (PCR) is used to amply f ull-leng th cDNA by using a paire of inter-nested primer between upstread and downstread primer. First-round PCR, both 5’-fragement and 3’-fragement were amplified an d S econd-round PCR, full-length cDNA was amplifited basing on the mixture of first- round PCR products, We cloned a human full-length PU.1 cDNA using total mRNA fro m myelomoloblastic cell line PLB985 by this technique, its sequence is completel y consistent with Genebank reported by restrict emzyme mapping and sequencing an alysis. Overexpression of human PU.1 can been recognized by both PU.1-site blind ing consensus sequence and specific antibody, and also trans-activate promoter a ctivity.
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Key words: Overlapping Polymerase Chain Reaction; cDNA; PU.1; DNA Binding Trans-activation
PU.1是转录因了ets(E26 Transformational Specific)家族的成员之 一，它的表达具有细胞和组织特异性，广泛在人类中性粒细胞、单核细胞、B淋巴细胞及造 血干细胞中表达[1]。研究表明，PU.1在调节造血细胞的分裂、分化及生长过 程中起 着至关重要的作用。在PU.1基因缺陷的转基因小鼠表现为B淋巴细胞和巨嗜细胞缺失，发生 原因不明的晚期胚胎致死[2]。
为了得到真核表达的人类PU.1，我们用Overlapping PCR法结合逆转录反应，加上必要的引 物嵌套扩增，得到了所需的全长cDNA，并克隆到真核表达载体pcDNA3.1，经过酶切鉴定、序 列分析和生物活性测定，证明确为所需的人类PU.1，完全可以用于基因的高效表达。
, http://www.100md.com
1 材料与方法1.1 材料
细胞PLB985为前骨髓造血干细胞株，Jurkat为T淋巴细胞株，NIH3T3为成纤维母细胞株，这 些细胞均来自ATCC，用10%小牛血清RPMI 1640培养基培养呈对数生长期。
各种试剂盒及引物HindⅢ，XbaⅠ,EcoRⅠ,KpnⅠ,BamHⅠ，T4 DNA连接酶，CIP均来自Bio-La b公司。逆转录酶，Pfu DNA聚合酶，RNasin来自Promega公司，32P-ddATP及测序试剂 盒为Pharmacia公司产品，使用的引物由Pharmacia公司合成。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取 1×107个对数生长期的PLB985细胞经PBS换洗2 次，Trizl(Life Technologies)提取总RNA，CSC1(25?000r/min 30min 4℃)密度梯度离心 ，沉淀溶入5mM EDTA/β-巯基乙醇溶液中，再经酚：氯仿沉淀，-70℃储存备用。
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1.2.2 逆转录及Overlapping PCR总RNA中加入Oligo(dT)17，RNas in，逆转录酶，于42℃作用1h，然后抽提沉淀，获得cDNA第一链作为Overlapping PCR扩增 模板。
图1
按图1所示，第一轮PCR用引物对(F-Primer/I-RP和R-Primer/I-FP)分别扩增出5’端 和3’端片段，第二轮PCR用上述扩增产物的混合物为模板，以上下引物(F-Primer和R-Prime r)扩增出预期大小的片段，经琼脂糖凝胶电泳，回收DNA片段。
1.2.3 回收DNA片段的克隆及鉴定 将回收纯化的片段经Hind Ⅲ/XbaⅠ内 切酶消化，连接到相同内切酶消化并CIP处理的pBluescript KSⅡ克隆载体上，通过蓝/白斑 筛选出阳性克隆，小量培养及DNA提取，酶切图谱和测序仪(Pharmacia ALF)上序列分析，签 定出人类全长cDNA片段。
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1.2.4 EMSA分析 参照Suzuki[3]方法。收集大约培养成对数生 长期的1×107个PLB985或Jurkat或NIH3T3细胞，经裂解液[10mM Hepes,pH7.9,10mM KCl, 0.1mM EGTA,0.1mM EDTA,1mM DTT,0.5mM phonylmethylsulfonyl fluoride (PMSF.Sigma),2 μ g leupeptin(Sigma)/ml,2μg profini (Sigma)/ml,10μg pepstatin A (Sigma)/ ml,10μg 3.4 dichloroisocoumarin (Boehringer Mannheim)/ml,10μg E-64-d (pe pfide Insitute ,Osaka)/ml]破膜，14?000r/min 4℃ 30min制备细胞核提物。探针(gp 91phox基因启动子-65到-41区段，含PU.1结合序列GAGGAA)用32PddATP经3 ’-末端标 记盒(Life Technologies)标记，竞争寡核苷酸(Competitor)包括未标记的探针，杂合子，P U.1。基本过程是在5μg细胞核提取物中加入300倍超量的竞争寡核苷酸或2.5μg PU.1多 克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)，再加入2×104cmp放射活性的探针，反应15min 后上样到5%非变性聚丙稀酰胺，200V 4℃条件下电泳3h，干燥凝胶，曝光24h，然后在图 像仪(Bio-Rad Imager)上打印出结果。
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1.2.5 短时表达活性分析 将gp91phox启动子的-105到+12区段序列应用PC R扩增并克隆到一个Firefly Luciferase报道质粒PXP2上构建-105WT/pLUC,另外在该质粒的- 52位置应用定向突变PCR(Site-Directed Mutagenesis)技术将C→T构建成点突变的一个报道 质粒-52T/pLUC.。共转染用15μl Liposome 1μg的报道质粒-105WT/pLUC.或-52T/pLU C.,0.5μg pcDNA3.1-hPU.1或0.5μg pcDNA3.1空白质粒为平行对照和10ng Rellina Lucife rase pRL/CMV作内对照，与1.2×105PLB985细胞，8×104 Jurkat细胞，6×10 4 NIH3T3细胞分别共培养24，10和24h后，收获细胞并裂解，分别测定Firefly Lucifer ase和Rellina Luciferase活性，计算Firefly/Rellina相对值，每个样本平行做3个孔，重 复3次，用Mean±SD表示。
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2 结果2.1 Overlapping PCR产物
我们选用人类前骨髓干细胞PLB985株提取总RNA，是因为该细胞表达高丰度的PU.1 mRNA，加 用RNase抑制剂使mRNA不致降解，因此可直接用来制备cDNA模板进行Overlapping PCR。重要 的是我们设计了一套碱基互补的嵌套引物，保证了第一轮PCR扩增出5’端和3’端的片段， 为第二轮PCR扩增出全长cDNA提供了保证。结果见图2。第一轮PCR扩增出5’端和3’端的相 同片段为241bp(1～4道)，第二轮PCR扩增出全长cDNA约为450bp(5～8道)。阴性对照见9道。
2.2 人PU.1 cDNA片段的分子克隆及鉴定
由于我们在P-Primer和R-Primer中分别设计了Hind Ⅲ及Xba Ⅰ内切酶位点，因此很容易将 其定向克隆到pBluescript KSⅡ载体上，经转化到XL-1中后，在培养皿中通过蓝/白斑筛选 ，挑出白色已连接好的质粒，经过酶切电泳图及人PU.1cDNA核苷酸序列分析，获得了与Ge neBank报道的完全一致的全长PU.1cDNA。结果见图2。随后从pBluescript KS Ⅱ-hPU.1载体 上酶切下该片段并克隆到真核表达载体，获得了pcDNA3.1-hPU.1，再次经酶切及序列测定确 认。结果见图3。
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1 tttagctgtc aataatttta cttgtcttta gtgactaatg agggggtggg gaggaagagc
61 tttttaaaaa gcattcaata tacaaaaagg tgccagcgcc agactcccaa ggaagcaccg
121 tggccactaa gccaggctga ccctcggttg aggtccgagg cccaggcggc ccttggagcg
181 ggctaaagtc ctggtgggag gcaaagcggg tggggcgggc caggccgggc atgggagggc
241 gaggccgggc ccccagtcct gcctcggccc tgggaatgtc ctccctgtgt ccgggccggg
, 百拇医药
301 cgacggtta atgctatggc cggcggggtc cangagccct gggtctctgc gggcgatcag
361 tggggcggga ggcgccgctc ggccaggccc ccacggcccc aacacctcgc cgctgaactg
421 gtaggtgagc ttcttcttga cttntcttac ct
图2 人PU.1 cDNA核苷酸序列
图3 A. pcDNA3.1-hPU.1质粒图
B. pcDNA3.1-hPU.1酶切图
, http://www.100md.com 2.3 hPU.1与DNA特异性相结合
目前研究DNA-蛋白质相互作用的特异可靠的方法之一是EMSA(electrophoretic mobility sh ift assay)。图4A结果显示，在PLB985细胞内源性 表达的PU.1和在Jurkat细胞高效表达的h PU.1，能特异性地结合到gp91phox基因的启动子形成一个快速迁移的PU.1复合物，这种结合 能被特异性的PU.1 Competitor所抑制，图4B结果显示，抗PU.1抗体改变了这种DNA-蛋白质 复合物，进一步肯定我们构建的pcDNA3.1-hPU.1可以在真核细胞中表达。
图4A EMSA图
图4B Super Shift EMSA图
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2.4 hPU.1激活了gp91phox基因启动子的活性
为了证实hPU.1结合到这个启动子上是否具有功能活性，我们采用了共同转染的方法将pcDNA 3.1-hPU.1与-105WT/pLUC或-52T/pLUC转染到Jurkat细胞，结果显示，hPU.1极大地激活了启 动子的转录活性，对照空白pcDNA3.1(-)或当pcDNA3.1-hPU.1与-52T/pLUC共同转染时则无这 种转录活性，见图5。这些结果充分证实，hPU.1激活启动因子的转录活性依赖于DNA的特异 结合。当我们用一种磷酸激酶K(PKC)诱导剂TPA诱导时，提高了一倍的转录活性，进一步提 示，磷酸化的hPU.1可提高激活启动子的转录活性。
图5 hPU.1短时表达活性分析 结果
WT，-105WT/pLUC.;，空白pcDNA3.1;PU.1,表达载体pcDNA3.1-hPU.1;TPA
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3 讨论
PU.1是转录因子ets家族的成员之一，与细胞的生长、分裂、分化及肿瘤发生有密切关系 [1]。它的表达具有细胞型和组织型特异性，广泛在人类中性粒细胞、单核细胞、B 淋巴细胞及造血干细胞中表达[2]。它通过DNA-蛋白质或蛋白质形成的复合物，相 互 作用调节着基因表达，这种调节要求转录因子识别特异的DNA结合位点。这一般能识别几个 碱基组成的核心成份(GGAA/T)，PU.1便是通过靶向具有相同的核心序列调节着不同的基因 表达[6]。我们的EMSA结果显示，内源性(PLB985的核提取物)和外源性(短时表达 的Jurkat细胞提取物)的hPU.1能特异地与gp91phox启动子的GGAA序列结合，形成DNA-蛋白质 复合物，这种复合物又被同源的PU.1-结合序列和抗PU.1抗体所破坏，因此我们证实了重组 的hPU.1具有体内特异的DNA结合活性。我们的短时表达分析结果进一步显示，重组的hPU.1 能极大地激活基因的转录活性，这种转录活性可以受到外来因素的调节，从而证实重组的hP U.1具有在体内的生物活性。
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参 考 文 献
1，Moreau-Gachelin F.Spi/PU.1:an oncogene of the ETS family.1994;Biochem Biophys.Acta,1198:149～163
2，Voo KS,Skalnik DG.Elf-1 and PU.1 induce expression of gp91phox Via a p romoter element mutated in a subset of Chronic Granulomatous Disease patients.Bl ood,1999;93(10):3512～3520
3，Suzuki Kumatori A,Haagen IA，et al.PU.1 as an essential activator for the expression of gp91phox gene in human peripheral neutrophis,monocytes,and B l ymphocytes.Proc Natl Acad Sci USA,1998;95:6085～6090
, 百拇医药
4，Dan Yang suzuki S,Hao LJ,et al.Eosinophil-specific regulation of gp91p hox gene expression by transcription factors GATA-1 and GATA-2.J Bio Chem,2000;2 75(13):9425～9432
5，Orchard K,May GE.An EMSA-based method for determing the molecular weig ht of a protein-DNA complex.Nucleic Acids Res,1993;21:3335～3340
6，Heydeman A,Juang G,Hennessy K,et al.The myeloid-cell-specific c-fes pr omoter in regulated by Sp1,PU.1,and a novel transcription factor.Mol Cell Biol,1 996;16:1676～1678
, 百拇医药
7，Eklund EA,Jalava A,Kakar R.PU.1,interferon regulatory factor 1,and in terferon consensus sequence-binding protein cooperate to increase gp91phox expre ssion.J Bio Chem,1998;273:13957～13962
8，Spain LM,Guerriero A,Kunjibettu S,et al.T cell development in PU.1-de ficient mice.J Immunol,1999;163:2681～2687
9，Pio F,Assa-munt N,Yguerabide J,et al.Mutants of domain PU.1 and GGAA/T recognition:Free energies and kinetics.Protein Sci,1999;8:2098～2109
(2000-08-10收稿), http://www.100md.com
单位：范春(卫生部肝胆肠外科研究中心 长沙 410008)；中村三千男(日本长崎大学生物化学研究所)
关键词：重叠聚合酶链反应；cDNA；PU.1；生物活性
中国现代医学杂志001107 目的：重叠聚合酶链反应(Overlapping Polymerase Chain Reaction PC R)法是在上下游引物之间设计一对碱基互补的嵌套引物，第一轮PCR分别扩增5’端和3’端 片段，第二轮PCR以第一轮PCR的5’端和3’端片段混和物为模板，用上下游引物扩增出全长 片段。该文用逆转录-Overlapping PCR法快速高效地从前骨髓干细胞中扩增到人类PU.1全长 cD NA为442bp，酶切和测序证实完全与前人报道一致。构建的真核表达质粒pcDNA3.1-hPU.1可 以被特异的抗体识别，体外细胞株转染证实具有特异的激活启动子活性的功能。
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分类号 R329.2
THE CLONING AND ITS BIOCHEMICAL ACTIVITY OF HUMAN PU.1 cDNA
Fan Chun
(National Hepatobiliary and Enteric Surgical Research Center, Ministry of Health,P.R.China )
Michio Nakamura
(Indtitute of Biochemistry, Nagasaki University, Japan)
Abstract: Overlapping Polymerase Chain Reaction (PCR) is used to amply f ull-leng th cDNA by using a paire of inter-nested primer between upstread and downstread primer. First-round PCR, both 5’-fragement and 3’-fragement were amplified an d S econd-round PCR, full-length cDNA was amplifited basing on the mixture of first- round PCR products, We cloned a human full-length PU.1 cDNA using total mRNA fro m myelomoloblastic cell line PLB985 by this technique, its sequence is completel y consistent with Genebank reported by restrict emzyme mapping and sequencing an alysis. Overexpression of human PU.1 can been recognized by both PU.1-site blind ing consensus sequence and specific antibody, and also trans-activate promoter a ctivity.
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Key words: Overlapping Polymerase Chain Reaction; cDNA; PU.1; DNA Binding Trans-activation
PU.1是转录因了ets(E26 Transformational Specific)家族的成员之 一，它的表达具有细胞和组织特异性，广泛在人类中性粒细胞、单核细胞、B淋巴细胞及造 血干细胞中表达[1]。研究表明，PU.1在调节造血细胞的分裂、分化及生长过 程中起 着至关重要的作用。在PU.1基因缺陷的转基因小鼠表现为B淋巴细胞和巨嗜细胞缺失，发生 原因不明的晚期胚胎致死[2]。
为了得到真核表达的人类PU.1，我们用Overlapping PCR法结合逆转录反应，加上必要的引 物嵌套扩增，得到了所需的全长cDNA，并克隆到真核表达载体pcDNA3.1，经过酶切鉴定、序 列分析和生物活性测定，证明确为所需的人类PU.1，完全可以用于基因的高效表达。
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1 材料与方法1.1 材料
细胞PLB985为前骨髓造血干细胞株，Jurkat为T淋巴细胞株，NIH3T3为成纤维母细胞株，这 些细胞均来自ATCC，用10%小牛血清RPMI 1640培养基培养呈对数生长期。
各种试剂盒及引物HindⅢ，XbaⅠ,EcoRⅠ,KpnⅠ,BamHⅠ，T4 DNA连接酶，CIP均来自Bio-La b公司。逆转录酶，Pfu DNA聚合酶，RNasin来自Promega公司，32P-ddATP及测序试剂 盒为Pharmacia公司产品，使用的引物由Pharmacia公司合成。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取 1×107个对数生长期的PLB985细胞经PBS换洗2 次，Trizl(Life Technologies)提取总RNA，CSC1(25?000r/min 30min 4℃)密度梯度离心 ，沉淀溶入5mM EDTA/β-巯基乙醇溶液中，再经酚：氯仿沉淀，-70℃储存备用。
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1.2.2 逆转录及Overlapping PCR总RNA中加入Oligo(dT)17，RNas in，逆转录酶，于42℃作用1h，然后抽提沉淀，获得cDNA第一链作为Overlapping PCR扩增 模板。
图1
按图1所示，第一轮PCR用引物对(F-Primer/I-RP和R-Primer/I-FP)分别扩增出5’端 和3’端片段，第二轮PCR用上述扩增产物的混合物为模板，以上下引物(F-Primer和R-Prime r)扩增出预期大小的片段，经琼脂糖凝胶电泳，回收DNA片段。
1.2.3 回收DNA片段的克隆及鉴定 将回收纯化的片段经Hind Ⅲ/XbaⅠ内 切酶消化，连接到相同内切酶消化并CIP处理的pBluescript KSⅡ克隆载体上，通过蓝/白斑 筛选出阳性克隆，小量培养及DNA提取，酶切图谱和测序仪(Pharmacia ALF)上序列分析，签 定出人类全长cDNA片段。
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1.2.4 EMSA分析 参照Suzuki[3]方法。收集大约培养成对数生 长期的1×107个PLB985或Jurkat或NIH3T3细胞，经裂解液[10mM Hepes,pH7.9,10mM KCl, 0.1mM EGTA,0.1mM EDTA,1mM DTT,0.5mM phonylmethylsulfonyl fluoride (PMSF.Sigma),2 μ g leupeptin(Sigma)/ml,2μg profini (Sigma)/ml,10μg pepstatin A (Sigma)/ ml,10μg 3.4 dichloroisocoumarin (Boehringer Mannheim)/ml,10μg E-64-d (pe pfide Insitute ,Osaka)/ml]破膜，14?000r/min 4℃ 30min制备细胞核提物。探针(gp 91phox基因启动子-65到-41区段，含PU.1结合序列GAGGAA)用32PddATP经3 ’-末端标 记盒(Life Technologies)标记，竞争寡核苷酸(Competitor)包括未标记的探针，杂合子，P U.1。基本过程是在5μg细胞核提取物中加入300倍超量的竞争寡核苷酸或2.5μg PU.1多 克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)，再加入2×104cmp放射活性的探针，反应15min 后上样到5%非变性聚丙稀酰胺，200V 4℃条件下电泳3h，干燥凝胶，曝光24h，然后在图 像仪(Bio-Rad Imager)上打印出结果。
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1.2.5 短时表达活性分析 将gp91phox启动子的-105到+12区段序列应用PC R扩增并克隆到一个Firefly Luciferase报道质粒PXP2上构建-105WT/pLUC,另外在该质粒的- 52位置应用定向突变PCR(Site-Directed Mutagenesis)技术将C→T构建成点突变的一个报道 质粒-52T/pLUC.。共转染用15μl Liposome 1μg的报道质粒-105WT/pLUC.或-52T/pLU C.,0.5μg pcDNA3.1-hPU.1或0.5μg pcDNA3.1空白质粒为平行对照和10ng Rellina Lucife rase pRL/CMV作内对照，与1.2×105PLB985细胞，8×104 Jurkat细胞，6×10 4 NIH3T3细胞分别共培养24，10和24h后，收获细胞并裂解，分别测定Firefly Lucifer ase和Rellina Luciferase活性，计算Firefly/Rellina相对值，每个样本平行做3个孔，重 复3次，用Mean±SD表示。
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2 结果2.1 Overlapping PCR产物
我们选用人类前骨髓干细胞PLB985株提取总RNA，是因为该细胞表达高丰度的PU.1 mRNA，加 用RNase抑制剂使mRNA不致降解，因此可直接用来制备cDNA模板进行Overlapping PCR。重要 的是我们设计了一套碱基互补的嵌套引物，保证了第一轮PCR扩增出5’端和3’端的片段， 为第二轮PCR扩增出全长cDNA提供了保证。结果见图2。第一轮PCR扩增出5’端和3’端的相 同片段为241bp(1～4道)，第二轮PCR扩增出全长cDNA约为450bp(5～8道)。阴性对照见9道。
2.2 人PU.1 cDNA片段的分子克隆及鉴定
由于我们在P-Primer和R-Primer中分别设计了Hind Ⅲ及Xba Ⅰ内切酶位点，因此很容易将 其定向克隆到pBluescript KSⅡ载体上，经转化到XL-1中后，在培养皿中通过蓝/白斑筛选 ，挑出白色已连接好的质粒，经过酶切电泳图及人PU.1cDNA核苷酸序列分析，获得了与Ge neBank报道的完全一致的全长PU.1cDNA。结果见图2。随后从pBluescript KS Ⅱ-hPU.1载体 上酶切下该片段并克隆到真核表达载体，获得了pcDNA3.1-hPU.1，再次经酶切及序列测定确 认。结果见图3。
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61 tttttaaaaa gcattcaata tacaaaaagg tgccagcgcc agactcccaa ggaagcaccg
121 tggccactaa gccaggctga ccctcggttg aggtccgagg cccaggcggc ccttggagcg
181 ggctaaagtc ctggtgggag gcaaagcggg tggggcgggc caggccgggc atgggagggc
241 gaggccgggc ccccagtcct gcctcggccc tgggaatgtc ctccctgtgt ccgggccggg
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301 cgacggtta atgctatggc cggcggggtc cangagccct gggtctctgc gggcgatcag
361 tggggcggga ggcgccgctc ggccaggccc ccacggcccc aacacctcgc cgctgaactg
421 gtaggtgagc ttcttcttga cttntcttac ct
图2 人PU.1 cDNA核苷酸序列
图3 A. pcDNA3.1-hPU.1质粒图
B. pcDNA3.1-hPU.1酶切图
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目前研究DNA-蛋白质相互作用的特异可靠的方法之一是EMSA(electrophoretic mobility sh ift assay)。图4A结果显示，在PLB985细胞内源性 表达的PU.1和在Jurkat细胞高效表达的h PU.1，能特异性地结合到gp91phox基因的启动子形成一个快速迁移的PU.1复合物，这种结合 能被特异性的PU.1 Competitor所抑制，图4B结果显示，抗PU.1抗体改变了这种DNA-蛋白质 复合物，进一步肯定我们构建的pcDNA3.1-hPU.1可以在真核细胞中表达。
图4A EMSA图
图4B Super Shift EMSA图
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2.4 hPU.1激活了gp91phox基因启动子的活性
为了证实hPU.1结合到这个启动子上是否具有功能活性，我们采用了共同转染的方法将pcDNA 3.1-hPU.1与-105WT/pLUC或-52T/pLUC转染到Jurkat细胞，结果显示，hPU.1极大地激活了启 动子的转录活性，对照空白pcDNA3.1(-)或当pcDNA3.1-hPU.1与-52T/pLUC共同转染时则无这 种转录活性，见图5。这些结果充分证实，hPU.1激活启动因子的转录活性依赖于DNA的特异 结合。当我们用一种磷酸激酶K(PKC)诱导剂TPA诱导时，提高了一倍的转录活性，进一步提 示，磷酸化的hPU.1可提高激活启动子的转录活性。
图5 hPU.1短时表达活性分析 结果
WT，-105WT/pLUC.;，空白pcDNA3.1;PU.1,表达载体pcDNA3.1-hPU.1;TPA
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3 讨论
PU.1是转录因子ets家族的成员之一，与细胞的生长、分裂、分化及肿瘤发生有密切关系 [1]。它的表达具有细胞型和组织型特异性，广泛在人类中性粒细胞、单核细胞、B 淋巴细胞及造血干细胞中表达[2]。它通过DNA-蛋白质或蛋白质形成的复合物，相 互 作用调节着基因表达，这种调节要求转录因子识别特异的DNA结合位点。这一般能识别几个 碱基组成的核心成份(GGAA/T)，PU.1便是通过靶向具有相同的核心序列调节着不同的基因 表达[6]。我们的EMSA结果显示，内源性(PLB985的核提取物)和外源性(短时表达 的Jurkat细胞提取物)的hPU.1能特异地与gp91phox启动子的GGAA序列结合，形成DNA-蛋白质 复合物，这种复合物又被同源的PU.1-结合序列和抗PU.1抗体所破坏，因此我们证实了重组 的hPU.1具有体内特异的DNA结合活性。我们的短时表达分析结果进一步显示，重组的hPU.1 能极大地激活基因的转录活性，这种转录活性可以受到外来因素的调节，从而证实重组的hP U.1具有在体内的生物活性。
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参 考 文 献
1，Moreau-Gachelin F.Spi/PU.1:an oncogene of the ETS family.1994;Biochem Biophys.Acta,1198:149～163
2，Voo KS,Skalnik DG.Elf-1 and PU.1 induce expression of gp91phox Via a p romoter element mutated in a subset of Chronic Granulomatous Disease patients.Bl ood,1999;93(10):3512～3520
3，Suzuki Kumatori A,Haagen IA，et al.PU.1 as an essential activator for the expression of gp91phox gene in human peripheral neutrophis,monocytes,and B l ymphocytes.Proc Natl Acad Sci USA,1998;95:6085～6090
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4，Dan Yang suzuki S,Hao LJ,et al.Eosinophil-specific regulation of gp91p hox gene expression by transcription factors GATA-1 and GATA-2.J Bio Chem,2000;2 75(13):9425～9432
5，Orchard K,May GE.An EMSA-based method for determing the molecular weig ht of a protein-DNA complex.Nucleic Acids Res,1993;21:3335～3340
6，Heydeman A,Juang G,Hennessy K,et al.The myeloid-cell-specific c-fes pr omoter in regulated by Sp1,PU.1,and a novel transcription factor.Mol Cell Biol,1 996;16:1676～1678
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(2000-08-10收稿), http://www.100md.com