动物模型中幽门螺杆菌的检测
作者：李秋生 徐德兴 孙桂华 田野
单位：李秋生(广州军区广州总医院检验科)；徐德兴(广州军区广州总医院检验科)；孙桂华(广州军区广州总医院消化内科)；田野(广州军区广州总医院病理科 510010)
关键词：
广东医学001108
幽门螺杆菌(Hp)是慢性胃炎及消化性溃疡的主要致病因素，并与胃癌发生密切相关，已被WHO列入第一级致癌物质[1]。因此，准确检测Hp对防治胃炎、消化性溃疡有重要意义。我们应用细菌培养鉴定、尿素酶试验、染色直接镜检和PCR四种方法检测动物模型中的Hp，以比较这些方法对Hp的检出率，为临床检测Hp提供参考。同时，本文还就Hp在消化道不同部位的感染进行了分析。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 实验动物 中国一号小型猪，由北京农业大学提供。足月妊娠母猪出现先兆后，于手术间内无菌剖腹取胎，将乳猪置于无菌隔离器内给予灭菌牛奶饲养。
1.2 Hp接种与标本来源 Hp为本实验室自己分离的菌种，鉴定为Hp； 小猪分试验组10只，对照组2只，在无菌条件下饲养2周后，试验组从口接种Hp，每只3 ml，浓度3×109 cfu/ml，每3天1次，共3次，给予Hp结束后第30天处死小猪，分别取口腔、食管、胃体、胃窦、十二指肠、小肠、大肠等处黏膜各2～5份不等送检；对照组不接种Hp，其他均按试验组处理。
1.3 细菌培养鉴定 标本接种于5%绵羊血布氏琼脂，5% O2，10% CO2，85% N2 37℃培养3～4 d后出现灰色、透明、凸起的菌落，革兰阴性杆菌，不发酵葡萄糖，氧化酶、尿素酶、过氧化氢酶均阳性，吲哚、硝酸盐还原及马尿酸水解均阴性，此为阳性结果。培养一周后不生长为阴性。
, 百拇医药
1.4 染色直接镜检 采用特异的Warthin-Starry银染色法，镜下见胃幽门螺杆菌呈棕黑至黑色，其余组织灰黄至黄棕色。
1.5 尿素酶试验 试剂自配，无菌2%尿素水溶液，酚红磷酸缓冲液各3滴滴于标本上，37℃温育30 min，变红色者为阳性。
1.6 PCR方法 采用上海复瑞生物工程公司的试剂盒，操作按试剂说明书；采用空肠弯曲菌、解脲支原体作为对照菌进行PCR，以此作为PCR方法的特异性对照。
2 结果
四种方法分别检测消化道黏膜标本Hp共220份，检出阳性数为PCR方法87、尿素酶试验61、镜检45、培养40。对照组及PCR方法中的特异性对照结果均为阴性。消化道黏膜每处2～5份标本各种方法中有1例为阳性即认为该处结果为阳性，结果见表1。
, http://www.100md.com 表1 4种检测方法检测不同
部位Hp的感染情况只 部位
PCR
尿素酶
镜检
培养
合计
口腔
3
3
3
2
11
, 百拇医药
食管
5
5
3
2
15
胃窦
10
9
8
8
35
胃体
7
, http://www.100md.com
6
5
5
23
十二指肠
5
5
5
4
19
小肠
1
0
0
, http://www.100md.com
0
1
大肠
4
3
3
3
13
3 讨论
3.1 4种检测方法的比较 从结果可以看出，4种检测方法的结果是有差异的，各种检测方法各有其特点，其中细菌培养鉴定的阳性结果表明有活菌的存在，其阳性结果最基本、最可靠的，但由于细胞培养费时、繁琐、影响因素多等影响了检出率[2]，四种方法中其检出率最低的。镜检法我们采用了特异性的Warthin-Strarry银染色法，镜下判断结果比较容易，但当Hp球形变及Hp“灶性”感染、取材、切片、镜检等均存在局限性，其检出率仍然较低。尿素酶试验在传统方法中是公认的简便、快速、准确的方法，本试验也证明了这一点，其检出率较前两种方法高，但Hp本身有一部分尿素酶转阴或减弱，及Hp数量很少时，易出现假阴性；另外产生尿素酶的常见菌有变形杆菌、耶氏菌、假单胞菌等，可导致Hp假阳性。从结果可以看出PCR方法在4种方法中其检出Hp的检出率最高，当Hp球形变、死亡或菌量过少时，用常规方法难以检出而PCR方法则可以检出，但PCR方法认为Hp的死菌、活菌、甚至裸核酸、有效核酸片段均为阳性结果。综上所述，PCR方法和尿素酶试验快速、准确，对Hp的检出率优于细菌培养和镜检方法，是检测Hp较为理想的方法。
, http://www.100md.com
3.2 不同部位的感染差异 胃黏膜是Hp的自然定植部位，Hp在消化道的感染主要是通过特异性的粘附因子与消化道黏膜上受体的结合，胃窦部黏膜的受体含量高于胃体的含量，从结果可以看出，在PCR方法中10例胃窦黏膜结果均为阳性，而胃体为7例。在大肠、十二指肠分别为4和5例，这主要与该处黏膜的胃化生有关。有关报道在肠黏膜上皮未见Hp定植，本试验在小肠黏膜中有1例是阳性，可能是路过菌或路过核酸。本试验结果表明，Hp在消化道的不同部位的感染是有差异的，其主要感染部位为胃窦，虽然与消化道的解剖结构、局部pH值等有关，但我们认为这主要是Hp含有特异性的粘附因子及消化道黏膜，主要是胃黏膜及胃黏膜化生的黏膜上皮含有与特异粘附因子结合的受体，至于是哪一种粘附因子及受体，有待进一步的研究。
参考文献
1，McFarlan GA, Munro A. Helicobacter Pylori and gastric cancer. Br J Surg, 1997, 84(9):1190
2，王雪梅，屈汉廷.检测Hp不同方法之比较. 北京医科大学学报，1997，26(6)：564
(收稿日期：2000-03-20), 百拇医药
单位：李秋生(广州军区广州总医院检验科)；徐德兴(广州军区广州总医院检验科)；孙桂华(广州军区广州总医院消化内科)；田野(广州军区广州总医院病理科 510010)
关键词：
广东医学001108
幽门螺杆菌(Hp)是慢性胃炎及消化性溃疡的主要致病因素，并与胃癌发生密切相关，已被WHO列入第一级致癌物质[1]。因此，准确检测Hp对防治胃炎、消化性溃疡有重要意义。我们应用细菌培养鉴定、尿素酶试验、染色直接镜检和PCR四种方法检测动物模型中的Hp，以比较这些方法对Hp的检出率，为临床检测Hp提供参考。同时，本文还就Hp在消化道不同部位的感染进行了分析。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 实验动物 中国一号小型猪，由北京农业大学提供。足月妊娠母猪出现先兆后，于手术间内无菌剖腹取胎，将乳猪置于无菌隔离器内给予灭菌牛奶饲养。
1.2 Hp接种与标本来源 Hp为本实验室自己分离的菌种，鉴定为Hp； 小猪分试验组10只，对照组2只，在无菌条件下饲养2周后，试验组从口接种Hp，每只3 ml，浓度3×109 cfu/ml，每3天1次，共3次，给予Hp结束后第30天处死小猪，分别取口腔、食管、胃体、胃窦、十二指肠、小肠、大肠等处黏膜各2～5份不等送检；对照组不接种Hp，其他均按试验组处理。
1.3 细菌培养鉴定 标本接种于5%绵羊血布氏琼脂，5% O2，10% CO2，85% N2 37℃培养3～4 d后出现灰色、透明、凸起的菌落，革兰阴性杆菌，不发酵葡萄糖，氧化酶、尿素酶、过氧化氢酶均阳性，吲哚、硝酸盐还原及马尿酸水解均阴性，此为阳性结果。培养一周后不生长为阴性。
, 百拇医药
1.4 染色直接镜检 采用特异的Warthin-Starry银染色法，镜下见胃幽门螺杆菌呈棕黑至黑色，其余组织灰黄至黄棕色。
1.5 尿素酶试验 试剂自配，无菌2%尿素水溶液，酚红磷酸缓冲液各3滴滴于标本上，37℃温育30 min，变红色者为阳性。
1.6 PCR方法 采用上海复瑞生物工程公司的试剂盒，操作按试剂说明书；采用空肠弯曲菌、解脲支原体作为对照菌进行PCR，以此作为PCR方法的特异性对照。
2 结果
四种方法分别检测消化道黏膜标本Hp共220份，检出阳性数为PCR方法87、尿素酶试验61、镜检45、培养40。对照组及PCR方法中的特异性对照结果均为阴性。消化道黏膜每处2～5份标本各种方法中有1例为阳性即认为该处结果为阳性，结果见表1。
, http://www.100md.com 表1 4种检测方法检测不同
部位Hp的感染情况只 部位
PCR
尿素酶
镜检
培养
合计
口腔
3
3
3
2
11
, 百拇医药
食管
5
5
3
2
15
胃窦
10
9
8
8
35
胃体
7
, http://www.100md.com
6
5
5
23
十二指肠
5
5
5
4
19
小肠
1
0
0
, http://www.100md.com
0
1
大肠
4
3
3
3
13
3 讨论
3.1 4种检测方法的比较 从结果可以看出，4种检测方法的结果是有差异的，各种检测方法各有其特点，其中细菌培养鉴定的阳性结果表明有活菌的存在，其阳性结果最基本、最可靠的，但由于细胞培养费时、繁琐、影响因素多等影响了检出率[2]，四种方法中其检出率最低的。镜检法我们采用了特异性的Warthin-Strarry银染色法，镜下判断结果比较容易，但当Hp球形变及Hp“灶性”感染、取材、切片、镜检等均存在局限性，其检出率仍然较低。尿素酶试验在传统方法中是公认的简便、快速、准确的方法，本试验也证明了这一点，其检出率较前两种方法高，但Hp本身有一部分尿素酶转阴或减弱，及Hp数量很少时，易出现假阴性；另外产生尿素酶的常见菌有变形杆菌、耶氏菌、假单胞菌等，可导致Hp假阳性。从结果可以看出PCR方法在4种方法中其检出Hp的检出率最高，当Hp球形变、死亡或菌量过少时，用常规方法难以检出而PCR方法则可以检出，但PCR方法认为Hp的死菌、活菌、甚至裸核酸、有效核酸片段均为阳性结果。综上所述，PCR方法和尿素酶试验快速、准确，对Hp的检出率优于细菌培养和镜检方法，是检测Hp较为理想的方法。
, http://www.100md.com
3.2 不同部位的感染差异 胃黏膜是Hp的自然定植部位，Hp在消化道的感染主要是通过特异性的粘附因子与消化道黏膜上受体的结合，胃窦部黏膜的受体含量高于胃体的含量，从结果可以看出，在PCR方法中10例胃窦黏膜结果均为阳性，而胃体为7例。在大肠、十二指肠分别为4和5例，这主要与该处黏膜的胃化生有关。有关报道在肠黏膜上皮未见Hp定植，本试验在小肠黏膜中有1例是阳性，可能是路过菌或路过核酸。本试验结果表明，Hp在消化道的不同部位的感染是有差异的，其主要感染部位为胃窦，虽然与消化道的解剖结构、局部pH值等有关，但我们认为这主要是Hp含有特异性的粘附因子及消化道黏膜，主要是胃黏膜及胃黏膜化生的黏膜上皮含有与特异粘附因子结合的受体，至于是哪一种粘附因子及受体，有待进一步的研究。
参考文献
1，McFarlan GA, Munro A. Helicobacter Pylori and gastric cancer. Br J Surg, 1997, 84(9):1190
2，王雪梅，屈汉廷.检测Hp不同方法之比较. 北京医科大学学报，1997，26(6)：564
(收稿日期：2000-03-20), 百拇医药