可变数串联重复序列检测异基因外周血造血干细胞移植后植活证据的研究
作者：王建增 王健民 章卫平 童书鹏 周虹
单位：第二军医大学附属长海医院血液科 上海200433
关键词：串联重复序列；多聚酶链反应；干细胞移植
中华医学杂志001107
【摘要】 目的 从血型、染色体核型、DNA可变数串联重复序列(VNTR)几个方面进行对比研究以更好地评估异基因移植后的植入状态及其与疾病复发的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法扩增D17S30、D1S80、ApoB3个不同位点的多态性，对15例白血病患者异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)后的嵌合状态进行检测，对其中7例异性间移植和3例血型不合移植又分别进行了染色体核型分析和全套血型分析。结果 经VNTR检测，allo-PBSCT后15天有11例呈供体型嵌合状态，4例呈混合型嵌合状态。7例异性间移植者经染色体核型分析证实为完全嵌合状态。3例ABO血型不一致者在移植后出现混合血型，最早1例移植后2个月转变为供体的血型，有1例移植后7个月持续呈混合状态。结论 PCR扩增VNTR片段评估allo-PBSCT后的嵌合状态具有方法简便、灵敏度高的优点，特别适合供受体间性别、血型、HLA配型完全相同的异基因造血干细胞移植。
, 百拇医药
Variable number of tandem repeats as an evidence of engraftment status after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation
WANG Jianzeng WANG Jianmin ZHANG Weiping
(Haematology Department of Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
【Abstract】 Objective To evaluate engraftment status of patients after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation (allo-PBSCT) based on red blood cell type, karyotype and variable number of tandem repeats (VNTR). Methods Amplification of 3 loci of VNTR in vitro by polymerase chain reaction (PCR) was preformed to detect the polymorphism of 15 patients post-PBSCT. Furthermore, analysis of karyotype in 7 sex-mismatched patients and red blood cell antigen switching in 3 ABO blood type mismatched patients were also employed. Results VNTR analysis in 15 patients revealed complete chimerism in 11 patients and mixed chimerism in 4. In the 7 sex-mismatched patients, karyotype analysis showed types of their donors. As for blood type analysis, it was after 2 months that the first patient transformed to his donor's type. One patient showed mixed status 7 months after transplantation. Conclusion Amplification of VNTR loci by PCR for documenting engraftment status after allo-PBSCT is simple and sensitive. This technology is especially suitable for patients who have received stem cells with the same sex, same blood type and identical HLA type. Examination with several different VNTR loci will improve the power of discrimination.
, 百拇医药
【Key words】 Tandem repeat sequences； PCR； Hematopoietic stem cell transplantation
近年来，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)已成功地应用于治疗多种儿童及成人血液病[1]。allo-HSCT的成功与否与移植后稳定嵌合状态的形成有密切关系，因此，区分移植后造血干细胞的起源是评估移植成功与否的重要标志，并对判断原发病预后有重要价值。经典的检测方法有[2]：(1)红细胞血型；(2)红细胞同工酶谱；(3)血清免疫球蛋白谱；(4)性染色体核型分析；(5)HLA抗原等。大部分移植病例可应用上述方法得到客观的植入证明，但是其应用都受到一定的限制。
可变数串联重复序列(variable numbers of tandem repeat, VNTR)，具有个体差异，可用于个体识别。我们选用D17S30、D1S80、ApoB位点，对15例allo-PBSCT病例的嵌合状态进行了联合检测，并结合红细胞血型、性染色体核型等几方面进行了对比研究。
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对象和方法
1.对象：白血病患者15例，年龄14～46岁。其中急性髓细胞白血病(AML)6例，急性淋巴细胞白血病(ALL)6例，慢性粒细胞白血病(CML)3例。ABO血型一致者12例，血型不一致者3例；同性间移植8例；异性间移植7例；HLA配型完全相合者13例，1个位点不相合者2例(表1)。所有病例在病程中均接受血小板悬液及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)支持。
2.基因组DNA的提取：取移植前供、受体及移植后不同阶段(15 d、30 d、45 d，根据门诊随访时间不同而异)受体的骨髓液1～2 ml，常规方法提取基因组DNA。
3.引物D17S30位点：5′-CGAAGAGTGAAGTGC-ACAGG-3′；5′-CACAGTCTTTATTCTTCAGCG-3′。APOB位点：5′-ATGGAAACGGAGAAATTATG-3′；5′-CCTTCTCACTTGGCAAATAC-3′。D1S80 位点：5′-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3′；5′-GCAAGGGGCACGTGCATCTCCAACAAGAC-3′。
, 百拇医药
4.聚合酶链反应(PCR)：在50 μl反应体系中，上下游引物各为1 μmol/L，MgCl2 1.0 mmol/L，4 种dNTP均为200 μmol/L，模板DNA约25～250 ng，混匀后置95℃变性10 min，在高温下加入Taq DNA聚合酶3 U。然后按94℃40 s、58℃70 s、72℃100 s顺序进行30个循环，再置72℃延伸7 min后于4℃保存。D1S80位点退火温度为65℃。PCR扩增产物检测采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-溴化乙锭染色法。
5.染色体核型分析：应用骨髓细胞直接制片法，进行G显带、C显带。
6.血型检测：采用免疫凝集法，用已知抗原检测未知红细胞抗体。
结果
1.染色体核型分析：移植后造血细胞染色体转变为供体的核型，30 d以内3例，30 d及30 d以上4例，最长53 d(表1)。但3例30 d以内的染色体核型分析，分裂相较少，或存在染色体畸形。
, 百拇医药
2.红细胞血型：在3例供受体间ABO血型不一致的病例中，1例移植后2个月后转变为供体的血型。1例CML患者移植后4个月血型持续呈混合型。另1例患者为A型，供体为O型，移植后7个月仍为混合血型，以O型为主，至15个月转变为O型。
3.VNTR位点检测结果：D17S30位点：2例因供、受体扩增条带完全相同不能作为识别依据；10例呈全供体型嵌合状态；3例发现有混合嵌合状态存在，其中持续呈混合嵌合状态并长期无病存活1例，骨髓17S30位点PCR扩增(见图1)；移植后23 d示混合嵌合状态，1个月后转变为供体型嵌合状态1例(图2)；移植后3个月持续混合嵌合状态，以后转变为宿主细胞型1例。D1S80位点 1例不能作为识别依据；3例发现有混合嵌合状态存在，与D17S30位点结果相同；11例呈供体型嵌合状态。ApoB位点 供体型11例；混合型4例，其中3例与D17S30位点结果相同，另1例移植后3个月持续呈混合状态，4个月后转变为宿主细胞型，证实为ALL移植后复发。
, http://www.100md.com 表1 15例异基因造血干细胞移植病例情况 病例号
受体
性别
受体
年龄
(岁)
基础
疾病
受体
血型
供体
性别
供体
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血型
HLA
配型
中性粒细胞
恢复时间(d)
PLT恢复
时间
(d)
染色体
转变时间
(d)
VNTR检
测结果
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移植后的
疾病状态
1
男
31
CML
A
女
A
全相合
15
15
30
CC
, 百拇医药
CR
2
女
35
AML
O
男
O
全相合
17
17
19
CC
CR
, 百拇医药
3
女
43
AML
B
女
B
全相合
16
16
MC
CR
4
男
, 百拇医药
23
ALL
A
男
A
全相合
15
15
MC
复发
5
男
39
AML
, 百拇医药
O
男
B
全相合
14
14
CC
复发
6
男
34
CML
A
男
, 百拇医药
AB
全相合
23
28
MC
复发
7
男
46
CML
O
男
O
全相合
, http://www.100md.com
14
14
CC
CR
8
男
41
ALL
O
男
O
全相合
16
16
, 百拇医药
CC
CR
9
男
45
AML
O
女
O
全相合
16
16
24
CC
, 百拇医药
CR
10
男
44
ALL
O
男
O
全相合
14
9
CC
CR
11
, 百拇医药
男
42
ALL
O
男
O
全相合
15
15
MC
CR
12
男
46
, 百拇医药
AML
O
女
O
全相合
14
14
35
CC
CR
13
女
48
AML
, 百拇医药
O
男
O
全相合
21
21
50
CC
CR
14
男
14
ALL
A
, http://www.100md.com
女
O
B点不合
16
16
15
CC
CR
15
男
21
ALL
A
女
, 百拇医药
A
A点不合
11
40
53
CC
CR
注：CC表示供体型嵌合状态；MC表示混合型嵌合状态；CR表示完全缓解；PLT表示血小板
图1 例11骨髓D17S30位点PCR扩增结果
, 百拇医药 图2 例4骨髓ApoB位点PCR扩增结果
讨论
异基因造血干细胞移植，在骨髓恢复造血后可能形成3种植入状态[3]：(1)供者型表明临床移植成功；(2)混合型其意义尚不完全明确；(3)受体型表明移植失败或移植物被排斥。
1.7例异性间移植病例，性染色体核型多在移植后30d左右表现为供体的核型，VNTR位点的检测在移植后15 d即可明确其为供体型植入状态，比染色体核型分析灵敏，而且不受染色体畸型及分裂相少的影响。
2.3例血型不一致的移植病例中，例14患者15个月持续为供、受体混合状态，VNTR位点的多次检测均表现为供体型嵌合状态。结合骨髓象及临床表现，患者的移植是成功的，其血型为混合型的意义未明。例6患者在移植后4个月的时间内持续呈现供、受体混合血型，而同期进行的VNTR位点检测表明，移植后1个月内为供体型嵌合状态，2个月后出现混合嵌合状态，复发后经回输供者淋巴细胞(DLI)临床缓解1个月又转变为供体型嵌合状态，血型转变为供体血型。其原因是红细胞的寿命较长，受化疗预处理及全身照射的影响较小，在移植后1个月的时间内仍无法判断其造血细胞的来源。也说明PCR扩增VNTR位点的多态性检测造血细胞来源比红细胞抗原更灵敏、更客观。
, 百拇医药
3.关于混合嵌合状态与复发 ，国外随访间隔短的研究表明急性白血病患者出现造血细胞复发的明显症状之前用PCR方法均能监测到受体细胞的再次出现[4，5]。定量PCR的研究发现，混合嵌合状态的患者，如自身成分持续增加，复发的危险明显加大；如自身成分持续下降，则往往转变为供体型嵌合状态或保持在持续的缓解状态[6]。在我们的研究中， 11例显示供体型嵌合状态，4例混合型嵌合状态，其中2例在移植后4个月复发(1例CML，1例ALL)，其中CML患者经DLI后再次缓解。目前还不能得出存在混合嵌合状态的移植患者复发率高于供体型患者的结论。这可能与病例数少有关。我们未进行PCR定量，不能说明出现混合嵌合状态后其自身成分的变化，但我们确实在患者出现临床复发以前发现了混合嵌合状态的存在，而且观察到混合嵌合状态向两个方向发展。为此，我们认为，如有条件应对其进行定量，连续追踪随访；及早发现复发征象，及时进行相应处理。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870710)；上海市卫生系统“百人计划”资助项目
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参考文献
1，Amitage J. Bone marrow transplantation. New Engl J Med, 1994, 330: 827-838.
2，孟沛霖，闵碧荷主编.实用血液病手册.北京：人民军医出版社，1998，302.
3，Martinelli G, Trabetti E, Zaccaria A, et al. In vitro amplification of hypervariable DNA regions for the evaluation of chimerism after allogenetic BMT. Bone Marrow Transplant, 1993, 12:115-120.
4，Ramirez M, Diaz M, Garcia-Sanchez F, et al. Chimerism after allogeneic hematopoietic cell transplantation in childhood acute lymphoblastic leukemia. Bone Marrow Transplant, 1996, 18: 1161-1165.
, 百拇医药
5，Bader P, Bech J, Frey A, et al. Serial and quantitative analysis of mixed hematopoietic chimerism by PCR in patient with acute leukemias allows the prediction of relapse after allogeneic BMT. Bone Marrow Transplant, 1998, 21: 487-495.
6，Bader P, Holle W, Klingebiel T, et al. Mixed hematopoietic chimerism after allogeneic bone marrow transplantation: the impact of quantitative PCR analysis for prediction of relapse and graft rejection in children. Bone Marrow Transplant, 1997, 19: 697-702.
(收稿日期：2000-01-10), 百拇医药
单位：第二军医大学附属长海医院血液科 上海200433
关键词：串联重复序列；多聚酶链反应；干细胞移植
中华医学杂志001107
【摘要】 目的 从血型、染色体核型、DNA可变数串联重复序列(VNTR)几个方面进行对比研究以更好地评估异基因移植后的植入状态及其与疾病复发的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法扩增D17S30、D1S80、ApoB3个不同位点的多态性，对15例白血病患者异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)后的嵌合状态进行检测，对其中7例异性间移植和3例血型不合移植又分别进行了染色体核型分析和全套血型分析。结果 经VNTR检测，allo-PBSCT后15天有11例呈供体型嵌合状态，4例呈混合型嵌合状态。7例异性间移植者经染色体核型分析证实为完全嵌合状态。3例ABO血型不一致者在移植后出现混合血型，最早1例移植后2个月转变为供体的血型，有1例移植后7个月持续呈混合状态。结论 PCR扩增VNTR片段评估allo-PBSCT后的嵌合状态具有方法简便、灵敏度高的优点，特别适合供受体间性别、血型、HLA配型完全相同的异基因造血干细胞移植。
, 百拇医药
Variable number of tandem repeats as an evidence of engraftment status after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation
WANG Jianzeng WANG Jianmin ZHANG Weiping
(Haematology Department of Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
【Abstract】 Objective To evaluate engraftment status of patients after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation (allo-PBSCT) based on red blood cell type, karyotype and variable number of tandem repeats (VNTR). Methods Amplification of 3 loci of VNTR in vitro by polymerase chain reaction (PCR) was preformed to detect the polymorphism of 15 patients post-PBSCT. Furthermore, analysis of karyotype in 7 sex-mismatched patients and red blood cell antigen switching in 3 ABO blood type mismatched patients were also employed. Results VNTR analysis in 15 patients revealed complete chimerism in 11 patients and mixed chimerism in 4. In the 7 sex-mismatched patients, karyotype analysis showed types of their donors. As for blood type analysis, it was after 2 months that the first patient transformed to his donor's type. One patient showed mixed status 7 months after transplantation. Conclusion Amplification of VNTR loci by PCR for documenting engraftment status after allo-PBSCT is simple and sensitive. This technology is especially suitable for patients who have received stem cells with the same sex, same blood type and identical HLA type. Examination with several different VNTR loci will improve the power of discrimination.
, 百拇医药
【Key words】 Tandem repeat sequences； PCR； Hematopoietic stem cell transplantation
近年来，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)已成功地应用于治疗多种儿童及成人血液病[1]。allo-HSCT的成功与否与移植后稳定嵌合状态的形成有密切关系，因此，区分移植后造血干细胞的起源是评估移植成功与否的重要标志，并对判断原发病预后有重要价值。经典的检测方法有[2]：(1)红细胞血型；(2)红细胞同工酶谱；(3)血清免疫球蛋白谱；(4)性染色体核型分析；(5)HLA抗原等。大部分移植病例可应用上述方法得到客观的植入证明，但是其应用都受到一定的限制。
可变数串联重复序列(variable numbers of tandem repeat, VNTR)，具有个体差异，可用于个体识别。我们选用D17S30、D1S80、ApoB位点，对15例allo-PBSCT病例的嵌合状态进行了联合检测，并结合红细胞血型、性染色体核型等几方面进行了对比研究。
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对象和方法
1.对象：白血病患者15例，年龄14～46岁。其中急性髓细胞白血病(AML)6例，急性淋巴细胞白血病(ALL)6例，慢性粒细胞白血病(CML)3例。ABO血型一致者12例，血型不一致者3例；同性间移植8例；异性间移植7例；HLA配型完全相合者13例，1个位点不相合者2例(表1)。所有病例在病程中均接受血小板悬液及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)支持。
2.基因组DNA的提取：取移植前供、受体及移植后不同阶段(15 d、30 d、45 d，根据门诊随访时间不同而异)受体的骨髓液1～2 ml，常规方法提取基因组DNA。
3.引物D17S30位点：5′-CGAAGAGTGAAGTGC-ACAGG-3′；5′-CACAGTCTTTATTCTTCAGCG-3′。APOB位点：5′-ATGGAAACGGAGAAATTATG-3′；5′-CCTTCTCACTTGGCAAATAC-3′。D1S80 位点：5′-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3′；5′-GCAAGGGGCACGTGCATCTCCAACAAGAC-3′。
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4.聚合酶链反应(PCR)：在50 μl反应体系中，上下游引物各为1 μmol/L，MgCl2 1.0 mmol/L，4 种dNTP均为200 μmol/L，模板DNA约25～250 ng，混匀后置95℃变性10 min，在高温下加入Taq DNA聚合酶3 U。然后按94℃40 s、58℃70 s、72℃100 s顺序进行30个循环，再置72℃延伸7 min后于4℃保存。D1S80位点退火温度为65℃。PCR扩增产物检测采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-溴化乙锭染色法。
5.染色体核型分析：应用骨髓细胞直接制片法，进行G显带、C显带。
6.血型检测：采用免疫凝集法，用已知抗原检测未知红细胞抗体。
结果
1.染色体核型分析：移植后造血细胞染色体转变为供体的核型，30 d以内3例，30 d及30 d以上4例，最长53 d(表1)。但3例30 d以内的染色体核型分析，分裂相较少，或存在染色体畸形。
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2.红细胞血型：在3例供受体间ABO血型不一致的病例中，1例移植后2个月后转变为供体的血型。1例CML患者移植后4个月血型持续呈混合型。另1例患者为A型，供体为O型，移植后7个月仍为混合血型，以O型为主，至15个月转变为O型。
3.VNTR位点检测结果：D17S30位点：2例因供、受体扩增条带完全相同不能作为识别依据；10例呈全供体型嵌合状态；3例发现有混合嵌合状态存在，其中持续呈混合嵌合状态并长期无病存活1例，骨髓17S30位点PCR扩增(见图1)；移植后23 d示混合嵌合状态，1个月后转变为供体型嵌合状态1例(图2)；移植后3个月持续混合嵌合状态，以后转变为宿主细胞型1例。D1S80位点 1例不能作为识别依据；3例发现有混合嵌合状态存在，与D17S30位点结果相同；11例呈供体型嵌合状态。ApoB位点 供体型11例；混合型4例，其中3例与D17S30位点结果相同，另1例移植后3个月持续呈混合状态，4个月后转变为宿主细胞型，证实为ALL移植后复发。
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受体
性别
受体
年龄
(岁)
基础
疾病
受体
血型
供体
性别
供体
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血型
HLA
配型
中性粒细胞
恢复时间(d)
PLT恢复
时间
(d)
染色体
转变时间
(d)
VNTR检
测结果
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移植后的
疾病状态
1
男
31
CML
A
女
A
全相合
15
15
30
CC
, 百拇医药
CR
2
女
35
AML
O
男
O
全相合
17
17
19
CC
CR
, 百拇医药
3
女
43
AML
B
女
B
全相合
16
16
MC
CR
4
男
, 百拇医药
23
ALL
A
男
A
全相合
15
15
MC
复发
5
男
39
AML
, 百拇医药
O
男
B
全相合
14
14
CC
复发
6
男
34
CML
A
男
, 百拇医药
AB
全相合
23
28
MC
复发
7
男
46
CML
O
男
O
全相合
, http://www.100md.com
14
14
CC
CR
8
男
41
ALL
O
男
O
全相合
16
16
, 百拇医药
CC
CR
9
男
45
AML
O
女
O
全相合
16
16
24
CC
, 百拇医药
CR
10
男
44
ALL
O
男
O
全相合
14
9
CC
CR
11
, 百拇医药
男
42
ALL
O
男
O
全相合
15
15
MC
CR
12
男
46
, 百拇医药
AML
O
女
O
全相合
14
14
35
CC
CR
13
女
48
AML
, 百拇医药
O
男
O
全相合
21
21
50
CC
CR
14
男
14
ALL
A
, http://www.100md.com
女
O
B点不合
16
16
15
CC
CR
15
男
21
ALL
A
女
, 百拇医药
A
A点不合
11
40
53
CC
CR
注：CC表示供体型嵌合状态；MC表示混合型嵌合状态；CR表示完全缓解；PLT表示血小板
图1 例11骨髓D17S30位点PCR扩增结果
, 百拇医药 图2 例4骨髓ApoB位点PCR扩增结果
讨论
异基因造血干细胞移植，在骨髓恢复造血后可能形成3种植入状态[3]：(1)供者型表明临床移植成功；(2)混合型其意义尚不完全明确；(3)受体型表明移植失败或移植物被排斥。
1.7例异性间移植病例，性染色体核型多在移植后30d左右表现为供体的核型，VNTR位点的检测在移植后15 d即可明确其为供体型植入状态，比染色体核型分析灵敏，而且不受染色体畸型及分裂相少的影响。
2.3例血型不一致的移植病例中，例14患者15个月持续为供、受体混合状态，VNTR位点的多次检测均表现为供体型嵌合状态。结合骨髓象及临床表现，患者的移植是成功的，其血型为混合型的意义未明。例6患者在移植后4个月的时间内持续呈现供、受体混合血型，而同期进行的VNTR位点检测表明，移植后1个月内为供体型嵌合状态，2个月后出现混合嵌合状态，复发后经回输供者淋巴细胞(DLI)临床缓解1个月又转变为供体型嵌合状态，血型转变为供体血型。其原因是红细胞的寿命较长，受化疗预处理及全身照射的影响较小，在移植后1个月的时间内仍无法判断其造血细胞的来源。也说明PCR扩增VNTR位点的多态性检测造血细胞来源比红细胞抗原更灵敏、更客观。
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3.关于混合嵌合状态与复发 ，国外随访间隔短的研究表明急性白血病患者出现造血细胞复发的明显症状之前用PCR方法均能监测到受体细胞的再次出现[4，5]。定量PCR的研究发现，混合嵌合状态的患者，如自身成分持续增加，复发的危险明显加大；如自身成分持续下降，则往往转变为供体型嵌合状态或保持在持续的缓解状态[6]。在我们的研究中， 11例显示供体型嵌合状态，4例混合型嵌合状态，其中2例在移植后4个月复发(1例CML，1例ALL)，其中CML患者经DLI后再次缓解。目前还不能得出存在混合嵌合状态的移植患者复发率高于供体型患者的结论。这可能与病例数少有关。我们未进行PCR定量，不能说明出现混合嵌合状态后其自身成分的变化，但我们确实在患者出现临床复发以前发现了混合嵌合状态的存在，而且观察到混合嵌合状态向两个方向发展。为此，我们认为，如有条件应对其进行定量，连续追踪随访；及早发现复发征象，及时进行相应处理。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870710)；上海市卫生系统“百人计划”资助项目
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参考文献
1，Amitage J. Bone marrow transplantation. New Engl J Med, 1994, 330: 827-838.
2，孟沛霖，闵碧荷主编.实用血液病手册.北京：人民军医出版社，1998，302.
3，Martinelli G, Trabetti E, Zaccaria A, et al. In vitro amplification of hypervariable DNA regions for the evaluation of chimerism after allogenetic BMT. Bone Marrow Transplant, 1993, 12:115-120.
4，Ramirez M, Diaz M, Garcia-Sanchez F, et al. Chimerism after allogeneic hematopoietic cell transplantation in childhood acute lymphoblastic leukemia. Bone Marrow Transplant, 1996, 18: 1161-1165.
, 百拇医药
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(收稿日期：2000-01-10), 百拇医药