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编号:10227534
富集CD34+细胞作干细胞移植的临床初步探索
http://www.100md.com 《中国医学杂志》 2000年第11期
     作者:董陆佳 陈虎 江岷 胡亮钉 张伟京 鲍云华 俞受程 宋三泰 秦茂权 俞志勇 陈喜林 吴世凯 曹履先 朱平

    单位:董陆佳(北太平路医院骨髓移植病房100039)陈虎(北太平路医院骨髓移植病房100039);江岷(北太平路医院骨髓移植病房100039);胡亮钉(北太平路医院骨髓移植病房100039);秦茂权(北太平路医院骨髓移植病房100039);俞志勇(北太平路医院骨髓移植病房100039);曹履先(北太平路医院骨髓移植病房100039);张伟京(肿瘤病房);鲍云华(肿瘤病房);俞受程(肿瘤病房);宋三泰(肿瘤病房);陈喜林(肿瘤病房);吴世凯(肿瘤病房);朱平(北京大学第一医院)

    关键词:移植;自体;HLA抗原;肿瘤

    中华医学杂志001112

    【摘要】 目的 观察富集CD34+的造血干/祖细胞做肿瘤患者同种异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)和自体移植的临床疗效。观察输注纯化CD34+细胞患者的预后情况。方法 采用磁分选临床型细胞富集仪将表面包被有CD34单抗的磁性微球体系与细胞共同培养,特异性结合CD34+细胞。在磁场作用下分别收集CD34+和CD34-组分。完成20例患者CD34+细胞体外纯化富集。其中HLA半相合移植5例,自体移植15例。结果 纯化后CD34+细胞纯度达97%以上,移植CD34+细胞中位数5.72(0.15~12.0)×106,CD34+细胞中位数3.73(2.6~6.8)×104; CD34-细胞(CD3、CD4、CD8、CD19)对数去除率(Log,下同)为1.99~5.0。19例患者移植后随访11个月(中位数,1~20),总体生存13/19(例)。本院11例中,总体生存为8/11(例),其中HLA半相合1/3(例),自体移植7/8(例)。移植后造血重建迅速,随访18个月以上无病生存者3例中1例为同种异基因HLA半相合亲属移植,2例为肿瘤自体移植。1例父子间HLA半相合移植, 白细胞恢复>1×109/L, 血小板>20×109/L(均为移植后第13天)。仅有短暂的I度移植物抗宿主疾病。2例自体移植病例白细胞恢复>1×109/L(8~26 d),血小板恢复>20×109/L(22~35 d)。结论 无论是异体或自体移植,CD34+细胞移植后造血重建迅速,其白细胞, 血小板恢复天数同外周血移植。
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    Selected CD34+ cells transplantation: a primary clinical report

    DONG Lujia CHEN Hu JIANG Min

    (Bone Marrow Transplantation Center, North Taiping Hospital, Beijing 100039, China)

    【Abstract】 Objective CD34+ is an immunophenotype of hematopoietic stem cells/progenitors. CD34+ cells selection in vitro may deplete T-cells 4-5 logs and tumor cells 3-4 logs. It will benefit to mismatched related donor allo-transplantation and autologous transplantation of tumor diseases. Methods 19 patients aged 29 (5~52) years were treated by allo- (n=5) or auto-PB CD34+ cells transplantation (n=14). Grafts from fifteen patients with various disorders (3 lymphomas, 6 multiple myelomas, 2 SLE, 1 Sjogren's syndrome, 2 breast cancer and 1 medulloblastoma) and five haploidentical donors for leukemia patients (1 ALL-CR2, 2 AML-rel, 1 CML-CP and 1 MDS-RAEB) were isolated using magnetic-activated cell sorting (CliniMACS, Milteny Biotech, Germany). Results After separation, purity of CD34+ cells was >97 %. Depletion of CD34 negative cells was extensive: CD3+ 2.6~4.6 logs, CD4+ >5 logs, CD8+ 4.6- > 5 logs, and CD19+ 1.2~3.1 logs. 19 patients who received selected CD34+ cells transplantation (CD34+CT) were followed up for 11(1~20) months. Overall survival(OS) was 13/19 (68.4%) cases. 1/5 patients with haploidentical transplant had disease free survival for 19 months. 12/14(85.7%) auto-CD34+CT achieved overall survival(OS). Conclusion Selected CD34+ cells transplantation significantly decreases the incidence of >Ⅱ GVHD and depletes tumor cell contamination. This approach may be useful to haploidentical or unrelated donor transplantation. It also benefits autologous transplant in various tumor disorders.
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    【Key words】 Transplantation, autologous; HLA antigens; Neoplasms

    造血干细胞移植是恶性血液病和某些实体瘤的主要治疗手段之一。造血干/祖细胞主要存在于CD34+细胞,移植物经阳性选择CD34+细胞的方法去除CD34-肿瘤细胞,有可能使那些肿瘤伴骨髓浸润的患者重获康复。耐药病例早期施行大剂量强烈化疗加用CD34+移植,可望延长生存期。1997年国外77个研究单位相继报道了623例异体CD34+细胞移植。我院自1998年引进临床型CD34+细胞体外纯化富集仪之后,至今已应用于人类白细胞抗原(HLA)半相合异体移植和自体移植。现将初步临床移植结果报道如下。

    对象和方法

    一、病例选择
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    自1998年12月以来完成20例患者CD34+细胞体外纯化富集,其中同种异基因HLA半相合亲属移植5例(急性粒细胞白血病复发难治型2例,急性淋巴细胞白血病,慢性粒细胞白 血病,骨髓增生异常综合征各1例);自体移植15例(淋巴瘤3例,多发性骨髓瘤6例、乳癌ⅡA 2例、髓母细胞瘤Ⅳ 1例、红斑狼疮2例、Sjogren's综合征1例)。患者年龄29(5~52)岁;男女比例1.5∶1;已完成CD34+细胞临床移植19例(1例淋巴瘤完成CD34+细胞体外纯化富集后因故未行移植)。其中在本院住院11例(HLA半相合移植3例,肿瘤自体造血干细胞移植8例),其中3例随访18个月以上。

    二、CD34+细胞纯化富集

    收集经CS 3000白细胞分离机采集的外周血白细胞,根据单个核细胞计数(MNC),CD34+ 细胞检测结果,算出CD34+ 细胞数;然后用含人血清白蛋白的PBS /EDTA缓冲液进行稀释。调整细胞悬液中MNC数量4×1010,其中CD34+ 细胞约4×108;加入CD34单抗,室温条件下共培养30 min,洗涤2次;经磁分选临床型细胞富集仪分选:选择细胞分离程序;样品上柱;启动自动分选程序;完成分选之后,取下CD34+ 细胞富集袋,分别检测CD34+ 组,CD34- 组以及洗脱液中各组细胞亚群的百分比,绝对数量,细胞活率。计算出MNC总量和CD34+ 细胞总量,回收率,纯度等指标。
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    三、临床移植观察

    1.异体移植:患者经预处理后输入纯化的CD34+ 细胞,无移植物抗宿主疾病(GVHD)预防用药,第6天应用造血生长因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF);观察造血重建天数,植入率以及GVHD发生率及严重度。移植物抗白血病(GVL)效应。后期监测指标包括:慢性GVHD,恶性疾病复发率,无病生存期以及总体生存率等。

    2.肿瘤自体移植: 患者经大剂量放疗+化疗或全身化疗方案预处理后,回输自体纯化的CD34+ 细胞,观察造血恢复天数,随访指标:肿瘤微小残留疾病监测,肿瘤复发率无病生存率以及总体生存率。

    3.移植后供/受者嵌合状态检测:供/受者性别不同时,采用细胞遗传学检测,分析性染色体比例;供/受者性别相同时通过微卫星基因分析(DNA指纹图)作为移植证据。供/受者血型不相合时,也采用红细胞血型检测。
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    结果

    一、CD34+ 细胞磁分选效果

    20例患者移植物经处理后,CD34+ 细胞纯度>97%、CD34-细胞对数去除率(CD3、CD4、CD8、CD19)Log1.99~5 Log,移植CD34+ 细胞中位数5.72(0.15~12.0)×106,CD3+细胞中位数3.73(2.6~6.8)×104; 移植后造血重建迅速。

    二、随访结果

    19例患者移植后随访11(中位数,1-20)个月,总体生存率13/19(例)。其中,HLA半相合移植1/5(例),肿瘤自体移植12/14(例),在住院的病例中,总体生存为8/11(例),其中HLA半相合为1/3(例),自体移植7/8(例)。
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    三、典型病例分析

    HLA半相合移植病例1 男,11岁,急性淋巴细胞白血病(急淋)二次缓解(ALL-CR2), 1993年12月始无诱因发热,颈侧淋巴结肿。1994年3月经骨髓穿刺诊为急淋(ALL-L1),经环磷酰胺、长春新碱、柔红霉素、强的松(CODP)1个疗程获完全缓解,白细胞最高为13×109/L,无纵膈增宽,肝脾均不肿大,经序贯联合化疗3年,腰穿鞘内注射及颅脑脊髓照射维持持续缓解。至1998年4月出现睾丸及中枢神经系统白血病(CNSL),随后血液系统白血病复发,再次经CODP+左旋门冬酰胺酶 1疗程获二次缓解,为寻求根治性治疗要求父给子的HLA半相合移植。移植前诊断:(1)ALL-L1 二次缓解;(2)CNSL颅脑脊髓放疗后早期复发;(3)睾丸白血病放疗后;父子HLA配型如表1所示。

    表1 例1 HLA半相合异体移植患者供受者HLA配型

    年龄
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    关系

    HLA-B

    B

    DRB1

    DQB1

    DPB1

    受者

    11

    患者

    11,;

    38,75(15);

    16,15;

    05,06;
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    5,;

    供者

    37

    父亲

    11,;

    38,62(15);

    16,04;

    05,03;

    5,4;

    供者经G-CSF 300 μg 1次/d、皮下注射、6天动员,采集两次外周血细胞(PBPC),供者细胞70 ml用于CD34+ 细胞体外纯化富集,处理前后细胞表型分析, 细胞分选效果如表2所示。表2 例1HLA半相合异体移植细胞细胞富集仪分选纯化处理前后比较 分型
, 百拇医药
    处理前

    处理后

    纯化效果

    采集细胞(108)

    平均数(106/kg)

    获得细胞(106)

    平均数(104/kg)

    纯化率(%)

    回收率(%)

    去除率(log)

    CD34
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    3.696

    9.7

    183

    483

    97.1

    49.59

    -

    CD4

    114.35

    300.9

    0

    0

    -
, 百拇医药
    0

    >5

    CD8

    72.38

    190.5

    0.189

    0.497

    -

    0.000 026

    4.58

    CD3

    207.1

    545
, 百拇医药
    0.566

    1.49

    -

    0.000 02

    4.56

    CD19

    55.83

    146.9

    4.9

    12.9

    -

    0.000 878

    3.1
, 百拇医药
    MNC

    385

    9.73

    188.6

    496

    -

    0.005 4

    2.3

    注:平均细胞数/kg按照可回输患者的体重计算;MNC:单个核细胞 分选之后CD34+ 细胞纯度由0.9%~1.2 % 提高到97.1 %;而CD34- 细胞获3.1~>5个对数的去除。预处理采用环磷酰胺(CY) 60 mg /kg(2 d),全身照射(TBI )5 Gy(2 d),卡氮芥(BCNU )500 mg/m2。输入供者MNC 4.96×106/kg, CD34+ 细胞总量4.82×106/kg,CD3+细胞总量1.49×104/kg。GVHD预防采用环孢霉素A和氨甲喋呤(MTX)。移植后13 d造血重建。14~15 d,出现双手背及两侧骼前皮肤局限性皮疹,病理活检证实为Ⅰ度GVHD,皮疹面积<1%。由于移植21 d后出现继发性移植排斥,血象减低,故于移植后51 d给予行二次移植,移植前给CY 40 mg /kg×2次,0 d(一次移植后51 d)给予冷冻的动员后外周血干细胞30 ml; 及移植后1 d(52 d)给予供者骨髓400 ml; 回输MNC 3.63×108/kg, CD34+细胞总量9.9×106/kg,CD3+细胞>13.2×106/kg; 移植物未经体外处理。2次移植后15 d造血重建,随访2个月无急性GVHD,经指纹图谱分析供受者血样证实植入成功。2次移植后51 d出院,出院时血红蛋白67 g/L,血小板59×109/L,白细胞4.9×109/L,骨髓增生活跃。19个月仍无病生存(DFS)。血红蛋白101~118 g/L,白细胞5.7~7.3×109/L,血小板109~120×109/L。
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    自体移植:病例1 男,49岁,多发性骨髓瘤 病史40个月。患者于1995年8月发病。CT扫描示胸5椎体肿瘤,脊柱压迫症,1995年11月17日行胸5椎体病灶清除术。经M2,长春新碱、博来霉素、阿霉素(VDD)等联合化疗18个疗程,胸椎放疗DT 4 000 cGy,DA 6 400 cGy后IgG 仍58 g/L,骨髓瘤细胞3%~13%。多发性骨髓瘤未缓解。行外周血干细胞动员采集,G-CSF 500 μg皮下注射1次/d(8 d),MNC 5.9×108/kg, CD34+ 细胞0.46×106/kg。CD34+ 细胞体外纯化富集, 获CD34+ 细胞0.295×106/kg,回收率64%。CD34+、CD34-细胞组分及第3次采集之细胞分别冷冻保存。移植经马法兰200 mg/m2(总量350 mg)单药口服预处理,次日回输CD34+ 细胞0.295×106/kg。移植后5 d始用G-CSF 300 μg皮下注射1次/d;移植后10 d出现发热寒战,抗感染后症状控制,移植后45 d血象白细胞>2.0×109/L, 血小板>40×109/L。骨髓增生减低。移植后20个月一般情况稳定,骨髓象正常。
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    自体移植:病例2 男,23岁,淋巴瘤 患者于1997年7月始出现右颈部无痛性包块,经病理活检诊断为霍奇金病结节硬化型ⅡA,联合化疗6个疗程达完全缓解,停药2个月后右颈包块复发,再用CHOP,COAP+鬼臼乙甙两周达完全缓解,1998年10月始先后出现右腋下、右颈部、右胸壁包块,伴右壁疼痛。经化疗和G-CSF动员方案, 行外周血干细胞动员采集两次。 CD34+ 细胞体外纯化富集后检测CD34+,CD34-以及洗脱液中各组细胞亚群,MNC总量和CD34+ 细胞总量,回收率,纯度等指标。细胞冷冻保存。二次入院后给CBV预处理方案后回输自体CD34+ 细胞,MNC总量为3.04×106/kg及CD34+ 细胞2.99×106/kg。移植后8 d造血恢复,术后行右肩、右胸壁肿物局部电子线治疗。移植后17个月病情稳定,骨髓象正常。

    讨论
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    CD34+ 细胞移植自1994年首次应用于临床移植以来,已在同种异基因移植以及自体移植方面有了显著发展[1-6]。新近,CD34+ 细胞移植应用于HLA不全相合,半相合亲属供者移植以及HLA相合无关供者移植例数逐渐增加。在拓宽亲属供者来源(HLA位点不相合或半相合移植)以及提高无关供者移植安全性方面做出了许多成功的尝试[7,8]。我们用临床型CD34+ 细胞体外纯化富集仪为20例患者做干细胞移植,移植物经处理后,CD34+ 细胞纯度>97%、CD34-细胞去除率Log1.99~5,符合临床移植需要;在HLA半相合移植中,由于体外CD34+ 细胞纯化富集的应用,CD3+细胞控制在104/kg水平,故临床仅表现为0~I度GVHD,移植安全性好。无论是异体或自体移植,CD34+ 细胞移植后造血重建迅速,其白细胞、血小板恢复天数同外周血移植。我国每年需要同种异基因造血干细胞移植的病例中,找到HLA完全相合的供者比例很低。今后寻找供者的工作更为困难。在我国一对夫妇只要一个子女的国情条件下,着力研究HLA不完全相合,半相合以及无关供者同种异基因移植势在必行。纯化的CD34+ 细胞移植,可降低此类高危移植的危险性,降低GVHD的发生率和严重度,从而拓宽移植供者的选择范围。采用体外阳性选择CD34+ 造血干/祖细胞进行临床移植,由于肿瘤细胞和成熟的免疫活性细胞(T细胞)无此种表面抗原表达,故而经此种体外纯化富集处理可去除移植物中肿瘤细胞污染,降低自体移植后肿瘤复发率。CD34+ 自体移植适用于轻-中度骨髓或外周血肿瘤污染的恶性疾病(CD34-);拓宽自体造血干细胞移植的适应范围;移植后造血重建迅速且基本不影响免疫重建。
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    参考文献

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    5,Gazitt Y, Reading CC, Hoffman R, et al. Purified CD34+ Lin- Thy+ stem cells do not contain clonal myeloma cells. Blood , 1995,86:381-389.

    6,董陆佳.肿瘤大剂量化疗加自体移植研究进展——第38届美国血液学年会介绍. 中华肿瘤杂志, 1997,19:398-400.

    7,董陆佳.异基因骨髓移植的研究概况——第39届美国血液学年会介绍. 中华血液学杂志,1998,19:667-669.

    8,Handgretinger R, Schumm M, Lang P, et al. Transplantation with megadoses of haploidentical mobilized stem cells highly purified by magnetic-activited cell sorting. Blood ,1998,92 suppl1:688a.

    (收稿日期:1999-09-16), 百拇医药