神经生长因子对瘢痕组织中炎性细胞及胶原沉积的影响
作者：杨东运 李世荣 李荟元
单位：第三军医大学附属西南医院整形外科，重庆 400038
关键词：神经生长因子；炎性细胞；胶原沉积；瘢痕
第三军医大学学报001122
提 要：目的 研究神经生长因子对局部瘢痕组织中肥大细胞等炎性细胞及胶原沉积的影响，探讨增生性瘢痕病理性胶原代谢的启动因素。方法 以大鼠背部创面愈合后瘢痕为研究模型，采用常规HE、天青-A及VG染色和计算机图像分析，研究神经生长因子对局部瘢痕组织中肥大细胞等炎性细胞及胶原沉积的影响。结果 注射神经生长因子后局部瘢痕组织中肥大细胞、巨噬细胞、白细胞及淋巴细胞的数量及活化程度、胶原纤维分布的面密度都非常显著增加(P<0.01)。结论 在创面上皮化愈合后神经生长因子仍可促进炎性细胞的趋化、活化，促进局部瘢痕组织中胶原的沉积，从而可能在增生性瘢痕的形成中发挥重要作用。
, 百拇医药
中图法分类号：R394.32;R619.6 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)11-1090-04
Effects of nerve growth factor on inflammatory cells and collagen deposition in scar tissues
YANG Dong-yun,LI Shi-rong,LI Hui-yuan
(Department of Plastic Surgery,Southwest Hospital,Chongqing 400038,China)
Abstract：Objective To study the effects of nerve growth factor (NGF) on inflammatory cells and collagen deposition in local scar tissues after wound-healing for the possible roles of NGF in hypertrophic scar (HS).Methods Full-skin thickness wounds were inflicted in the back of 15 male rats.After wound-healing,NGF and normal saline were injected into local scar once a day respectively.Three days later,the scar and nearby normal skin tissues were removed and proceeded with HE staining,Azure-A staining and VG staining.Computer image analysis was carried out.Results The amounts and activity of mast cells,macrophages,polymorphonuclear leukocytes and lymphocytes were increased in the NGF-treated group.In this group,the density of collagenous fiber was increased in scar tissues as compared with control group (P<0.01).Conclusion NGF could not only augment the migration and activation of mast cells and other inflammatory cells,but also enhance collagen deposition in local scar tissues after wound-healing,so NGF may play an essential role in the development of HS.
, 百拇医药
Key words:nerve growth factor;inflammatory cells;collagen deposition;scar
增生性瘢痕(Hypertrophic scar,HS)不仅影响外观，发生在功能部位者还可导致严重的功能障碍，但由于其发病机制至今还不十分清楚，临床上尚缺乏根本有效的预防和治疗方法。因此，HS发病机制及其防治一直是整形外科和烧伤领域研究的难点和重点。本文拟通过动物实验，研究神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)对局部瘢痕组织中肥大细胞等炎性细胞及胶原沉积的影响，探讨NGF在HS发生发展中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康雄性大鼠15只，体重200 g左右。购自第三军医大学实验动物中心。
, 百拇医药
采用同体对照的方法,在大鼠背部两侧各做一创面,待创面愈合后其右侧作为NGF治疗组,左侧为盐水对照组,并取创面周围的正常皮肤为空白对照组,每组各15只动物。
1.2 主要试剂
鼠源性NGF：北京北方同正生物技术发展公司。天青-A：上海化学试剂厂。
1.3 主要仪器
真彩医学图象分析仪：德国Leica公司MD-20型。光学显微镜：日本Olympus-CH型。
1.4 实验方法
大鼠用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉(30～50 mg/kg体重)，麻醉后固定于简易操作台，剃去背部毛发，2%碘酒、75%酒精依次消毒背部皮肤。用眼科剪在背部两侧各剪去一直径约0.7 cm的圆形全层皮肤，两创面相距2.0 cm以上。观察无活动性出血点后创面涂以金霉素眼膏，继续饲养。待创面愈合后连续3d在背部右侧原创面处的皮肤瘢痕内注入NGF，剂量为500 ng/d，左侧注入等量(0.1 ml)的生理盐水做对照。1周后腹腔注入过量的戊巴比妥(250 mg/kg体重)处死大鼠，立即切取注射部位的瘢痕标本及附近的正常皮肤，直径各为0.7 cm。标本立即入福尔马林液分组(NGF组、盐水对照组和正常皮肤组)固定，常规石蜡包埋切片，分别进行：(1)HE染色，光镜病理组织学检查。(2)天青-A法肥大细胞染色，网行测微器计数，按改良的Dellesse's公式行密度计算[1]，结果行单因素方差分析。(3)VG染色，胶原含量图像分析：每组测定5张切片，在25倍物镜下自表皮基底层向深层方向随机观测5个视野，由计算机辅助系统求出胶原分布的面密度，结果行单因素方差分析。
, 百拇医药
1.5 VG染色
按文献[2]步骤进行。
2 结果
2.1 光镜病理形态学观察
NGF组：表皮层增厚，真皮乳头层、网状层界限不清，真皮层胶原纤维致密，胶原束排列紊乱，其间成纤维细胞、单核/巨噬细胞、白细胞及淋巴细胞明显增多，核分裂像多见，微血管增多。
盐水对照组：表皮层稍增厚，胶原纤维及成纤维细胞增多，但程度较NGF组轻，炎性细胞浸润少。
正常皮肤组：皮肤附件完整，真皮乳头层和网状层界限清晰，胶原纤维排列疏松，胶原束间有较大间隙，细胞成份及血管数目较少。
2.2 天青-A法肥大细胞染色
, http://www.100md.com
2.2.1形态学 在天青A染色下，肥大细胞呈红色，其它组织呈淡蓝色，对比明显。
NGF组：真皮浅层、深层均可见到大量的肥大细胞，以真皮浅层最为密集，细胞大小不等，脱颗粒现象显著，有时可见细胞周围的基质被肥大细胞颗粒染成红色，见图1。
盐水对照组：肥大细胞很少，主要位于乳头层，细胞较小，大小一致，极少有脱颗粒现象，见图2。
正常皮肤组：与盐水对照组相似。
图1 注射NGF组 局部瘢痕组织中肥大细胞增多,肥大细胞脱颗粒现象显著 (天青-A×400)
Fig 1 Mast cells increased and degranulation of mast cell was evident in the NGF-treated group (Azure-A×400)
, 百拇医药
图2 注射生理盐水组 局部瘢痕组织中肥大细胞数量及脱颗粒状态无明显变化 (天青A-×100)
Fig 2 No marked changes in the number and degranulation of mast cell in normal saline treated group (Azure-A×100)
2.2.2 计数 各组肥大细胞计数结果见表1。
表1 各组肥大细胞计数
Tab 1 Mast cell count in different groups Group
n
Amount(
±s)
, 百拇医药
NGF-treated
5
309.8±151.2△
Normal saline treated
5
32.2±40.2
Normal-skin
5
31.0±39.4
△：P<0.01 vs other two groups；
2.3 VG法胶原染色 在VG染色下，胶原纤维呈红色，胞浆、红细胞、腺体等呈黄色，细胞核呈棕黄色。光镜下见NGF组红色的胶原纤维致密，黄色细胞成份增多，见图3。
, 百拇医药
图3 注射NGF组 局部瘢痕组织中胶原含量增多 (VG×100)
Fig 3 Increased collagen deposition in local scar
tissue after NGF treatment (VG×100)
盐水对照组：乳头层、网状层界限不清，胶原纤维排列较为整齐，胶原束间空隙较大，见图4。
正常皮肤组：乳头层胶原纤维较细，网状层原纤维较粗，排列疏松，皮肤附件存在，细胞成份少。
经图像分析和统计学处理，NGF组和盐水对照组胶原纤维的含量有显著差异(P<0.01)，盐水对照组也显著高于正常皮肤组(P<0.01)，见表2。
, http://www.100md.com
图4 注射生理盐水组 局部瘢痕组织中胶原含量显著低于NGF组 (VG×100)
Fig 4 Lower collagen deposition in normal saline treated group (Compared with NGF-treated group) (VG×100)
表2 各组胶原纤维分布的面密度
Tab 2 Density of collagen in different groups Group
n
Density(±s)
NGF-treated
, http://www.100md.com
5
0.811±0.088△
NaCl-treated
5
0.606±0.060*
Normal skin
5
0.452±0.057
△：P<0.01 vs other two groups；*：P<0.01 vs normal skin
3 讨论
大量文献报道，局部环境中异常存在的炎性细胞及其产生的细胞因子等生物活性物质是增生性瘢痕发生的重要原因[3，4]，但创面上皮化后HS内炎性细胞异常存在的原因目前尚不清楚。
, 百拇医药
NGF是神经系统最重要的生物活性分子，除能促进创伤后神经纤维的再生外，它还对免疫、造血等非神经系统具有重要的调节作用，可以通过促进免疫、炎性细胞的功能和活性而促进创面愈合，并在创伤后局部疼痛、痛觉过敏的发生中发挥重要作用[4]。我们以前的实验表明，HS中存在NGF的异常高水平表达[5] ，且NGF在创面上皮化后仍可趋化、活化炎性细胞，并促进其增殖及脱颗粒。 因此我们推测，HS内异常高水平的NGF可能通过趋化、活化炎性细胞而启动病理性胶原代谢，导致胶原的过度堆积。目前尚无NGF与HS关系的报道，为了验证这一推测，我们进行了此次实验。结果发现：(1)NGF组胶原束间成纤维细胞、单核/巨噬细胞和多形核白细胞、淋巴细胞明显增加，核分裂相多见，肥大细胞增多亦很明显，细胞大小不等，脱颗粒现象显著。文献报道，肥大细胞与纤维化疾病的关系相当密切，活化的肥大细胞可以促进成纤维细胞的增殖及合成细胞外基质，并且可使成纤维细胞失去接触抑制这一特性，在纤维化组织中，肥大细胞的数量与纤维化程度呈正相关[6]。(2)NGF组胶原纤维的面密度非常显著高于盐水对照组和正常皮肤组(P<0.01)，这与我们的预测、也与文献报道的NGF可促进创面胶原沉积相符合[7]。(3)盐水对照组胶原纤维的面密度也非常显著高于正常皮肤组(P<0.01)，考虑原因如下：①盐水对照组标本为创面愈合后瘢痕组织，其胶原含量应该不同于正常皮肤；②可能是注射引起的物理创伤所致。
, 百拇医药
结合以前的实验结果，我们认为NGF可能在HS的病理性胶原代谢中可能发挥了重要的启动作用：高水平的NGF趋化并活化炎性细胞，促进其增殖及释放细胞因子和炎症介质，后者又作用于成纤维细胞，使成纤维细胞功能状态发生改变，合成过量的胶原等细胞外基质，最终导致HS的发生。
作者简介：杨东运(1970-)，男，河南省柘城县人，硕士，主治医师，主要从事增生性瘢痕方面的研究。
参考文献：
[1]孙本善，李玉霞.瘢痕组织中肥大细胞变化的观察[J].实用美容整形外科杂志，1991,2(1,2)：35-37.
[2]龚志锦,詹熔洲 著.病理组织制片和染色技术[M].上海：上海科学技术出版社,1994.66-67.
[3]Schmid P,Itin P,Cherry G,et al.Enhanced expression of transforming growth factor-beta type I and type II receptors in wound granulation tissue and hypertrophic scar[J].Am J Pathol，1998，152(2):485-493.
, 百拇医药
[4]赵烨德,牛星焘,肖军军.巨噬细胞、T淋巴细胞在增生性瘢痕组织中的分布研究[J].中华整形烧伤外科杂志，1997，13(6):446-448.
[5]杨东运，李世荣，李荟元。增生性瘢痕组织中神经生长因子的免疫组化检测[J].第三军医大学学报，2000，16(7)：687-691.
[6]Pesci A,Bertorelli G,Gabrielli G，et al.Mast cells in fibrotic lung disorders[J].Chest,1993，103(4):989-996.
[7]Matsuda H,Koyama H,Sato H,et al.Role of nerve growth factor in cutaneous wound healing:Acceleration effects in normal and healing-impaired diabetic mice[J].J Exp Med，1998，187(2):297-306.
收稿日期：1999-02-23
修回日期：2000-09-04, 百拇医药
单位：第三军医大学附属西南医院整形外科，重庆 400038
关键词：神经生长因子；炎性细胞；胶原沉积；瘢痕
第三军医大学学报001122
提 要：目的 研究神经生长因子对局部瘢痕组织中肥大细胞等炎性细胞及胶原沉积的影响，探讨增生性瘢痕病理性胶原代谢的启动因素。方法 以大鼠背部创面愈合后瘢痕为研究模型，采用常规HE、天青-A及VG染色和计算机图像分析，研究神经生长因子对局部瘢痕组织中肥大细胞等炎性细胞及胶原沉积的影响。结果 注射神经生长因子后局部瘢痕组织中肥大细胞、巨噬细胞、白细胞及淋巴细胞的数量及活化程度、胶原纤维分布的面密度都非常显著增加(P<0.01)。结论 在创面上皮化愈合后神经生长因子仍可促进炎性细胞的趋化、活化，促进局部瘢痕组织中胶原的沉积，从而可能在增生性瘢痕的形成中发挥重要作用。
, 百拇医药
中图法分类号：R394.32;R619.6 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)11-1090-04
Effects of nerve growth factor on inflammatory cells and collagen deposition in scar tissues
YANG Dong-yun,LI Shi-rong,LI Hui-yuan
(Department of Plastic Surgery,Southwest Hospital,Chongqing 400038,China)
Abstract：Objective To study the effects of nerve growth factor (NGF) on inflammatory cells and collagen deposition in local scar tissues after wound-healing for the possible roles of NGF in hypertrophic scar (HS).Methods Full-skin thickness wounds were inflicted in the back of 15 male rats.After wound-healing,NGF and normal saline were injected into local scar once a day respectively.Three days later,the scar and nearby normal skin tissues were removed and proceeded with HE staining,Azure-A staining and VG staining.Computer image analysis was carried out.Results The amounts and activity of mast cells,macrophages,polymorphonuclear leukocytes and lymphocytes were increased in the NGF-treated group.In this group,the density of collagenous fiber was increased in scar tissues as compared with control group (P<0.01).Conclusion NGF could not only augment the migration and activation of mast cells and other inflammatory cells,but also enhance collagen deposition in local scar tissues after wound-healing,so NGF may play an essential role in the development of HS.
, 百拇医药
Key words:nerve growth factor;inflammatory cells;collagen deposition;scar
增生性瘢痕(Hypertrophic scar,HS)不仅影响外观，发生在功能部位者还可导致严重的功能障碍，但由于其发病机制至今还不十分清楚，临床上尚缺乏根本有效的预防和治疗方法。因此，HS发病机制及其防治一直是整形外科和烧伤领域研究的难点和重点。本文拟通过动物实验，研究神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)对局部瘢痕组织中肥大细胞等炎性细胞及胶原沉积的影响，探讨NGF在HS发生发展中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康雄性大鼠15只，体重200 g左右。购自第三军医大学实验动物中心。
, 百拇医药
采用同体对照的方法,在大鼠背部两侧各做一创面,待创面愈合后其右侧作为NGF治疗组,左侧为盐水对照组,并取创面周围的正常皮肤为空白对照组,每组各15只动物。
1.2 主要试剂
鼠源性NGF：北京北方同正生物技术发展公司。天青-A：上海化学试剂厂。
1.3 主要仪器
真彩医学图象分析仪：德国Leica公司MD-20型。光学显微镜：日本Olympus-CH型。
1.4 实验方法
大鼠用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉(30～50 mg/kg体重)，麻醉后固定于简易操作台，剃去背部毛发，2%碘酒、75%酒精依次消毒背部皮肤。用眼科剪在背部两侧各剪去一直径约0.7 cm的圆形全层皮肤，两创面相距2.0 cm以上。观察无活动性出血点后创面涂以金霉素眼膏，继续饲养。待创面愈合后连续3d在背部右侧原创面处的皮肤瘢痕内注入NGF，剂量为500 ng/d，左侧注入等量(0.1 ml)的生理盐水做对照。1周后腹腔注入过量的戊巴比妥(250 mg/kg体重)处死大鼠，立即切取注射部位的瘢痕标本及附近的正常皮肤，直径各为0.7 cm。标本立即入福尔马林液分组(NGF组、盐水对照组和正常皮肤组)固定，常规石蜡包埋切片，分别进行：(1)HE染色，光镜病理组织学检查。(2)天青-A法肥大细胞染色，网行测微器计数，按改良的Dellesse's公式行密度计算[1]，结果行单因素方差分析。(3)VG染色，胶原含量图像分析：每组测定5张切片，在25倍物镜下自表皮基底层向深层方向随机观测5个视野，由计算机辅助系统求出胶原分布的面密度，结果行单因素方差分析。
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1.5 VG染色
按文献[2]步骤进行。
2 结果
2.1 光镜病理形态学观察
NGF组：表皮层增厚，真皮乳头层、网状层界限不清，真皮层胶原纤维致密，胶原束排列紊乱，其间成纤维细胞、单核/巨噬细胞、白细胞及淋巴细胞明显增多，核分裂像多见，微血管增多。
盐水对照组：表皮层稍增厚，胶原纤维及成纤维细胞增多，但程度较NGF组轻，炎性细胞浸润少。
正常皮肤组：皮肤附件完整，真皮乳头层和网状层界限清晰，胶原纤维排列疏松，胶原束间有较大间隙，细胞成份及血管数目较少。
2.2 天青-A法肥大细胞染色
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2.2.1形态学 在天青A染色下，肥大细胞呈红色，其它组织呈淡蓝色，对比明显。
NGF组：真皮浅层、深层均可见到大量的肥大细胞，以真皮浅层最为密集，细胞大小不等，脱颗粒现象显著，有时可见细胞周围的基质被肥大细胞颗粒染成红色，见图1。
盐水对照组：肥大细胞很少，主要位于乳头层，细胞较小，大小一致，极少有脱颗粒现象，见图2。
正常皮肤组：与盐水对照组相似。
图1 注射NGF组 局部瘢痕组织中肥大细胞增多,肥大细胞脱颗粒现象显著 (天青-A×400)
Fig 1 Mast cells increased and degranulation of mast cell was evident in the NGF-treated group (Azure-A×400)
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图2 注射生理盐水组 局部瘢痕组织中肥大细胞数量及脱颗粒状态无明显变化 (天青A-×100)
Fig 2 No marked changes in the number and degranulation of mast cell in normal saline treated group (Azure-A×100)
2.2.2 计数 各组肥大细胞计数结果见表1。
表1 各组肥大细胞计数
Tab 1 Mast cell count in different groups Group
n
Amount(
±s), 百拇医药
NGF-treated
5
309.8±151.2△
Normal saline treated
5
32.2±40.2
Normal-skin
5
31.0±39.4
△：P<0.01 vs other two groups；
2.3 VG法胶原染色 在VG染色下，胶原纤维呈红色，胞浆、红细胞、腺体等呈黄色，细胞核呈棕黄色。光镜下见NGF组红色的胶原纤维致密，黄色细胞成份增多，见图3。
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图3 注射NGF组 局部瘢痕组织中胶原含量增多 (VG×100)
Fig 3 Increased collagen deposition in local scar
tissue after NGF treatment (VG×100)
盐水对照组：乳头层、网状层界限不清，胶原纤维排列较为整齐，胶原束间空隙较大，见图4。
正常皮肤组：乳头层胶原纤维较细，网状层原纤维较粗，排列疏松，皮肤附件存在，细胞成份少。
经图像分析和统计学处理，NGF组和盐水对照组胶原纤维的含量有显著差异(P<0.01)，盐水对照组也显著高于正常皮肤组(P<0.01)，见表2。
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图4 注射生理盐水组 局部瘢痕组织中胶原含量显著低于NGF组 (VG×100)
Fig 4 Lower collagen deposition in normal saline treated group (Compared with NGF-treated group) (VG×100)
表2 各组胶原纤维分布的面密度
Tab 2 Density of collagen in different groups Group
n
Density(
±s)NGF-treated
, http://www.100md.com
5
0.811±0.088△
NaCl-treated
5
0.606±0.060*
Normal skin
5
0.452±0.057
△：P<0.01 vs other two groups；*：P<0.01 vs normal skin
3 讨论
大量文献报道，局部环境中异常存在的炎性细胞及其产生的细胞因子等生物活性物质是增生性瘢痕发生的重要原因[3，4]，但创面上皮化后HS内炎性细胞异常存在的原因目前尚不清楚。
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NGF是神经系统最重要的生物活性分子，除能促进创伤后神经纤维的再生外，它还对免疫、造血等非神经系统具有重要的调节作用，可以通过促进免疫、炎性细胞的功能和活性而促进创面愈合，并在创伤后局部疼痛、痛觉过敏的发生中发挥重要作用[4]。我们以前的实验表明，HS中存在NGF的异常高水平表达[5] ，且NGF在创面上皮化后仍可趋化、活化炎性细胞，并促进其增殖及脱颗粒。 因此我们推测，HS内异常高水平的NGF可能通过趋化、活化炎性细胞而启动病理性胶原代谢，导致胶原的过度堆积。目前尚无NGF与HS关系的报道，为了验证这一推测，我们进行了此次实验。结果发现：(1)NGF组胶原束间成纤维细胞、单核/巨噬细胞和多形核白细胞、淋巴细胞明显增加，核分裂相多见，肥大细胞增多亦很明显，细胞大小不等，脱颗粒现象显著。文献报道，肥大细胞与纤维化疾病的关系相当密切，活化的肥大细胞可以促进成纤维细胞的增殖及合成细胞外基质，并且可使成纤维细胞失去接触抑制这一特性，在纤维化组织中，肥大细胞的数量与纤维化程度呈正相关[6]。(2)NGF组胶原纤维的面密度非常显著高于盐水对照组和正常皮肤组(P<0.01)，这与我们的预测、也与文献报道的NGF可促进创面胶原沉积相符合[7]。(3)盐水对照组胶原纤维的面密度也非常显著高于正常皮肤组(P<0.01)，考虑原因如下：①盐水对照组标本为创面愈合后瘢痕组织，其胶原含量应该不同于正常皮肤；②可能是注射引起的物理创伤所致。
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结合以前的实验结果，我们认为NGF可能在HS的病理性胶原代谢中可能发挥了重要的启动作用：高水平的NGF趋化并活化炎性细胞，促进其增殖及释放细胞因子和炎症介质，后者又作用于成纤维细胞，使成纤维细胞功能状态发生改变，合成过量的胶原等细胞外基质，最终导致HS的发生。
作者简介：杨东运(1970-)，男，河南省柘城县人，硕士，主治医师，主要从事增生性瘢痕方面的研究。
参考文献：
[1]孙本善，李玉霞.瘢痕组织中肥大细胞变化的观察[J].实用美容整形外科杂志，1991,2(1,2)：35-37.
[2]龚志锦,詹熔洲 著.病理组织制片和染色技术[M].上海：上海科学技术出版社,1994.66-67.
[3]Schmid P,Itin P,Cherry G,et al.Enhanced expression of transforming growth factor-beta type I and type II receptors in wound granulation tissue and hypertrophic scar[J].Am J Pathol，1998，152(2):485-493.
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[4]赵烨德,牛星焘,肖军军.巨噬细胞、T淋巴细胞在增生性瘢痕组织中的分布研究[J].中华整形烧伤外科杂志，1997，13(6):446-448.
[5]杨东运，李世荣，李荟元。增生性瘢痕组织中神经生长因子的免疫组化检测[J].第三军医大学学报，2000，16(7)：687-691.
[6]Pesci A,Bertorelli G,Gabrielli G，et al.Mast cells in fibrotic lung disorders[J].Chest,1993，103(4):989-996.
[7]Matsuda H,Koyama H,Sato H,et al.Role of nerve growth factor in cutaneous wound healing:Acceleration effects in normal and healing-impaired diabetic mice[J].J Exp Med，1998，187(2):297-306.
收稿日期：1999-02-23
修回日期：2000-09-04, 百拇医药