缺血预处理对肝再灌注损伤的保护作用
作者：杨恒文 杜晓兰 曾琳 廖维宏
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第三研究室，重庆 400042
关键词：缺血再灌注；缺血预处理；乳酸脱氢酶；过氧化物酶
第三军医大学学报001107
提 要：目的 观察缺血预处理(IPC)对肝脏缺血再灌注(I/R)损伤后肝功能的保护作用。方法 大鼠48只随机分为I/R组和IPC组。观测缺血后的肝脏谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、髓过氧化物酶(MPO)及肝组织的病理变化。结果 ALT在I/R组各时相点比缺血前升高47%～58%，而IPC组仅在缺血后24 h升高20%；LDH在I/R组与缺血前比较1、6、24 h均升高(P<0.01)，IPC组仅在缺血6 h较缺血前升高(P<0.05)；I/R组MPO与IPC组比较有显著增高(P<0.05)。病理检查IPC组比I/R组肝细胞损伤减轻、坏死范围小。结论 IPC可以减轻再灌注对肝脏的损伤，减少LDH的漏出和MPO的生成，而保护肝功能。
, 百拇医药
中图法分类号：R459.9;R619.9;R657.3 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)11-1039-03
Protective effects of ischemic preconditioning on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats
YANG Heng-wen,DU Xiao-lan,ZENG Lin,LIAO Wei-hong
(Research Institute of Field Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)
Abstract：Objective To study the protective mechanism of ischemic preconditioning on the liver function in hepatic ischemia-reperfusion injury.Methods Forty-eight rats were randomly divided into:ischemia-reperfusion group (I/R) in which hepatic arteries had been occluded for 1 h and ischemic preconditioning group (IPC) in which the arteries were ligated for 1 h after 10 min occlusion and 10 min release for 3 times.Serum alanine transferase (ALT),lactic dehydrogenase(LDH),medulla peroxidase(MPO) were measured and pathological changes of the liver were observed.Results The serum ALT content was increased by 47%～58% at time points of group I/R than that before ischemia,but only by 20% at the 24 h post-ischemia in group IPC.The LDH content was increased at hour 1,6,24 in group I/R compared with that before ischemia (P<0.01),and at 6 h after ischemia compared with that of the normal in group IPC (P<0.05).The MPO content was obviously increased in group I/R than in group IPC (P<0.05).Compared with group I/R,group IPC showed less hepatocyte injury,smaller necrotic area in the livers.Conclusion Preconditioning can relieve ischemia-reperfusion injury in the liver,decrease the leakage of LDH and inhibit the formation of MPO,thus it has a protective effect on hepatic function.
, 百拇医药
Key words:ischemia-reperfusion;ischemic preconditioning;lactic dehydrogenase;medullas peroxidase
缺血预处理(Ischemic preconditioning,IPC)能调动组织器官内源性保护机制，在多种动物的心肌再灌注模型中已得到证实。但IPC对实质性脏器功能的保护效应尚未见报道。设计本实验旨在观察IPC对肝脏功能的保护作用，其研究结果如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选择健康大鼠48只，雄雌各半。将动物随机分成2组，I/R组和IPC组，每组24只。观察时相为缺血前、缺血后1、3、6、24 h 5个时相。
1.2 致伤方法
用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹部正中切口，暴露肝固有动脉和门静脉。I/R组直接用无损伤动脉夹阻断血流，缺血时间为1h；IPC组先阻断血流10 min，然后放开血管夹10 min，反复3次后再阻断血流1h。
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1.3 肝功能测定
采用国产生化测定仪，在不同时相点，由颈外静脉插管到下腔静脉，取回心血液2ml，分别测定谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)。
1.4 肝组织中髓过氧化酶(MPO)的测定
取肝组织100 mg，加匀浆液2ml，4℃下离心30 min，3000 r/min。取上清液0.1 ml，放冰箱保存。样本采集到一定数量后，常温复融后再加反应液2.9 ml(成分为磷酸邻联二茴香胺O-dianisidine 167 mg，H2O2 5 mg，50 mmol/L PBS 100 ml)，保持25 ℃水中立即在紫外分光光度计下进行460 nm，2 min扫描，测波长(30～90 s)。1 min内吸光度变化代表酶活力。
1.5 病理检查
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肝组织用石蜡包埋，组织切片后用HE染色，在光镜下观察。
1.6 统计学处理
实验数据以
±s表示，进行t检验。
2 结果
2.1 肝功能测定
ALT是反应肝功能的最灵敏的指标，肝脏缺血时出现也比较早。本实验在肝脏I/R组和IPC组各时相点均测定了ALT，I/R 组缺血后各时相点较缺血前升高47%～58%。而预处理组在24 h时有20%升高，其它都在正常范围内。TBIL和TP两项差异不显著。LDH∶I/R组1、6、24 h与伤前比较差异均显著，与预处理比较差异亦显著P<0.05，LDH在预处理与伤前比较除6 h时相点有显著差异外，1 h和24 h无显著差异,见表1。
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表1 缺血和缺血预处理后肝脏LDH含量的变化(U/L，±s)
Tab 1 Changes of LDH contents in the liver following ischemia
and ischemia/preconditioning(U/L，±s)
Time after reperfusion (h)
Group
n
Preischemia
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1
6
24
Ischemia
6
303 3.3±48
420 3.3±59* △
746 8.3±82* △
570 6.7±99* △
Preconditioning
6
, http://www.100md.com
303 3.3±48
334 0.0±60.5
519 6.7±96△
352 5.0±62
*:P<0.05 vs preconditioning； △:P<0.05 vs preischemia
2.2 肝组织中MPO
肝缺血再灌注损伤时MPO增高。与损伤前比较各时相点统具有非常显著差异(P<0.01)。缺血损伤组与预处理组除24 h无显著差异外，其它各时相均有显著差异。预处理组与伤前比较亦有显著差异，见表2。
表2 缺血和缺血预处理后肝脏MPO含量的变化(±s)
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Tab 2 Changes of MPO contents in the liver following ischemia and ischemia/preconditioning(±s)
Time after reperfusion(h)
Group
n
Preischemia
1
3
6
24
, 百拇医药
Ischemaia
5
0.0381±0.006
0.1041±0.010* △
0.1065±0.011* △
0.1114±0.030* △
0.0886±0.019△
Preconditioning
5
0.0381±0.006
, 百拇医药
0.0846±0.011△
0.0898±0.013△
0.0794±0.021△
0.0776±0.016△
*:P<0.05 vs preconditioning； △:P<0.05 vs preischemia
2.3 病理变化
肝缺血再灌注24 h的病理变化是肝细胞肿胀，结构紊乱，排列不整齐。增大的肝细胞胞浆淡染，核大而浓染。有散在的肝小叶中心坏死。经预处理后的肝细胞肿胀减轻，肝细胞坏死范围缩小。
3 讨论
, 百拇医药
I/R损伤在多种器官和组织已得到了证实。Jaeschke等[1]阻断小鼠肝脏血流45 min,建立肝缺血模型,检测到肝组织双相损伤。Myagkaya等观察到在常温下肝缺血60～90 min，内皮细胞就可能发生不可逆损伤，而肝细胞在缺血90～120 min则出现不可逆性损伤。本实验中在预实验时做肝缺血90 min有80%的动物死亡，这与文献报道基本一致。所以实验时肝缺血时间选择60 min，以造成可逆性损伤。
IPC文献报道有多种，有缺血2.5 min再灌注1次，也有3.5 min再灌注1次，最长者达到25 min再灌注1次。IPC的使用有1次，也有2次,多则4次5次。Lawson等[2]认为小鼠1次预处理不可能调动其缺血预处理保护机制，至少要2次缺血才能有效。本实验采用3次预处理,其结果比较理想。
肝脏缺血再灌注后肝细胞发生一系列代谢、结构和功能的损伤，结果导致肝功能的衰竭，转氨酶升高，LDH漏出增多[3，4]。本实验结果也证实了这些变化。表现ALT、LDH、MPO均明显升高。组织病理学检查肝组织有明显病理变化，IPC组各种变化均比 I/R轻,证实IPC对肝缺血损伤保护效果确实明显 。这对提高临床器官移植手术的成功率是一种有益的方法。由于缺血缺氧肝血管床的损伤，微血管通透性升高，中性粒细胞浸润，组织MPO活性升高，内分泌功能紊乱。MPO和细胞毒性物质引起肝组织再损伤，经缺血预处理后再缺血,能提高肝脏对缺血的耐受性，减轻再灌注损伤，它能减少LDH漏出和MPO释放[5，6]。有的学者认为IPC可能是一种比用抗氧化剂、清除剂或抗嗜中性白细胞粘附剂等更好的方法。以上结果表明：预处理能增强肝组织对缺血的适应性，减少LDH漏出和抑制MPO的产生，减轻肝细胞损害。有关IPC的作用机制以及对肝功能的保护作用通过肝内何种物质起作用，还有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：第三军医大学科研基金资助项目
作者简介：杨恒文(1944-)，女，辽宁省本溪市人，高级实验师，主要从事创伤方面的研究，发表论文23篇。
参考文献：
[1]Jaeschke H，Farhood A，Smith C W.Functional inactivation of neutrophils with a Mac-1(CD11b/CD18) monoclonal antibody protects against ischemia-reperfusion injury in rat liver[J].Hepatology,1993，17(5):915-923.
[2]Lawson C S,Downey J M.Preconditioning:State of the art myocardial protection[J].Cardiovasc Res,1993，27(3):542-550.
, 百拇医药
[3]Esklidsen-Helmond Y E,Van-Heugten H A,Lamers J M.Regulation and functional significance of phospholipase D in myocar-dium[J].Mol Cell Biochem,1996，157(1):39-48.
[4]Liu X H.General biological phenomenon and its mechanism[J].Prog Physiol Sci,1998，29(1):39-41.
[5]乌立晖，张宝仁，朱家麟，等.缺血预处理对大鼠心肌细胞超微结构的保护作用[J].第二军医大学学报，1998,19(2):159-162.
[6]Moritaka G,Yoshiyuki T,Sunao K,et al.Endothelin-1 is involved in the pathogenesis of ischemia/ reperfusion liver injury by hepatic microcirculatory disturbances[J].Hepatology，1994，19(3):675-681.
收稿日期：1999-12-03
修回日期：2000-04-28, http://www.100md.com
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第三研究室，重庆 400042
关键词：缺血再灌注；缺血预处理；乳酸脱氢酶；过氧化物酶
第三军医大学学报001107
提 要：目的 观察缺血预处理(IPC)对肝脏缺血再灌注(I/R)损伤后肝功能的保护作用。方法 大鼠48只随机分为I/R组和IPC组。观测缺血后的肝脏谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、髓过氧化物酶(MPO)及肝组织的病理变化。结果 ALT在I/R组各时相点比缺血前升高47%～58%，而IPC组仅在缺血后24 h升高20%；LDH在I/R组与缺血前比较1、6、24 h均升高(P<0.01)，IPC组仅在缺血6 h较缺血前升高(P<0.05)；I/R组MPO与IPC组比较有显著增高(P<0.05)。病理检查IPC组比I/R组肝细胞损伤减轻、坏死范围小。结论 IPC可以减轻再灌注对肝脏的损伤，减少LDH的漏出和MPO的生成，而保护肝功能。
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中图法分类号：R459.9;R619.9;R657.3 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)11-1039-03
Protective effects of ischemic preconditioning on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats
YANG Heng-wen,DU Xiao-lan,ZENG Lin,LIAO Wei-hong
(Research Institute of Field Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)
Abstract：Objective To study the protective mechanism of ischemic preconditioning on the liver function in hepatic ischemia-reperfusion injury.Methods Forty-eight rats were randomly divided into:ischemia-reperfusion group (I/R) in which hepatic arteries had been occluded for 1 h and ischemic preconditioning group (IPC) in which the arteries were ligated for 1 h after 10 min occlusion and 10 min release for 3 times.Serum alanine transferase (ALT),lactic dehydrogenase(LDH),medulla peroxidase(MPO) were measured and pathological changes of the liver were observed.Results The serum ALT content was increased by 47%～58% at time points of group I/R than that before ischemia,but only by 20% at the 24 h post-ischemia in group IPC.The LDH content was increased at hour 1,6,24 in group I/R compared with that before ischemia (P<0.01),and at 6 h after ischemia compared with that of the normal in group IPC (P<0.05).The MPO content was obviously increased in group I/R than in group IPC (P<0.05).Compared with group I/R,group IPC showed less hepatocyte injury,smaller necrotic area in the livers.Conclusion Preconditioning can relieve ischemia-reperfusion injury in the liver,decrease the leakage of LDH and inhibit the formation of MPO,thus it has a protective effect on hepatic function.
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Key words:ischemia-reperfusion;ischemic preconditioning;lactic dehydrogenase;medullas peroxidase
缺血预处理(Ischemic preconditioning,IPC)能调动组织器官内源性保护机制，在多种动物的心肌再灌注模型中已得到证实。但IPC对实质性脏器功能的保护效应尚未见报道。设计本实验旨在观察IPC对肝脏功能的保护作用，其研究结果如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选择健康大鼠48只，雄雌各半。将动物随机分成2组，I/R组和IPC组，每组24只。观察时相为缺血前、缺血后1、3、6、24 h 5个时相。
1.2 致伤方法
用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹部正中切口，暴露肝固有动脉和门静脉。I/R组直接用无损伤动脉夹阻断血流，缺血时间为1h；IPC组先阻断血流10 min，然后放开血管夹10 min，反复3次后再阻断血流1h。
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1.3 肝功能测定
采用国产生化测定仪，在不同时相点，由颈外静脉插管到下腔静脉，取回心血液2ml，分别测定谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)。
1.4 肝组织中髓过氧化酶(MPO)的测定
取肝组织100 mg，加匀浆液2ml，4℃下离心30 min，3000 r/min。取上清液0.1 ml，放冰箱保存。样本采集到一定数量后，常温复融后再加反应液2.9 ml(成分为磷酸邻联二茴香胺O-dianisidine 167 mg，H2O2 5 mg，50 mmol/L PBS 100 ml)，保持25 ℃水中立即在紫外分光光度计下进行460 nm，2 min扫描，测波长(30～90 s)。1 min内吸光度变化代表酶活力。
1.5 病理检查
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肝组织用石蜡包埋，组织切片后用HE染色，在光镜下观察。
1.6 统计学处理
实验数据以
±s表示，进行t检验。2 结果
2.1 肝功能测定
ALT是反应肝功能的最灵敏的指标，肝脏缺血时出现也比较早。本实验在肝脏I/R组和IPC组各时相点均测定了ALT，I/R 组缺血后各时相点较缺血前升高47%～58%。而预处理组在24 h时有20%升高，其它都在正常范围内。TBIL和TP两项差异不显著。LDH∶I/R组1、6、24 h与伤前比较差异均显著，与预处理比较差异亦显著P<0.05，LDH在预处理与伤前比较除6 h时相点有显著差异外，1 h和24 h无显著差异,见表1。
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表1 缺血和缺血预处理后肝脏LDH含量的变化(U/L，
±s)Tab 1 Changes of LDH contents in the liver following ischemia
and ischemia/preconditioning(U/L，
±s)Time after reperfusion (h)
Group
n
Preischemia
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1
6
24
Ischemia
6
303 3.3±48
420 3.3±59* △
746 8.3±82* △
570 6.7±99* △
Preconditioning
6
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303 3.3±48
334 0.0±60.5
519 6.7±96△
352 5.0±62
*:P<0.05 vs preconditioning； △:P<0.05 vs preischemia
2.2 肝组织中MPO
肝缺血再灌注损伤时MPO增高。与损伤前比较各时相点统具有非常显著差异(P<0.01)。缺血损伤组与预处理组除24 h无显著差异外，其它各时相均有显著差异。预处理组与伤前比较亦有显著差异，见表2。
表2 缺血和缺血预处理后肝脏MPO含量的变化(
±s), http://www.100md.com
Tab 2 Changes of MPO contents in the liver following ischemia and ischemia/preconditioning(
±s)Time after reperfusion(h)
Group
n
Preischemia
1
3
6
24
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Ischemaia
5
0.0381±0.006
0.1041±0.010* △
0.1065±0.011* △
0.1114±0.030* △
0.0886±0.019△
Preconditioning
5
0.0381±0.006
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0.0846±0.011△
0.0898±0.013△
0.0794±0.021△
0.0776±0.016△
*:P<0.05 vs preconditioning； △:P<0.05 vs preischemia
2.3 病理变化
肝缺血再灌注24 h的病理变化是肝细胞肿胀，结构紊乱，排列不整齐。增大的肝细胞胞浆淡染，核大而浓染。有散在的肝小叶中心坏死。经预处理后的肝细胞肿胀减轻，肝细胞坏死范围缩小。
3 讨论
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I/R损伤在多种器官和组织已得到了证实。Jaeschke等[1]阻断小鼠肝脏血流45 min,建立肝缺血模型,检测到肝组织双相损伤。Myagkaya等观察到在常温下肝缺血60～90 min，内皮细胞就可能发生不可逆损伤，而肝细胞在缺血90～120 min则出现不可逆性损伤。本实验中在预实验时做肝缺血90 min有80%的动物死亡，这与文献报道基本一致。所以实验时肝缺血时间选择60 min，以造成可逆性损伤。
IPC文献报道有多种，有缺血2.5 min再灌注1次，也有3.5 min再灌注1次，最长者达到25 min再灌注1次。IPC的使用有1次，也有2次,多则4次5次。Lawson等[2]认为小鼠1次预处理不可能调动其缺血预处理保护机制，至少要2次缺血才能有效。本实验采用3次预处理,其结果比较理想。
肝脏缺血再灌注后肝细胞发生一系列代谢、结构和功能的损伤，结果导致肝功能的衰竭，转氨酶升高，LDH漏出增多[3，4]。本实验结果也证实了这些变化。表现ALT、LDH、MPO均明显升高。组织病理学检查肝组织有明显病理变化，IPC组各种变化均比 I/R轻,证实IPC对肝缺血损伤保护效果确实明显 。这对提高临床器官移植手术的成功率是一种有益的方法。由于缺血缺氧肝血管床的损伤，微血管通透性升高，中性粒细胞浸润，组织MPO活性升高，内分泌功能紊乱。MPO和细胞毒性物质引起肝组织再损伤，经缺血预处理后再缺血,能提高肝脏对缺血的耐受性，减轻再灌注损伤，它能减少LDH漏出和MPO释放[5，6]。有的学者认为IPC可能是一种比用抗氧化剂、清除剂或抗嗜中性白细胞粘附剂等更好的方法。以上结果表明：预处理能增强肝组织对缺血的适应性，减少LDH漏出和抑制MPO的产生，减轻肝细胞损害。有关IPC的作用机制以及对肝功能的保护作用通过肝内何种物质起作用，还有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：第三军医大学科研基金资助项目
作者简介：杨恒文(1944-)，女，辽宁省本溪市人，高级实验师，主要从事创伤方面的研究，发表论文23篇。
参考文献：
[1]Jaeschke H，Farhood A，Smith C W.Functional inactivation of neutrophils with a Mac-1(CD11b/CD18) monoclonal antibody protects against ischemia-reperfusion injury in rat liver[J].Hepatology,1993，17(5):915-923.
[2]Lawson C S,Downey J M.Preconditioning:State of the art myocardial protection[J].Cardiovasc Res,1993，27(3):542-550.
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[3]Esklidsen-Helmond Y E,Van-Heugten H A,Lamers J M.Regulation and functional significance of phospholipase D in myocar-dium[J].Mol Cell Biochem,1996，157(1):39-48.
[4]Liu X H.General biological phenomenon and its mechanism[J].Prog Physiol Sci,1998，29(1):39-41.
[5]乌立晖，张宝仁，朱家麟，等.缺血预处理对大鼠心肌细胞超微结构的保护作用[J].第二军医大学学报，1998,19(2):159-162.
[6]Moritaka G,Yoshiyuki T,Sunao K,et al.Endothelin-1 is involved in the pathogenesis of ischemia/ reperfusion liver injury by hepatic microcirculatory disturbances[J].Hepatology，1994，19(3):675-681.
收稿日期：1999-12-03
修回日期：2000-04-28, http://www.100md.com