无菌性松动假体周围界膜的组织学及超微结构特征
作者：蔡胥 王继芳 卢世璧 张笑明 赵斌
单位：蔡胥(中国人民解放军总医院骨科 北京100853)；王继芳(中国人民解放军总医院骨科 北京100853)；卢世璧(中国人民解放军总医院骨科 北京100853)；赵斌(中国人民解放军总医院骨科 北京100853)；张笑明(中国人民解放军总医院病理科)
关键词：假体失效；骨质溶解；肉芽肿；异物；滑膜；粒子大小
中华医学杂志001108
【摘要】 目的 观察假体周围界膜的组织学及超微结构特征，探讨磨损颗粒在人工关节无菌性松动中的作用。方法 对51例于我院行翻修术患者的无菌性松动人工髋关节假体周围界膜组织切片作HE、番红O-亮绿染色及CD68免疫组织化学染色，光镜下观察界膜组织学构成、磨损颗粒种类、分布及其聚集部位的组织学特征，测量颗粒长短径，计算CD68阳性细胞数。TEM下观察界膜细胞超微结构及被MΦ吞噬颗粒的特征，并测量其长短径。结果 界膜由纤维基质、成纤维细胞、MΦ和异物巨细胞等构成，其中MΦ占23%±5%(x±s)。在溶骨区贴假体或骨水泥侧的界膜中可聚集大量超高分子聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、钛合金或钴铬合金颗粒，呈慢性异物炎症反应。细胞外颗粒多数在15 μm以下，被MΦ吞噬者几乎全部小于1 μm。同一MΦ内溶酶体中可存在多种颗粒。非骨溶解部位界膜中无磨损颗粒，并形成纤维-软骨样组织。结论 界膜中的多种磨损颗粒与界面骨溶解及纤维组织增生有关，是人工关节无菌性松动过程中的重要生物学因素。
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Histological and ultrastructural characteristics of interface membrane around aseptically loosened prostheses
CAI Xu WANG Jifang LU Shibi
(Department of Orthopaedics, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effect of wear particles on prosthetic loosening by analyzing the histological and ultrastructural characteristics of interface membrane around aseptically loosened prostheses. Methods Slices of interface membranes around aseptically loosened hip prostheses of 51 cases were stained with HE, Safranin O-Briliant green and CD68 Mab immunohistochemical technique respectively. The histological structure of the membranes and the kinds of wear particles and their distribution characters were observed. The size of particles and the number of CD68 positive cells were measured. Ultrastructure of cells in the membrane and the characters and size of the particles phagocytozed by MΦ were also observed and measured. Results Interface membrane consisted of fibromatrix, fibroblasts, MΦ[CD68 positive, occupying (23±5)% (x±s)], and foreign body giant cells. In the membranes at the site of osteolysis, great amount of UHMWPE particles, PMMA particles and Ti alloy or CoCr alloy particles collected at the side attaching to the implant and caused chronic foreign body inflammatory reaction. Most of the particles outside MΦ were less than 15 μm while that inside MΦ were less than 1 μm. Different kinds of wear particles could exist in the lysosomes of one MΦ. No particles but cartilage-like tissues appeared in the membranes at the site without osteolysis. Conclusion Wear particles in the interface membrane have relations with osteolysis and fibrous tissue proliferation at bone-implant interface, which plays an important role in aseptic loosening.
, 百拇医药
【Key words】 Prosthesis failure； Osteolysis； Granuloma, foreign-body； Synovial membrane； Particle size
由于对无菌性松动人工关节行翻修术时常在骨-骨水泥或骨-假体界面，特别是在骨溶解部位发现一层滑膜样纤维组织界膜，故国外对该膜的组织学特征已有较多研究[1]，但国内对松动的国产人工髋关节界面组织情况报道较少[2]。作者从组织学和超微结构两个方面对此作了进一步观察。
对象和方法
一、组织来源
界膜标本取自51例于我院行翻修术患者的无菌性松动人工髋关节假体周围，留取其中骨水泥固定髋臼界膜9份，无骨水泥固定髋臼界膜5份，骨水泥固定股骨柄界膜20份，无骨水泥固定股骨柄界膜10份，体积分数为10%的甲醛固定。每份标本另切取约2 mm×2 mm×2 mm的界膜于体积分数为3%的戊二醛中固定。
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二、标本处理
所有标本均取样常规制片，HE染色。对初步观察含软骨样组织的非溶骨区界膜行番红O-亮绿染色。取溶骨区界膜切片，以预聚合SABC法，作CD68免疫组织化学染色。常规制备透射电镜(TEM)切片。
三、镜下观察
光镜下观察界膜的组织学构成，磨损颗粒的种类、分布及其聚集部位的组织学特征。100倍油镜下随机选取含颗粒标本中10个视野，每个视野随机测出100枚颗粒的长短径，取均值。在CD68免疫组织化学染色切片中随机选取10个视野，各计100个细胞中的阳性细胞数，取均值获得巨噬细胞(MΦ)所占比例。观察CD68阳性MΦ的分布及其与磨损颗粒的关系。TEM下观察界膜细胞的超微结构特征，测量MΦ内磨损颗粒的大小。
四、统计学处理
镜下测得磨损颗粒长短径及CD68阳性细胞数均以
±s表示。
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结果
一、界膜组织构成
界膜主要由纤维基质、单核和多核组织细胞以及慢性炎细胞构成，可形成一些皱褶或乳头状突起，与OA滑膜有相似之处。髋臼和股骨柄假体周围界膜无明显差别，可分为3层结构(图1)。贴假体或骨水泥的表层由1～5层椭圆形或圆形细胞排列而成，类似滑膜内衬层。溶骨区界膜该层细胞多而密集，与其下层分界不清，而非溶骨区则仅有1～2层扁平细胞。中层为疏松纤维基质，溶骨区该层血管丰富，细胞量大且多种细胞成分混杂，主要有成纤维细胞、MΦ和异物巨细胞等，可聚集大量磨损颗粒。在微血管或淋巴管附近常可发现散在的含颗粒MΦ。非溶骨区该层较薄，组织细胞少，颗粒不多或无。外层贴骨侧由纤维细胞和大量胶原纤维构成，纤维之间也可存在大量颗粒。在溶骨区，界膜的中层可延续至此，未见典型的破骨细胞样细胞。非骨溶解部位可有含软骨细胞样细胞的不成熟软骨组织与假体侧纤维组织相延续并密切交织，其中未见任何磨损颗粒。用番红O-亮绿染色时，呈绿色的纤维组织与呈红色的软骨样组织形成鲜明的对比，两者之间交织的部位为浅色的过渡区(图2)。
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在一些界膜的内、中层，可见散在的T、B淋巴细胞，但它们更多的是聚集在一起形成细胞巢，状如淋巴结的生发中心，其位置与磨损颗粒的聚集区无必然联系。
二、磨损颗粒形态
磨损颗粒主要集中在界膜的中层，在远离关节面的部位较少或无，其分布与假体周围骨溶解的好发部位和严重程度相符。骨溶解部位还可见磨损颗粒进入骨小梁之间，并同样引起组织细胞反应。
金属颗粒呈黑色，微小颗粒辨别不清晰，较大颗粒主要呈鳞片状或短棒状，部分呈针状。数量少时散在(图1)或被MΦ吞噬，数量较多时则常聚集在一起，被MΦ、成纤维细胞和纤维基质包绕形成许多较大的颗粒巢，其长轴与界膜延伸方向一致。若颗粒数量巨大，如肉眼所见黑碳状界膜中，则全层均有连续或间断的大片颗粒巢，甚至不能辨别组织细胞形态(图3)。钛(Ti)合金颗粒数量明显多于钴铬(CoCr)合金颗粒。有些Ti合金颗粒分布区并无明显的MΦ聚集和组织细胞反应，而CoCr合金颗粒周围一般都有慢性炎症反应表现，而且还可出现无结构的透明变性区域，它的出现似与颗粒数量和聚集部位没有明显关系(图4)。
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超高分子聚乙烯(UHMWPE)颗粒具有双折光性，仅在偏振光镜下可见。有的溶骨区界膜组织在普通光镜下不见任何颗粒，仅有明显的炎症反应(图5a)，但偏振光镜下则发现有大量UHMWPE颗粒存在(图5b)。它们绝大部分呈细微的针状，一般散布均匀，不形成明显的颗粒巢，并且多数与金属或PMMA颗粒混合存在于界膜组织中，或同时被MΦ吞噬(图6a,b)，这在溶骨部位的界膜中较为典型。大UHMWPE颗粒呈“雪茄”样或丝状，可相互连接成巨大颗粒，多被异物巨细胞吞噬或包围(图7a,b)。大量异物巨细胞的出现是大UHMWPE颗粒存在的特征性标志，这在仅有微小金属颗粒的部位并不多见。
聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)颗粒呈棕褐色，圆形、长圆形或不规则形，明显大于金属颗粒。一般相对集中，呈巢状分布，由纤维基质和多种细胞包绕。同一颗粒巢中颗粒大小相差悬殊，小颗粒可被MΦ吞噬。一部分PMMA颗粒在标本处理过程中被有机溶剂溶解而在局部形成空白区(图8)。
三、磨损颗粒大小
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微小颗粒主要出现在无骨水泥固定假体周围界膜中，而大颗粒则在骨水泥固定的髋关节中更为多见，个别巨大颗粒超过1 000 μm，由异物巨细胞包绕。由于光镜分辨率有限，当颗粒径长小于0.5 μm时，即无法确切测量(表1)。
图1 界膜的3层结构。表层排列1～5层细胞，类似滑膜内衬；中层为疏松纤维基质，血管丰富，细胞成分混杂，可聚集大量磨损颗粒；外层由纤维细胞和胶原纤维构成，纤维之间也可存在大量颗粒 HE染色×20 图2 非溶骨部位含软骨细胞样细胞的组织(灰红色)与假体侧纤维组织(绿色)相延续并密切交织，未见磨损颗粒 番红O-亮绿染色×10 图3 Ti合金假体周围界膜全层均有大片颗巢，组织细胞形态不易辨别 HE染色×10 图4 存在CoCr合金颗粒的部位呈慢性炎症反应，可出现无结构的透明变性区域 HE染色×10
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图5 a. 有的溶骨区界膜组织在普通光镜下不见任何颗粒，仅有明显的炎症反应；b. 同一视野偏振光镜下则发现有大量UHMWPE颗粒存在 HE染色×40 图6 a. 有的溶骨区界膜组织在普通光镜下仅见MΦ吞噬大量金属颗粒；b. 同一视野偏振光镜下发现MΦ内同时存在大量微小的UHMWPE颗粒 HE染色×20 图7 a. 普通光镜下可见界膜组织中聚集的大量异物巨细胞；b. 同一视野偏振光镜下可见异物巨细胞中吞噬有巨大的UHMWPE颗粒 HE染色×20
图8 PMMA颗粒呈棕褐色，大小相差悬殊，小颗粒可被
MΦ吞噬，部分颗粒在标本处理过程中被有机溶剂溶解而在
局部形成空白区 HE染色×40
四、CD68阳性MΦ特征
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表1 界膜中磨损颗粒大小的光镜下测量结果(μm,±s) 颗粒种类
长径
短径
范围±s
范围±s
Ti合金
0.4～15
2.18±0.36
0.3～15
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1.64±0.31
CoCr合金
0.4～10
2.14±0.27
0.4～10
1.35±0.13
PMMA
0.5～25
5.61±0.36
0.5～20
4.57±0.30
UHMWPE(大)
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3～41
16.85±1.42
1～25
5.06±0.80
UHMWPE(小)
0.5～4
1.29±0.14
0.3～2
0.60±0.05
注：PMMA为聚甲基丙烯酸甲酯，UHMWPE为超高分子聚乙烯 在界膜组织细胞中所占比例为23%±5%(±s)，主要散在分布于界膜组织的内、中层，细胞形态、大小不一致，可为圆形、长圆形或梭形，有些阳性细胞可见其伸出的伪足。在有磨损颗粒的区域，阳性细胞有向颗粒聚集的趋势。可吞噬径长小于1 μm的微小颗粒，颗粒量大时细胞形态被遮盖而不易辨别。
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五、超微结构特征
界膜中MΦ呈椭圆形或不规则具伪足形，存在于不定形基质中，胞浆内含丰富的溶酶体和线粒体，内质网少，部分细胞内可见细胞骨骼系统。同一MΦ可吞噬至少一种磨损颗粒，有的MΦ内同时存在金属、UHMWPE和PMMA颗粒。后两种颗粒由于在标本处理过程中可被溶解，因而在颗粒位置形成空白区。被吞噬颗粒的形状主要为类圆形，金属颗粒可呈棱角形，而UHMWPE颗粒则为针、丝状。颗粒不论大小(表2)一般均与初级溶酶体结合形成次级溶酶体，同一溶酶体中亦可同时存在两种颗粒(图9)。
表2 界膜MΦ内磨损颗粒大小的电镜下测量结果(μm,±s) 颗粒种类
长径
短径
, 百拇医药 范围±s
范围±s
金属
0.067～
2.833
0.361±
0.021
0.067～
1.25
0.234±
0.012
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PMMA
0.208～
1.417
0.730±
0.082
0.083～
0.952
0.459±
0.052
UHMWPE
0.067～
0.417
0.210±
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0.023
0.033～
0.286
0.099±
0.014
图9 被MΦ吞噬的颗粒与初级溶酶体结合形成次级溶酶体，同一溶酶体中可同时存在两种颗粒 TEM×3 500
界膜中成纤维细胞呈梭形，边缘规则，胞浆内有较多粗面内质网，周围大量胶原纤维。纤维细胞胞浆极少，周围完全被胶原纤维包裹。两种细胞内均未见磨损颗粒。
讨论
一、界膜的组织细胞构成
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本组界膜的3层组织学结构与其他作者的描述基本相同[1]，它们与无菌性关节炎滑膜有许多相似之处，但细胞构成却相对复杂。
1.MΦ：为界膜中主要的浸润细胞。但MΦ的出现与磨损颗粒的存在密切相关，其重要特征是围绕磨损颗粒产生的慢性异物炎症反应。本组采用CD68单克隆抗体对界膜组织作免疫组织化学染色，得到与其他作者相似的MΦ形态，但CD68阳性细胞数量却少得多[3]，仅占细胞总数的约22.8%,造成这种差异的原因尚不清楚。
Goodman等[4]认为，被MΦ吞噬的颗粒并不能由溶酶体消化，它们最终仍将排入细胞外间隙中，随之排出的还有PGE2等炎性介质和可造成周围组织损害的水解酶等。而排出的颗粒仍能被其它MΦ吞噬，使该过程不断反复发生，从而引起局部骨溶解。
2.异物巨细胞：是本组界膜中含大颗粒区域的特征性标志[5]。
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3.成纤维细胞：由于本组CD68阳性MΦ较少，故界膜中成纤维细胞比例应相对较大。有作者认为，只有在MΦ被磨损颗粒激活后释放的某些细胞因子(如PDGF)介导下成纤维细胞才能实现组织修复的能力。
4.破骨细胞：可能是界膜中实际操作骨质溶解吸收的唯一细胞。相关研究表明[6]，界膜中的破骨细胞在抗原和功能上均与成熟MΦ相似,并可在合适的刺激因子作用下由MΦ前体衍化生成,其活化可能同样依赖于磨损颗粒激活MΦ而释放的生物活化物质。虽然Schuller等[7]发现所有的界膜贴骨面均存在具有破骨细胞特征的多核巨细胞密集区，但本组未能在界膜贴骨侧观察到典型的破骨细胞，其原因与本组界膜中CD68阳性细胞数少一样需作进一步探讨。
5.淋巴细胞：本组界膜中淋巴细胞的分布与磨损颗粒聚集区并无必然联系，因此即使淋巴细胞介导的免疫反应在颗粒物质引起的骨溶解吸收过程中起一定作用，也可能并非将磨损颗粒作为直接反应对象。最近，Goodman等[8]的研究也表明，T淋巴细胞并非聚乙烯颗粒诱导炎症反应所必需的，它可能仅与调节异物反应的强度有关。
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二、界膜中磨损颗粒的特征
1.种类：本组界膜中UHMWPE颗粒比金属和PMMA颗粒分布更为广泛，有后两种颗粒的部位总有UHMWPE颗粒存在，甚至可达假体的最远端，而且在有些骨溶解区内仅发现UHMWPE颗粒，提示其在假体-骨界面的生物学反应中可能起主要作用。
2.大小：对于颗粒的大小，因作者和测量方法的不同而存在差异。本组观察结果表明，各种颗粒径长小于15 μm的占绝大部分。许多微小颗粒(小于1 μm)在光镜下难以分辨，需在电镜下确认。因此，普通组织学观察未发现颗粒时，并不能完全排除其存在的可能。磨损颗粒可被吞噬的大小亦有不同观点，本组电镜下测量的结果表明，MΦ内的各种磨损颗粒几乎全部都在1 μm以下，大小范围比文献报告的5～12 μm[1]要小得多。有作者认为，吞噬磨损颗粒是MΦ激活的必要条件，但相反的观点则认为不同大小的磨损颗粒均可激活MΦ，只不过随着颗粒的增大，其激活能力逐渐下降，因而所致的生物学效应亦减弱[9]。
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3.数量：本组溶骨区界膜组织中光镜下可见的磨损颗粒数量与MΦ的数量直接相关，而骨溶解的程度又与MΦ的数量之间存在密切的关系。提示磨损颗粒在骨-假体界面组织中聚集的数量越多，引起的慢性异物炎症反应可能越强烈而持久。
三、两种固定方式界膜的差别
Horikoshi等[1]发现在无骨水泥固定股骨假体周围的界膜中微小聚乙烯和金属颗粒较骨水泥固定者更常见，这与本组微小颗粒主要出现在无骨水泥固定的髋关节中是一致的。有作者提出，骨水泥断裂、崩解产生的大PMMA碎屑可嵌入聚乙烯关节面中，关节活动过程中股骨头表面容易被其刮伤而变得粗糙，从而加重聚乙烯关节面磨损，使之更易产生大聚乙烯颗粒。因此，如果微小颗粒被MΦ吞噬是其激活和最终导致骨溶解的原因，则无骨水泥固定关节产生的小颗粒多就可能是其假体周围骨溶解发生率和无菌性松动率不低的原因之一。
四、界面组织的转归
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界膜除了可能在假体周围骨溶解过程中起重要作用外，其本身也可有多种转化方向。
1.坏死：本组观察表明,界膜的中、外层可存在透明变性和广泛的无结构坏死区。有作者认为，这是磨损颗粒特别是CoCr合金颗粒的毒性作用造成的。但是，本组界膜变性坏死区并不一定发生在颗粒聚集的部位，因而认为其发生原因尚需进一步探讨。虽然骨-假体界面组织细胞的坏死使局部溶骨因子的产生减少，但也可致溶酶体酶释放的增加，所以该过程对假体松动的作用尚不能确定。
2.增生：界膜中、外层胶原纤维组织大量增生也是本组普遍存在的现象。Maloney等[10]在体外研究中发现，金属颗粒可直接刺激成纤维细胞增生并分泌胶原。另一方面，许多作者认为[11]磨损颗粒致MΦ激活后释放的多种强力成纤维细胞分裂原(如IL-1和PDGF)可刺激成纤维细胞和其他细胞产生更多的胶原。总之，在磨损颗粒刺激下，界面纤维组织的增生增加了骨与假体之间的阻隔作用，使两者的生物学整合更加困难，假体的稳定性进一步受到削弱，从而增加了人工关节松动的可能性。
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3.骨化：本组在非溶骨部位界膜中发现含软骨细胞样细胞的不成熟软骨组织与假体侧纤维组织相延续并密切交织，形成纤维-软骨样组织，该部位纤维组织中未见任何磨损颗粒。这种现象不仅说明磨损颗粒在骨溶解和影响骨-假体界面骨重建中的不良作用，而且也从反面提示若没有磨损颗粒的存在，界面组织中的间质细胞仍具有向骨组织分化的趋势和能力，这对人工关节达到生物学固定具有重要意义。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800161)
参考文献
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3，Jiranek WA, Machado M, Jasty M, et al. Production of cytokines around loosened cemented acetabular components: analysis with immunohistochemical techniques and insitu hydridization. J Bone and Joint Surg (Am), 1993, 75:863-879.
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, 百拇医药
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6，Udagawa N, Takahashi N, Akatsu T, et al. Origin of osteoclasts: murine monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow derived stromal cells. Proc. Natl Acad Sci USA, 1990, 87:7260-7264.
, 百拇医药
7，Schuller HM, Scholten PE, Lettinga K, et al. High cathepsin B activity in arthroplasty interface membranes. A histochemical study of 9 loose cemented total hip prostheses. Acta Orthop Scand, 1993, 64:613-618.
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11，Goodman SB, Fornasier VL, Lee J, et al. The histological effects of the implantation of different sizes of polyethylene particles in the rabbit tibia. J Biomed Mat Res, 1990, 24:517-528.
(收稿日期：1999-11-10), http://www.100md.com
单位：蔡胥(中国人民解放军总医院骨科 北京100853)；王继芳(中国人民解放军总医院骨科 北京100853)；卢世璧(中国人民解放军总医院骨科 北京100853)；赵斌(中国人民解放军总医院骨科 北京100853)；张笑明(中国人民解放军总医院病理科)
关键词：假体失效；骨质溶解；肉芽肿；异物；滑膜；粒子大小
中华医学杂志001108
【摘要】 目的 观察假体周围界膜的组织学及超微结构特征，探讨磨损颗粒在人工关节无菌性松动中的作用。方法 对51例于我院行翻修术患者的无菌性松动人工髋关节假体周围界膜组织切片作HE、番红O-亮绿染色及CD68免疫组织化学染色，光镜下观察界膜组织学构成、磨损颗粒种类、分布及其聚集部位的组织学特征，测量颗粒长短径，计算CD68阳性细胞数。TEM下观察界膜细胞超微结构及被MΦ吞噬颗粒的特征，并测量其长短径。结果 界膜由纤维基质、成纤维细胞、MΦ和异物巨细胞等构成，其中MΦ占23%±5%(x±s)。在溶骨区贴假体或骨水泥侧的界膜中可聚集大量超高分子聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、钛合金或钴铬合金颗粒，呈慢性异物炎症反应。细胞外颗粒多数在15 μm以下，被MΦ吞噬者几乎全部小于1 μm。同一MΦ内溶酶体中可存在多种颗粒。非骨溶解部位界膜中无磨损颗粒，并形成纤维-软骨样组织。结论 界膜中的多种磨损颗粒与界面骨溶解及纤维组织增生有关，是人工关节无菌性松动过程中的重要生物学因素。
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(Department of Orthopaedics, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effect of wear particles on prosthetic loosening by analyzing the histological and ultrastructural characteristics of interface membrane around aseptically loosened prostheses. Methods Slices of interface membranes around aseptically loosened hip prostheses of 51 cases were stained with HE, Safranin O-Briliant green and CD68 Mab immunohistochemical technique respectively. The histological structure of the membranes and the kinds of wear particles and their distribution characters were observed. The size of particles and the number of CD68 positive cells were measured. Ultrastructure of cells in the membrane and the characters and size of the particles phagocytozed by MΦ were also observed and measured. Results Interface membrane consisted of fibromatrix, fibroblasts, MΦ[CD68 positive, occupying (23±5)% (x±s)], and foreign body giant cells. In the membranes at the site of osteolysis, great amount of UHMWPE particles, PMMA particles and Ti alloy or CoCr alloy particles collected at the side attaching to the implant and caused chronic foreign body inflammatory reaction. Most of the particles outside MΦ were less than 15 μm while that inside MΦ were less than 1 μm. Different kinds of wear particles could exist in the lysosomes of one MΦ. No particles but cartilage-like tissues appeared in the membranes at the site without osteolysis. Conclusion Wear particles in the interface membrane have relations with osteolysis and fibrous tissue proliferation at bone-implant interface, which plays an important role in aseptic loosening.
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【Key words】 Prosthesis failure； Osteolysis； Granuloma, foreign-body； Synovial membrane； Particle size
由于对无菌性松动人工关节行翻修术时常在骨-骨水泥或骨-假体界面，特别是在骨溶解部位发现一层滑膜样纤维组织界膜，故国外对该膜的组织学特征已有较多研究[1]，但国内对松动的国产人工髋关节界面组织情况报道较少[2]。作者从组织学和超微结构两个方面对此作了进一步观察。
对象和方法
一、组织来源
界膜标本取自51例于我院行翻修术患者的无菌性松动人工髋关节假体周围，留取其中骨水泥固定髋臼界膜9份，无骨水泥固定髋臼界膜5份，骨水泥固定股骨柄界膜20份，无骨水泥固定股骨柄界膜10份，体积分数为10%的甲醛固定。每份标本另切取约2 mm×2 mm×2 mm的界膜于体积分数为3%的戊二醛中固定。
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二、标本处理
所有标本均取样常规制片，HE染色。对初步观察含软骨样组织的非溶骨区界膜行番红O-亮绿染色。取溶骨区界膜切片，以预聚合SABC法，作CD68免疫组织化学染色。常规制备透射电镜(TEM)切片。
三、镜下观察
光镜下观察界膜的组织学构成，磨损颗粒的种类、分布及其聚集部位的组织学特征。100倍油镜下随机选取含颗粒标本中10个视野，每个视野随机测出100枚颗粒的长短径，取均值。在CD68免疫组织化学染色切片中随机选取10个视野，各计100个细胞中的阳性细胞数，取均值获得巨噬细胞(MΦ)所占比例。观察CD68阳性MΦ的分布及其与磨损颗粒的关系。TEM下观察界膜细胞的超微结构特征，测量MΦ内磨损颗粒的大小。
四、统计学处理
镜下测得磨损颗粒长短径及CD68阳性细胞数均以
±s表示。, 百拇医药
结果
一、界膜组织构成
界膜主要由纤维基质、单核和多核组织细胞以及慢性炎细胞构成，可形成一些皱褶或乳头状突起，与OA滑膜有相似之处。髋臼和股骨柄假体周围界膜无明显差别，可分为3层结构(图1)。贴假体或骨水泥的表层由1～5层椭圆形或圆形细胞排列而成，类似滑膜内衬层。溶骨区界膜该层细胞多而密集，与其下层分界不清，而非溶骨区则仅有1～2层扁平细胞。中层为疏松纤维基质，溶骨区该层血管丰富，细胞量大且多种细胞成分混杂，主要有成纤维细胞、MΦ和异物巨细胞等，可聚集大量磨损颗粒。在微血管或淋巴管附近常可发现散在的含颗粒MΦ。非溶骨区该层较薄，组织细胞少，颗粒不多或无。外层贴骨侧由纤维细胞和大量胶原纤维构成，纤维之间也可存在大量颗粒。在溶骨区，界膜的中层可延续至此，未见典型的破骨细胞样细胞。非骨溶解部位可有含软骨细胞样细胞的不成熟软骨组织与假体侧纤维组织相延续并密切交织，其中未见任何磨损颗粒。用番红O-亮绿染色时，呈绿色的纤维组织与呈红色的软骨样组织形成鲜明的对比，两者之间交织的部位为浅色的过渡区(图2)。
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在一些界膜的内、中层，可见散在的T、B淋巴细胞，但它们更多的是聚集在一起形成细胞巢，状如淋巴结的生发中心，其位置与磨损颗粒的聚集区无必然联系。
二、磨损颗粒形态
磨损颗粒主要集中在界膜的中层，在远离关节面的部位较少或无，其分布与假体周围骨溶解的好发部位和严重程度相符。骨溶解部位还可见磨损颗粒进入骨小梁之间，并同样引起组织细胞反应。
金属颗粒呈黑色，微小颗粒辨别不清晰，较大颗粒主要呈鳞片状或短棒状，部分呈针状。数量少时散在(图1)或被MΦ吞噬，数量较多时则常聚集在一起，被MΦ、成纤维细胞和纤维基质包绕形成许多较大的颗粒巢，其长轴与界膜延伸方向一致。若颗粒数量巨大，如肉眼所见黑碳状界膜中，则全层均有连续或间断的大片颗粒巢，甚至不能辨别组织细胞形态(图3)。钛(Ti)合金颗粒数量明显多于钴铬(CoCr)合金颗粒。有些Ti合金颗粒分布区并无明显的MΦ聚集和组织细胞反应，而CoCr合金颗粒周围一般都有慢性炎症反应表现，而且还可出现无结构的透明变性区域，它的出现似与颗粒数量和聚集部位没有明显关系(图4)。
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超高分子聚乙烯(UHMWPE)颗粒具有双折光性，仅在偏振光镜下可见。有的溶骨区界膜组织在普通光镜下不见任何颗粒，仅有明显的炎症反应(图5a)，但偏振光镜下则发现有大量UHMWPE颗粒存在(图5b)。它们绝大部分呈细微的针状，一般散布均匀，不形成明显的颗粒巢，并且多数与金属或PMMA颗粒混合存在于界膜组织中，或同时被MΦ吞噬(图6a,b)，这在溶骨部位的界膜中较为典型。大UHMWPE颗粒呈“雪茄”样或丝状，可相互连接成巨大颗粒，多被异物巨细胞吞噬或包围(图7a,b)。大量异物巨细胞的出现是大UHMWPE颗粒存在的特征性标志，这在仅有微小金属颗粒的部位并不多见。
聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)颗粒呈棕褐色，圆形、长圆形或不规则形，明显大于金属颗粒。一般相对集中，呈巢状分布，由纤维基质和多种细胞包绕。同一颗粒巢中颗粒大小相差悬殊，小颗粒可被MΦ吞噬。一部分PMMA颗粒在标本处理过程中被有机溶剂溶解而在局部形成空白区(图8)。
三、磨损颗粒大小
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微小颗粒主要出现在无骨水泥固定假体周围界膜中，而大颗粒则在骨水泥固定的髋关节中更为多见，个别巨大颗粒超过1 000 μm，由异物巨细胞包绕。由于光镜分辨率有限，当颗粒径长小于0.5 μm时，即无法确切测量(表1)。
图1 界膜的3层结构。表层排列1～5层细胞，类似滑膜内衬；中层为疏松纤维基质，血管丰富，细胞成分混杂，可聚集大量磨损颗粒；外层由纤维细胞和胶原纤维构成，纤维之间也可存在大量颗粒 HE染色×20 图2 非溶骨部位含软骨细胞样细胞的组织(灰红色)与假体侧纤维组织(绿色)相延续并密切交织，未见磨损颗粒 番红O-亮绿染色×10 图3 Ti合金假体周围界膜全层均有大片颗巢，组织细胞形态不易辨别 HE染色×10 图4 存在CoCr合金颗粒的部位呈慢性炎症反应，可出现无结构的透明变性区域 HE染色×10
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图5 a. 有的溶骨区界膜组织在普通光镜下不见任何颗粒，仅有明显的炎症反应；b. 同一视野偏振光镜下则发现有大量UHMWPE颗粒存在 HE染色×40 图6 a. 有的溶骨区界膜组织在普通光镜下仅见MΦ吞噬大量金属颗粒；b. 同一视野偏振光镜下发现MΦ内同时存在大量微小的UHMWPE颗粒 HE染色×20 图7 a. 普通光镜下可见界膜组织中聚集的大量异物巨细胞；b. 同一视野偏振光镜下可见异物巨细胞中吞噬有巨大的UHMWPE颗粒 HE染色×20
图8 PMMA颗粒呈棕褐色，大小相差悬殊，小颗粒可被
MΦ吞噬，部分颗粒在标本处理过程中被有机溶剂溶解而在
局部形成空白区 HE染色×40
四、CD68阳性MΦ特征
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表1 界膜中磨损颗粒大小的光镜下测量结果(μm,
±s) 颗粒种类长径
短径
范围
±s范围
±sTi合金
0.4～15
2.18±0.36
0.3～15
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1.64±0.31
CoCr合金
0.4～10
2.14±0.27
0.4～10
1.35±0.13
PMMA
0.5～25
5.61±0.36
0.5～20
4.57±0.30
UHMWPE(大)
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3～41
16.85±1.42
1～25
5.06±0.80
UHMWPE(小)
0.5～4
1.29±0.14
0.3～2
0.60±0.05
注：PMMA为聚甲基丙烯酸甲酯，UHMWPE为超高分子聚乙烯 在界膜组织细胞中所占比例为23%±5%(
±s)，主要散在分布于界膜组织的内、中层，细胞形态、大小不一致，可为圆形、长圆形或梭形，有些阳性细胞可见其伸出的伪足。在有磨损颗粒的区域，阳性细胞有向颗粒聚集的趋势。可吞噬径长小于1 μm的微小颗粒，颗粒量大时细胞形态被遮盖而不易辨别。, 百拇医药
五、超微结构特征
界膜中MΦ呈椭圆形或不规则具伪足形，存在于不定形基质中，胞浆内含丰富的溶酶体和线粒体，内质网少，部分细胞内可见细胞骨骼系统。同一MΦ可吞噬至少一种磨损颗粒，有的MΦ内同时存在金属、UHMWPE和PMMA颗粒。后两种颗粒由于在标本处理过程中可被溶解，因而在颗粒位置形成空白区。被吞噬颗粒的形状主要为类圆形，金属颗粒可呈棱角形，而UHMWPE颗粒则为针、丝状。颗粒不论大小(表2)一般均与初级溶酶体结合形成次级溶酶体，同一溶酶体中亦可同时存在两种颗粒(图9)。
表2 界膜MΦ内磨损颗粒大小的电镜下测量结果(μm,
±s) 颗粒种类长径
短径
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±s范围
±s金属
0.067～
2.833
0.361±
0.021
0.067～
1.25
0.234±
0.012
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PMMA
0.208～
1.417
0.730±
0.082
0.083～
0.952
0.459±
0.052
UHMWPE
0.067～
0.417
0.210±
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0.023
0.033～
0.286
0.099±
0.014
图9 被MΦ吞噬的颗粒与初级溶酶体结合形成次级溶酶体，同一溶酶体中可同时存在两种颗粒 TEM×3 500
界膜中成纤维细胞呈梭形，边缘规则，胞浆内有较多粗面内质网，周围大量胶原纤维。纤维细胞胞浆极少，周围完全被胶原纤维包裹。两种细胞内均未见磨损颗粒。
讨论
一、界膜的组织细胞构成
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本组界膜的3层组织学结构与其他作者的描述基本相同[1]，它们与无菌性关节炎滑膜有许多相似之处，但细胞构成却相对复杂。
1.MΦ：为界膜中主要的浸润细胞。但MΦ的出现与磨损颗粒的存在密切相关，其重要特征是围绕磨损颗粒产生的慢性异物炎症反应。本组采用CD68单克隆抗体对界膜组织作免疫组织化学染色，得到与其他作者相似的MΦ形态，但CD68阳性细胞数量却少得多[3]，仅占细胞总数的约22.8%,造成这种差异的原因尚不清楚。
Goodman等[4]认为，被MΦ吞噬的颗粒并不能由溶酶体消化，它们最终仍将排入细胞外间隙中，随之排出的还有PGE2等炎性介质和可造成周围组织损害的水解酶等。而排出的颗粒仍能被其它MΦ吞噬，使该过程不断反复发生，从而引起局部骨溶解。
2.异物巨细胞：是本组界膜中含大颗粒区域的特征性标志[5]。
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3.成纤维细胞：由于本组CD68阳性MΦ较少，故界膜中成纤维细胞比例应相对较大。有作者认为，只有在MΦ被磨损颗粒激活后释放的某些细胞因子(如PDGF)介导下成纤维细胞才能实现组织修复的能力。
4.破骨细胞：可能是界膜中实际操作骨质溶解吸收的唯一细胞。相关研究表明[6]，界膜中的破骨细胞在抗原和功能上均与成熟MΦ相似,并可在合适的刺激因子作用下由MΦ前体衍化生成,其活化可能同样依赖于磨损颗粒激活MΦ而释放的生物活化物质。虽然Schuller等[7]发现所有的界膜贴骨面均存在具有破骨细胞特征的多核巨细胞密集区，但本组未能在界膜贴骨侧观察到典型的破骨细胞，其原因与本组界膜中CD68阳性细胞数少一样需作进一步探讨。
5.淋巴细胞：本组界膜中淋巴细胞的分布与磨损颗粒聚集区并无必然联系，因此即使淋巴细胞介导的免疫反应在颗粒物质引起的骨溶解吸收过程中起一定作用，也可能并非将磨损颗粒作为直接反应对象。最近，Goodman等[8]的研究也表明，T淋巴细胞并非聚乙烯颗粒诱导炎症反应所必需的，它可能仅与调节异物反应的强度有关。
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二、界膜中磨损颗粒的特征
1.种类：本组界膜中UHMWPE颗粒比金属和PMMA颗粒分布更为广泛，有后两种颗粒的部位总有UHMWPE颗粒存在，甚至可达假体的最远端，而且在有些骨溶解区内仅发现UHMWPE颗粒，提示其在假体-骨界面的生物学反应中可能起主要作用。
2.大小：对于颗粒的大小，因作者和测量方法的不同而存在差异。本组观察结果表明，各种颗粒径长小于15 μm的占绝大部分。许多微小颗粒(小于1 μm)在光镜下难以分辨，需在电镜下确认。因此，普通组织学观察未发现颗粒时，并不能完全排除其存在的可能。磨损颗粒可被吞噬的大小亦有不同观点，本组电镜下测量的结果表明，MΦ内的各种磨损颗粒几乎全部都在1 μm以下，大小范围比文献报告的5～12 μm[1]要小得多。有作者认为，吞噬磨损颗粒是MΦ激活的必要条件，但相反的观点则认为不同大小的磨损颗粒均可激活MΦ，只不过随着颗粒的增大，其激活能力逐渐下降，因而所致的生物学效应亦减弱[9]。
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3.数量：本组溶骨区界膜组织中光镜下可见的磨损颗粒数量与MΦ的数量直接相关，而骨溶解的程度又与MΦ的数量之间存在密切的关系。提示磨损颗粒在骨-假体界面组织中聚集的数量越多，引起的慢性异物炎症反应可能越强烈而持久。
三、两种固定方式界膜的差别
Horikoshi等[1]发现在无骨水泥固定股骨假体周围的界膜中微小聚乙烯和金属颗粒较骨水泥固定者更常见，这与本组微小颗粒主要出现在无骨水泥固定的髋关节中是一致的。有作者提出，骨水泥断裂、崩解产生的大PMMA碎屑可嵌入聚乙烯关节面中，关节活动过程中股骨头表面容易被其刮伤而变得粗糙，从而加重聚乙烯关节面磨损，使之更易产生大聚乙烯颗粒。因此，如果微小颗粒被MΦ吞噬是其激活和最终导致骨溶解的原因，则无骨水泥固定关节产生的小颗粒多就可能是其假体周围骨溶解发生率和无菌性松动率不低的原因之一。
四、界面组织的转归
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界膜除了可能在假体周围骨溶解过程中起重要作用外，其本身也可有多种转化方向。
1.坏死：本组观察表明,界膜的中、外层可存在透明变性和广泛的无结构坏死区。有作者认为，这是磨损颗粒特别是CoCr合金颗粒的毒性作用造成的。但是，本组界膜变性坏死区并不一定发生在颗粒聚集的部位，因而认为其发生原因尚需进一步探讨。虽然骨-假体界面组织细胞的坏死使局部溶骨因子的产生减少，但也可致溶酶体酶释放的增加，所以该过程对假体松动的作用尚不能确定。
2.增生：界膜中、外层胶原纤维组织大量增生也是本组普遍存在的现象。Maloney等[10]在体外研究中发现，金属颗粒可直接刺激成纤维细胞增生并分泌胶原。另一方面，许多作者认为[11]磨损颗粒致MΦ激活后释放的多种强力成纤维细胞分裂原(如IL-1和PDGF)可刺激成纤维细胞和其他细胞产生更多的胶原。总之，在磨损颗粒刺激下，界面纤维组织的增生增加了骨与假体之间的阻隔作用，使两者的生物学整合更加困难，假体的稳定性进一步受到削弱，从而增加了人工关节松动的可能性。
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3.骨化：本组在非溶骨部位界膜中发现含软骨细胞样细胞的不成熟软骨组织与假体侧纤维组织相延续并密切交织，形成纤维-软骨样组织，该部位纤维组织中未见任何磨损颗粒。这种现象不仅说明磨损颗粒在骨溶解和影响骨-假体界面骨重建中的不良作用，而且也从反面提示若没有磨损颗粒的存在，界面组织中的间质细胞仍具有向骨组织分化的趋势和能力，这对人工关节达到生物学固定具有重要意义。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800161)
参考文献
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4，Goodman SB, Chin RC. Prostaglandin E2 levels in the membrane surrounding bulk and particulate polymethylmethacrylate in the rabbit tibia. Clin Orthop, 1990, 257:305-309.
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6，Udagawa N, Takahashi N, Akatsu T, et al. Origin of osteoclasts: murine monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow derived stromal cells. Proc. Natl Acad Sci USA, 1990, 87:7260-7264.
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7，Schuller HM, Scholten PE, Lettinga K, et al. High cathepsin B activity in arthroplasty interface membranes. A histochemical study of 9 loose cemented total hip prostheses. Acta Orthop Scand, 1993, 64:613-618.
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10，Maloney WJ, Smith RL, Castro F, et al. Fibroblast response to metallic debris in vitro: enzyme induction, cell proliferation, and toxicity. J Bone and Joint Surg(Am), 1993, 75(6):835-844.
11，Goodman SB, Fornasier VL, Lee J, et al. The histological effects of the implantation of different sizes of polyethylene particles in the rabbit tibia. J Biomed Mat Res, 1990, 24:517-528.
(收稿日期：1999-11-10), http://www.100md.com