酵母双杂合体系验证与丙型肝炎病毒E2蛋白相作用的蛋白
作者：梁庆华 谢尧 蒋栋 陶其敏
单位：北京大学肝病研究所100044
关键词：
中华医学杂志001126 丙型肝炎病毒(HCV)是导致经血液传播非甲非乙型肝炎的主要病原，具有很强的宿主特异性，这有碍HCV的体外培养及对病毒生活周期的研究，而其宿主特异性又决定于病毒入胞水平。因此，对HCV的入胞机制的研究就尤为关键。HCV E2是HCV病毒表面蛋白的主要组成部分并含有中和位点。被认为是HCV与靶细胞相结合的位点。E1与E2在结构上是紧密相关的[1]，由于上述两个原因，我们能够单独研究E2蛋白，来寻找与E2蛋白相作用的配体，据报道[2]，丙型肝炎病毒(HCV)可能是通过肝细胞膜上的低密度脂蛋白受体(LDLR)进入肝细胞的，LDLR能够在体外阻断HCV与人的成纤维细胞结合。本文利用酵母双杂合方法来鉴定HCV E2蛋白是否直接与LDLR相结合，以便进一步阐明HCV感染宿主细胞的机制，为HCV感染的防治提供理论依据。
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一、材料方法
1.材料：所用内切酶等工具酶均购自美国Promega公司，其余生化试剂均为国产或进口分析纯试剂。
2.方法：(1)载体的构建：①“诱饵”克隆的建立参阅文献[3]。②“激活”克隆的建立，含有LDLR的质粒pLDLR-2由David W.Russell惠赠，引物序列(LDL1 56-71(+)5′-TATACCCGGGGACTGCAGTGGGCG-3′，LDL2 2212-2230(-)5′-GATCCTCGAGTCACGCTACTGGGCTTCTTC-3′)包含SmaⅠ和XhoⅠ酶切位点。扩增出不含跨膜区(TMD)的LDLR片段。将此片段连于含GAL4 DNA激活序列的载体pACT2中。测序证实，重组克隆的重组方向及开放读码框架均正确无误。③对照克隆：阳性对照：表达DNA-BD/p53融合蛋白的载体pVA3-1，编码AD/SV40大T-抗原融合蛋白的载体pTD1-1，p53蛋白能够与SV40大T-抗原结合。含有野生型全长GAL4基因的载体pCL1；阴性对照：在pAS2-1中装有核膜蛋白序列的载体pLAM5′-1。(2)酵母菌株及培养基：Y187、Y190(trp，leu
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基因缺失，带有LacZ报告基因)AH109(trp，leu，his，ade2基因缺失，带有LacZ报告基因)用YPD培养基培养：转化DNA结合结构域质粒后，用色氨酸营养缺乏培养基(DO/-trp)选择性培养；转化DNA激活结构域质粒后，用亮氨酸营养缺乏培养基(DO/-leu)选择性培养；两种质粒共同转化后，用DO/-trp-leu和DO/-trp-leu-his培养基培养。(3)细菌菌株质粒扩增：大肠杆菌JM105为本所保留菌株，用于此实验各种载体的扩增，质粒的提取用碱裂解法[4]。(4)酵母转化方法：用乙酸锂转化法[4]。(5)LacZ活性测定：用滤膜印迹法。将两种质粒共转化后，生长于DO/-trp-leu中的菌落印迹到无菌Whatman滤纸上，液氮中浸泡10～15 s×2次，将滤纸菌面向上，置于浸有Z缓冲液/x-gal的滤纸上面，防止气泡产生，30℃温育，在25 min至8 h变兰的菌落为阳性克隆，超过8 h变兰的为假阳性。(6)PCR：利用PCR由共转化后酵母细胞裂解液中分别扩增E2、LDLR基因序列，鉴定Y187中是否转入含E2和LDLR序列的载体。(7)利用Western杂交鉴定酵母细胞中是否有HCV E2及LDLR蛋白表达[4]。
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二、结果
1.阳性克隆的建立：用重组质粒pAS2-1-E2-661及阳性对照pVA3-1、阴性对照pLAM5′-1，同时分别转入酵母细胞中，用DO\-trp培养基筛选出阳性克隆。
2.细胞内外源DNA的检测：转化pAS2-1-E2-661的阳性克隆，经玻璃珠(美国Sigma公司)涡旋振荡，酚-氯仿-异戊醇抽提后，PCR扩增，琼脂糖电泳可见特异性目的DNA片段，而转化pAS2-1的克隆无特异性目的DNA片段。
3.E2融合蛋白的表达：培养酵母细胞的裂解产物，经SDS-PAGE电泳，Western杂交，在阳性菌株中可见与GAL4-BD单克隆抗体反应的特异性杂交带，证明HCV E2在酵母细胞中有表达(图1)。
4.LDLR融合蛋白的表达：培养酵母细胞的裂解产物，Western杂交，阳性菌株中同样可见与抗GAL4-AD单克隆抗体反应的特异性杂交带，说明LDLR在酵母细胞中的表达(图2)。
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图1 转化pAS2-1-E2-661后的酵母蛋白抽提物
Western blot结果
图2 转化pACT2-LDLR后的酵母蛋白抽提物Western blot结果
5.E2与LDLR蛋白自身激活作用的检测：经滤膜显色分析，分别印迹有E2和LDLR转化菌株的滤纸，30℃温育8 h未见有蓝色克隆显示；而阳性对照，印迹有pCL1转化菌株的滤纸在与Z缓冲液/x-gal 30℃温育30 min就开始有蓝色克隆显示，50 min后所有克隆均显出蓝色；阴性对照，印迹有pLAM5′-1转化菌落的滤纸与Z缓冲液/x-gal温育8 h未见有克隆变蓝。说明E2与LDLR蛋白在酵母细胞体内没有自身激活作用(图3)。
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图3 滤膜杂交结果
6.E2与LDLR双杂合结果：共转入质粒pAS2-1-E2-661和pCAT2-LDLR的酵母细胞AH109、Y190和Y187在DO/-trp-leu-his筛选培养基上没有菌落生长；而DO/-trp-leu培养基上生长的克隆数与阴性对照无显著性差异。经滤膜显色分析，印迹有E2与LDLR共转化菌株的滤纸和阴性对照，30℃温育8 h未见有蓝色克隆显示；而阳性对照，印迹有pVA3-1和pTD1-1共转化菌株的滤纸在与Z缓冲液/x-gal 30℃温育30 min就开始有蓝色克隆显示，50 min后所有克隆均显出蓝色。说明E2与LDLR在酵母体内没有相互结合。
三、讨论
HCV E2蛋白是HCV的一种结构蛋白，是由宿主和病毒基因编码的蛋白酶从HCV多蛋白前体切割下来所形成。E2蛋白的C末端有一疏水序列，此区对E2蛋白具有膜锚定作用。研究表明，删去此疏水区(C末端至少31个氨基酸)能够产生分泌型的、可溶的E2蛋白。但是，只有一种较短的分泌型的E2蛋白，即C末端位于第661个氨基酸，才能够正确折叠。因此，通过对分泌型的、可溶的、能够正确折叠的E2蛋白与宿主细胞膜上蛋白的相互作用的研究，有望寻找到HCV的受体，从而为利用受体模拟分子预防和治疗丙型肝炎打下基础[4，5]。有关LDLR作为HCV入胞受体的研究已有报道[6-8]。
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酵母双杂合体系是在体内检测两个蛋白间的相互作用的。真核蛋白在此系统中更能保持其原有的结构和功能[9]。此系统已广泛应用于蛋白间的相互作用。配体与膜受体的结合是一类重要的蛋白间相互作用。在酵母双杂合系统中，两种融合蛋白的相互作用是发生在酵母细胞核中的，胞膜蛋白常常有由二硫键维系的复杂的三维结构。因此，过去通常认为，酵母双杂合系统不适用于胞膜蛋白间的反应。但是，目前此系统不仅被应用于细胞蛋白与病毒蛋白间的相互作用，而且广泛应用于不同的蛋白-受体间作用[9]。通过受体/配体相互作用的观察，人们逐步认识到：酵母细胞内实际上比预想的更容易形成二硫键。而且，一些研究显示，非糖基化受体与配体结合的亲和力几乎没有变化。
我们应用此系统检测HCV E2-661蛋白是否能与LDLR在体内直接结合。两种蛋白都不包含跨膜区，他们能够被融合蛋白GAL4引导入细胞核。此实验设有阴阳性对照，在3种不同菌种中多次重复，结果一致。因此，本实验认为，HCV可能是通过LDL为桥梁经LDLR进入细胞的，而非直接与LDLR结合而进入宿主细胞。
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参考文献
1，Michalak JP, Wychowski C, Choukhi A, et al. Charactorization of truncated forms of hepatitis C glyproteins. J Gen Virol, 1997,78：2299-2306.
2，Agnello V, Abel G, Zhang QX, et al. Low density lipoprotein Receptor (LDLR) Mediated Endocytosis of Hepatitis C virus (HCV): A Potential Mechanism For Infection of Hepatocytes. On Viral Hepatitis and Liver Disease, Abstract Volume (Rome Italy) 1996,158.
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3，梁庆华，蒋栋，谢尧，等.丙型肝炎病毒E2蛋白作为酵母双杂交体系饵载体的构建及表达.北京医科大学学报，2000，32：11-14.
4，Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular biology, 3th ed. New York: John Wiley ＆ Son Inc, 1993.74：205-214.
5，Rosa D, Campagnoli S, Mretto C, et al. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93：1759-1763.
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6，Monazahian M, Bohme I, Bonk S, et al. Low Density Lipoprotein Receptor as a Candidate Receptor for Hepatitis C Virus. J Med Virol, 1999,57：223-229.
7，Kanto T, Hayashi N, Takehara T, et al. Buoyant density of hepatitis C Virus recovered from infected host: two different features in sucrose equilibrium density-gradient centrifugation related to degree of liver inflammation. Hepatology, 1994,19：296-302.
8，Bradley DW, Maynard JE, Popper H, et al. Posttransfusion non-A, non-B hepatitis in chimpanzees. Physicochemical evidence that the tubule-forming agent is a small, enveloped virus. Gastroenterology, 1985,88：773-779.
9，Ozenberger BA, Young KH. Functional interaction of ligands and receptors of the hemitopoietic superfamily in yeast. Mol Endocrinol, 1995,9：1321-1329.
(收稿日期：2000-02-24), http://www.100md.com
单位：北京大学肝病研究所100044
关键词：
中华医学杂志001126 丙型肝炎病毒(HCV)是导致经血液传播非甲非乙型肝炎的主要病原，具有很强的宿主特异性，这有碍HCV的体外培养及对病毒生活周期的研究，而其宿主特异性又决定于病毒入胞水平。因此，对HCV的入胞机制的研究就尤为关键。HCV E2是HCV病毒表面蛋白的主要组成部分并含有中和位点。被认为是HCV与靶细胞相结合的位点。E1与E2在结构上是紧密相关的[1]，由于上述两个原因，我们能够单独研究E2蛋白，来寻找与E2蛋白相作用的配体，据报道[2]，丙型肝炎病毒(HCV)可能是通过肝细胞膜上的低密度脂蛋白受体(LDLR)进入肝细胞的，LDLR能够在体外阻断HCV与人的成纤维细胞结合。本文利用酵母双杂合方法来鉴定HCV E2蛋白是否直接与LDLR相结合，以便进一步阐明HCV感染宿主细胞的机制，为HCV感染的防治提供理论依据。
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一、材料方法
1.材料：所用内切酶等工具酶均购自美国Promega公司，其余生化试剂均为国产或进口分析纯试剂。
2.方法：(1)载体的构建：①“诱饵”克隆的建立参阅文献[3]。②“激活”克隆的建立，含有LDLR的质粒pLDLR-2由David W.Russell惠赠，引物序列(LDL1 56-71(+)5′-TATACCCGGGGACTGCAGTGGGCG-3′，LDL2 2212-2230(-)5′-GATCCTCGAGTCACGCTACTGGGCTTCTTC-3′)包含SmaⅠ和XhoⅠ酶切位点。扩增出不含跨膜区(TMD)的LDLR片段。将此片段连于含GAL4 DNA激活序列的载体pACT2中。测序证实，重组克隆的重组方向及开放读码框架均正确无误。③对照克隆：阳性对照：表达DNA-BD/p53融合蛋白的载体pVA3-1，编码AD/SV40大T-抗原融合蛋白的载体pTD1-1，p53蛋白能够与SV40大T-抗原结合。含有野生型全长GAL4基因的载体pCL1；阴性对照：在pAS2-1中装有核膜蛋白序列的载体pLAM5′-1。(2)酵母菌株及培养基：Y187、Y190(trp，leu
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基因缺失，带有LacZ报告基因)AH109(trp，leu，his，ade2基因缺失，带有LacZ报告基因)用YPD培养基培养：转化DNA结合结构域质粒后，用色氨酸营养缺乏培养基(DO/-trp)选择性培养；转化DNA激活结构域质粒后，用亮氨酸营养缺乏培养基(DO/-leu)选择性培养；两种质粒共同转化后，用DO/-trp-leu和DO/-trp-leu-his培养基培养。(3)细菌菌株质粒扩增：大肠杆菌JM105为本所保留菌株，用于此实验各种载体的扩增，质粒的提取用碱裂解法[4]。(4)酵母转化方法：用乙酸锂转化法[4]。(5)LacZ活性测定：用滤膜印迹法。将两种质粒共转化后，生长于DO/-trp-leu中的菌落印迹到无菌Whatman滤纸上，液氮中浸泡10～15 s×2次，将滤纸菌面向上，置于浸有Z缓冲液/x-gal的滤纸上面，防止气泡产生，30℃温育，在25 min至8 h变兰的菌落为阳性克隆，超过8 h变兰的为假阳性。(6)PCR：利用PCR由共转化后酵母细胞裂解液中分别扩增E2、LDLR基因序列，鉴定Y187中是否转入含E2和LDLR序列的载体。(7)利用Western杂交鉴定酵母细胞中是否有HCV E2及LDLR蛋白表达[4]。
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二、结果
1.阳性克隆的建立：用重组质粒pAS2-1-E2-661及阳性对照pVA3-1、阴性对照pLAM5′-1，同时分别转入酵母细胞中，用DO\-trp培养基筛选出阳性克隆。
2.细胞内外源DNA的检测：转化pAS2-1-E2-661的阳性克隆，经玻璃珠(美国Sigma公司)涡旋振荡，酚-氯仿-异戊醇抽提后，PCR扩增，琼脂糖电泳可见特异性目的DNA片段，而转化pAS2-1的克隆无特异性目的DNA片段。
3.E2融合蛋白的表达：培养酵母细胞的裂解产物，经SDS-PAGE电泳，Western杂交，在阳性菌株中可见与GAL4-BD单克隆抗体反应的特异性杂交带，证明HCV E2在酵母细胞中有表达(图1)。
4.LDLR融合蛋白的表达：培养酵母细胞的裂解产物，Western杂交，阳性菌株中同样可见与抗GAL4-AD单克隆抗体反应的特异性杂交带，说明LDLR在酵母细胞中的表达(图2)。
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图1 转化pAS2-1-E2-661后的酵母蛋白抽提物
Western blot结果
图2 转化pACT2-LDLR后的酵母蛋白抽提物Western blot结果
5.E2与LDLR蛋白自身激活作用的检测：经滤膜显色分析，分别印迹有E2和LDLR转化菌株的滤纸，30℃温育8 h未见有蓝色克隆显示；而阳性对照，印迹有pCL1转化菌株的滤纸在与Z缓冲液/x-gal 30℃温育30 min就开始有蓝色克隆显示，50 min后所有克隆均显出蓝色；阴性对照，印迹有pLAM5′-1转化菌落的滤纸与Z缓冲液/x-gal温育8 h未见有克隆变蓝。说明E2与LDLR蛋白在酵母细胞体内没有自身激活作用(图3)。
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图3 滤膜杂交结果
6.E2与LDLR双杂合结果：共转入质粒pAS2-1-E2-661和pCAT2-LDLR的酵母细胞AH109、Y190和Y187在DO/-trp-leu-his筛选培养基上没有菌落生长；而DO/-trp-leu培养基上生长的克隆数与阴性对照无显著性差异。经滤膜显色分析，印迹有E2与LDLR共转化菌株的滤纸和阴性对照，30℃温育8 h未见有蓝色克隆显示；而阳性对照，印迹有pVA3-1和pTD1-1共转化菌株的滤纸在与Z缓冲液/x-gal 30℃温育30 min就开始有蓝色克隆显示，50 min后所有克隆均显出蓝色。说明E2与LDLR在酵母体内没有相互结合。
三、讨论
HCV E2蛋白是HCV的一种结构蛋白，是由宿主和病毒基因编码的蛋白酶从HCV多蛋白前体切割下来所形成。E2蛋白的C末端有一疏水序列，此区对E2蛋白具有膜锚定作用。研究表明，删去此疏水区(C末端至少31个氨基酸)能够产生分泌型的、可溶的E2蛋白。但是，只有一种较短的分泌型的E2蛋白，即C末端位于第661个氨基酸，才能够正确折叠。因此，通过对分泌型的、可溶的、能够正确折叠的E2蛋白与宿主细胞膜上蛋白的相互作用的研究，有望寻找到HCV的受体，从而为利用受体模拟分子预防和治疗丙型肝炎打下基础[4，5]。有关LDLR作为HCV入胞受体的研究已有报道[6-8]。
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酵母双杂合体系是在体内检测两个蛋白间的相互作用的。真核蛋白在此系统中更能保持其原有的结构和功能[9]。此系统已广泛应用于蛋白间的相互作用。配体与膜受体的结合是一类重要的蛋白间相互作用。在酵母双杂合系统中，两种融合蛋白的相互作用是发生在酵母细胞核中的，胞膜蛋白常常有由二硫键维系的复杂的三维结构。因此，过去通常认为，酵母双杂合系统不适用于胞膜蛋白间的反应。但是，目前此系统不仅被应用于细胞蛋白与病毒蛋白间的相互作用，而且广泛应用于不同的蛋白-受体间作用[9]。通过受体/配体相互作用的观察，人们逐步认识到：酵母细胞内实际上比预想的更容易形成二硫键。而且，一些研究显示，非糖基化受体与配体结合的亲和力几乎没有变化。
我们应用此系统检测HCV E2-661蛋白是否能与LDLR在体内直接结合。两种蛋白都不包含跨膜区，他们能够被融合蛋白GAL4引导入细胞核。此实验设有阴阳性对照，在3种不同菌种中多次重复，结果一致。因此，本实验认为，HCV可能是通过LDL为桥梁经LDLR进入细胞的，而非直接与LDLR结合而进入宿主细胞。
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参考文献
1，Michalak JP, Wychowski C, Choukhi A, et al. Charactorization of truncated forms of hepatitis C glyproteins. J Gen Virol, 1997,78：2299-2306.
2，Agnello V, Abel G, Zhang QX, et al. Low density lipoprotein Receptor (LDLR) Mediated Endocytosis of Hepatitis C virus (HCV): A Potential Mechanism For Infection of Hepatocytes. On Viral Hepatitis and Liver Disease, Abstract Volume (Rome Italy) 1996,158.
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3，梁庆华，蒋栋，谢尧，等.丙型肝炎病毒E2蛋白作为酵母双杂交体系饵载体的构建及表达.北京医科大学学报，2000，32：11-14.
4，Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular biology, 3th ed. New York: John Wiley ＆ Son Inc, 1993.74：205-214.
5，Rosa D, Campagnoli S, Mretto C, et al. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93：1759-1763.
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6，Monazahian M, Bohme I, Bonk S, et al. Low Density Lipoprotein Receptor as a Candidate Receptor for Hepatitis C Virus. J Med Virol, 1999,57：223-229.
7，Kanto T, Hayashi N, Takehara T, et al. Buoyant density of hepatitis C Virus recovered from infected host: two different features in sucrose equilibrium density-gradient centrifugation related to degree of liver inflammation. Hepatology, 1994,19：296-302.
8，Bradley DW, Maynard JE, Popper H, et al. Posttransfusion non-A, non-B hepatitis in chimpanzees. Physicochemical evidence that the tubule-forming agent is a small, enveloped virus. Gastroenterology, 1985,88：773-779.
9，Ozenberger BA, Young KH. Functional interaction of ligands and receptors of the hemitopoietic superfamily in yeast. Mol Endocrinol, 1995,9：1321-1329.
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