谷氨酰胺对大鼠急性坏死性胰腺炎肠道细菌移位的影响
作者：龚时文 张明 赵志毅 黄春南 黄擎雄 冯平
单位：广东省肇庆市第一人民医院外科，526021
关键词：胰腺炎；谷氨酰胺；细菌移位
中国急救医学001105 [摘 要] 目的 观察谷氨酰胺(Gln)对急性坏死性胰腺炎(ANP) 大鼠肠道细菌移位的影响。方法 动物共120只，随机分成对照组、 ANP组及Gln组，每组各40只，ANP模型采用结扎胰胆管诱发，Gln组制作ANP后灌入Gln，观察 3组肠粘膜组织学和DNA含量，肠系膜淋巴结，胰腺组织细菌培养及吖啶橙标记菌实验。结果 ANP后72小时肠粘膜出现明显损伤，DNA含量下降，肠系膜淋巴 结、胰腺组织细菌培养计数明显升高，吖啶橙标记菌移位率明显升高，应用Gln能明显减轻 肠粘膜损伤，降低上述指标。结论 Gln有利于维持ANP时肠粘膜屏 障功能，减少肠道细菌移位的发生。
, 百拇医药 [中图分类号] R 378；R 576 [文献标识码 ] A [文章编号] 1002-1949(2000)11-0640-02
Influence of Glutamine on bacterial translocation of rats with acute necrotizing pancreatitis
GONG Shi-wen,ZHANG Ming,ZHAO Zhi-yi
(Zhaoqing F irst People's Hospital,Zhaoqing 526021,China)
[Abstract] Objective The influence of Glutamine on bacterial transl ocation of rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) was observed. Methods A total of 120 rats were studied,the rats were divided rando mly into three groups(control,ANP and Glutamine group)(n=40 each).ANP model wa s induced by obstruction of biliopancreatic duct,the rats in Glutamine group wer e fed Glutamine after ANP induced,the histology and DNA of mucosa ,the quantity of bacteria cultured and E coli labelled with acridine orange of mesentery lymp hy node (MLN)and pancrease were observed.Results The mucosa was significantly damaged.DNA of mucosa was decreased significantly(P<0.0 1),t he quantity of bacteria cultured and E coli labelled with acridine orange in MLN and pancrease was increased significantly(P<0.01) in ANP group,the mucous inj ury could be reduced and the quantity could be decreased in Glutamine group.Conclusion The study suggested that Glutamine could be helpful to maintain the mucous barrier function and decrease bacterial translocation in ANP.
, http://www.100md.com
[Key words] Pancreatitis； Glutamine； Bacterial transl ocation
近来研究提示40%～60%急性坏死性胰腺炎(ANP)患者坏死胰腺组织并发细菌感染，而此预 后常是致命的[1]，许多实验证实肠道细菌移位在ANP感染中起重要作用，但无 确切有效的防治方法[2]。谷氨酰胺(Gln)为体内最丰富的氨基酸，是肠道不可缺 少的物质，是肠道细胞的重要燃料和氮源，它可刺激肠道粘膜的生长，能减少严重烧伤、放 疗、TPN等时肠道细菌移位[3]。本实验观察了Gln对ANP肠道细菌移位的影响， 旨在探索其防治措施。
1 材料和方法
1.1 动物分组及处理 SD雄性大鼠120只，体重250±50 g，随机分为对照组、ANP组及Gln 组(表1)。对照组：动物1%戊巴比妥钠0.3 ml/100 g鼠重腹腔注射麻醉，消毒后剖腹，再 关腹，4 h后自由饮食、饮水，每12 h灌入生理盐水一次0.75 ml/100 g鼠重。ANP组：动物 1%戊巴比妥钠0.3 ml/100 g鼠重腹腔注射麻醉，消毒后剖腹，距十二指肠丝线结扎胰胆管 开口，诱发ANP，4 h后每12 h灌入生理盐水一次(0.75 ml/100 g鼠重)，自由饮食，饮水。Gln组：制ANP后4 h，每12 h l0%Gln(0.75 ml/100 g鼠重)灌胃一次，自由饮食，饮水。
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表1 动物分组及处理 分组
动物数(只)
观测时间(h)
观测项目
对照组
10
72
细菌培养、组织学
10
72
肠粘膜DNA
20
72
, 百拇医药
吖啶橙标记菌
ANP组
10
72
细菌培养、组织学
10
72
肠粘膜DNA
20
72
吖啶橙标记菌
Gln组
10
, http://www.100md.com
72
细菌培养、组织学
10
72
肠粘膜DNA
20
72
吖啶橙标记菌
1.2 吖啶橙标记菌示踪试验 大肠杆菌(ATCC 25 922)菌液中加入1/10 000的吖啶橙，LB 培养基37℃振荡培养过夜，制成2×108/ml菌液备用。对照组和ANP组48 h后胃内插管给 予10 ml/kg鼠重吖啶橙标记菌液，24 h后动物麻醉取出肠系膜淋巴结，胰腺组 织制成10%的匀浆，取50 μl在荧光显微镜(20×20)下观察标记细菌是否存在(标记菌存在 者为阳性)，并计算标记细菌移位率。
, 百拇医药
1.3 肠粘膜DNA测定 用STS法分离核酸，二苯胺法测定单位长度肠组织粘膜DNA含量(μg/ cm，长度小肠)。
1.4 肠系膜淋巴结、胰腺组织细菌定量培养 无菌条件下取肠系膜淋巴结、胰腺组织行细 菌定量培养(37℃，24小时)。
1.5 肠粘膜组织学检查 肠粘膜光镜透射电镜检查均按常规方法进行。
2 结果
2.1 荧光标记菌示踪实验 ANP组肠系膜淋巴结，胰腺组织荧光标记菌检出率较对照组明 显升高(P<0.01)，Gln组较ANP组明显下降(P<0.01)，见表2。
表2 三组大鼠标记菌检出率(%) 分组
动物数(只)
, 百拇医药
肠系膜淋巴结
胰腺
对照组
20
10
5
ANP组
20
100
40
Gln
20
45
, 百拇医药 10
2.2 肠系膜淋巴结、胰腺组织细菌定量培养 ANP组较对照组明显升高(P<0.01)，G ln组较ANP组明显下降(P<0.01)，见表3。表3 细菌定量培养结果(cfu/g) 分 组
动物数(只)
肠系膜淋巴结
胰腺
对照组
10
14.5±2.0
5.40±2.60
ANP组
10
, http://www.100md.com
325.27±50.52
62.52±21.40
Gln组
10
154.20±36.42
20.40±15.46
2.3 肠粘膜DNA含量 ANP组较对照组明显下降(P<0.01)，Gln组较ANP组明显上升( P<0.01)，见表4。表4 3组大鼠肠粘膜DNA含量(μg/cm) 分组
动物数(只)
DNA含量
对照组
, 百拇医药
10
70.04±9.05
ANP组
10
32.31±6.18
Gln组
10
60.35±4.57
2.4 肠粘膜组织学检查 光镜观察，对照组未见异常；ANP组绒毛上皮坏死脱落，绒毛顶 端间质显著水肿，血管扩张充血，固有膜中度水肿并炎症细胞浸润；Gln组肠粘膜损伤较A NP组明显减轻，表现为绒毛变短，固有膜轻度水肿和炎症细胞浸润。电镜观察，对照组未见 异常；ANP组：肠粘膜上皮微绒毛稀疏，脱落，基质外溢，线粒体空泡样变，内质网肿胀， 上皮细胞桥粒连接断裂；Gln组：肠粘膜上皮微绒毛排列紊乱，线粒体及内质网轻度肿胀。
, http://www.100md.com
3 讨论
本实验结果发现，大鼠诱发ANP后72小时，肠粘膜DNA含量明显下降，组织学检查示肠粘膜出 现明显的病理损害，肠系膜淋巴结，胰腺组织细菌定量培养较对照组明显升高，吖啶橙标记 大肠杆菌示踪直接显示大肠杆菌移位致肠系膜淋巴结，胰腺组织明显增加，这表明ANP大鼠 存在显著的肠粘膜屏障功能损害，肠细菌发生移位，这与Runkel等[4]的结论基本 一致，进一步证实了ANP时肠细菌移位。
肠道是消耗Gln的主要器官，其主要功能是为肠道上皮细胞提供能源，为上皮细胞合成蛋白 质、DNA提供原料，因此，Gln在肠上皮细胞正常代谢中起非常重要的作用[3]。Hu ghers[5]证实，应用标准TPN(即不含Gln)对大鼠静脉营养8天后发现，空肠粘膜明 显萎缩，但当在TPN液中加入Gln后，则可减轻它的萎缩程度。本实验研究发现，给予ANP大 鼠Gln能增加肠粘膜DNA含量，减轻肠粘膜病理损害，保护肠粘膜屏障功能，减少肠道细菌移 位。实验说明，补充Gln使肠粘膜有足够的氧化底物，产生大量的ATP，维持细胞的代谢及细 胞间 连接，促进肠粘膜细胞的分裂增殖、代谢等，加快上皮细胞的增生修复，有利于保护肠粘膜 屏障功能，减少肠道细菌的移位，为临床应用Gln防止ANP肠道细菌移位提供了依据。
, 百拇医药
[基金项目] 广东省医学科研基金 课题(B1997155)
[1]Beger HG,Bittner R,Blocks,et al.Bacterial contamiation of pancreati c necrosis[J].Gastroenterology,1986,91:433.
[2]Kazantsev GB，Hecht DW,Rao R,et al.Bacterial translocation in pancre atitis[J].Am J Surg,1994,207:201.
[3]白满喜，蒋朱明.谷氨酰胺对胃肠外营养时细菌移位的影响[J].普外临床 ，1996，11(4)：209.
[4]Runkel NE,Moody F,Smith GS,et al.The role of the gut in the developm ent of sepsis in acute pancreatitis[J]. J Surg Res ,1991,51:18.
[5]Hughes CA,Dowling RH.Speed of onset of adaptive mucosal hypoplosia and hypofunction in the intestine of parenterally fed rats[J].Clinical Science ,1980,59:317.
[收稿：1999-11-15], 百拇医药
单位：广东省肇庆市第一人民医院外科，526021
关键词：胰腺炎；谷氨酰胺；细菌移位
中国急救医学001105 [摘 要] 目的 观察谷氨酰胺(Gln)对急性坏死性胰腺炎(ANP) 大鼠肠道细菌移位的影响。方法 动物共120只，随机分成对照组、 ANP组及Gln组，每组各40只，ANP模型采用结扎胰胆管诱发，Gln组制作ANP后灌入Gln，观察 3组肠粘膜组织学和DNA含量，肠系膜淋巴结，胰腺组织细菌培养及吖啶橙标记菌实验。结果 ANP后72小时肠粘膜出现明显损伤，DNA含量下降，肠系膜淋巴 结、胰腺组织细菌培养计数明显升高，吖啶橙标记菌移位率明显升高，应用Gln能明显减轻 肠粘膜损伤，降低上述指标。结论 Gln有利于维持ANP时肠粘膜屏 障功能，减少肠道细菌移位的发生。
, 百拇医药 [中图分类号] R 378；R 576 [文献标识码 ] A [文章编号] 1002-1949(2000)11-0640-02
Influence of Glutamine on bacterial translocation of rats with acute necrotizing pancreatitis
GONG Shi-wen,ZHANG Ming,ZHAO Zhi-yi
(Zhaoqing F irst People's Hospital,Zhaoqing 526021,China)
[Abstract] Objective The influence of Glutamine on bacterial transl ocation of rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) was observed. Methods A total of 120 rats were studied,the rats were divided rando mly into three groups(control,ANP and Glutamine group)(n=40 each).ANP model wa s induced by obstruction of biliopancreatic duct,the rats in Glutamine group wer e fed Glutamine after ANP induced,the histology and DNA of mucosa ,the quantity of bacteria cultured and E coli labelled with acridine orange of mesentery lymp hy node (MLN)and pancrease were observed.Results The mucosa was significantly damaged.DNA of mucosa was decreased significantly(P<0.0 1),t he quantity of bacteria cultured and E coli labelled with acridine orange in MLN and pancrease was increased significantly(P<0.01) in ANP group,the mucous inj ury could be reduced and the quantity could be decreased in Glutamine group.Conclusion The study suggested that Glutamine could be helpful to maintain the mucous barrier function and decrease bacterial translocation in ANP.
, http://www.100md.com
[Key words] Pancreatitis； Glutamine； Bacterial transl ocation
近来研究提示40%～60%急性坏死性胰腺炎(ANP)患者坏死胰腺组织并发细菌感染，而此预 后常是致命的[1]，许多实验证实肠道细菌移位在ANP感染中起重要作用，但无 确切有效的防治方法[2]。谷氨酰胺(Gln)为体内最丰富的氨基酸，是肠道不可缺 少的物质，是肠道细胞的重要燃料和氮源，它可刺激肠道粘膜的生长，能减少严重烧伤、放 疗、TPN等时肠道细菌移位[3]。本实验观察了Gln对ANP肠道细菌移位的影响， 旨在探索其防治措施。
1 材料和方法
1.1 动物分组及处理 SD雄性大鼠120只，体重250±50 g，随机分为对照组、ANP组及Gln 组(表1)。对照组：动物1%戊巴比妥钠0.3 ml/100 g鼠重腹腔注射麻醉，消毒后剖腹，再 关腹，4 h后自由饮食、饮水，每12 h灌入生理盐水一次0.75 ml/100 g鼠重。ANP组：动物 1%戊巴比妥钠0.3 ml/100 g鼠重腹腔注射麻醉，消毒后剖腹，距十二指肠丝线结扎胰胆管 开口，诱发ANP，4 h后每12 h灌入生理盐水一次(0.75 ml/100 g鼠重)，自由饮食，饮水。Gln组：制ANP后4 h，每12 h l0%Gln(0.75 ml/100 g鼠重)灌胃一次，自由饮食，饮水。
, http://www.100md.com
表1 动物分组及处理 分组
动物数(只)
观测时间(h)
观测项目
对照组
10
72
细菌培养、组织学
10
72
肠粘膜DNA
20
72
, 百拇医药
吖啶橙标记菌
ANP组
10
72
细菌培养、组织学
10
72
肠粘膜DNA
20
72
吖啶橙标记菌
Gln组
10
, http://www.100md.com
72
细菌培养、组织学
10
72
肠粘膜DNA
20
72
吖啶橙标记菌
1.2 吖啶橙标记菌示踪试验 大肠杆菌(ATCC 25 922)菌液中加入1/10 000的吖啶橙，LB 培养基37℃振荡培养过夜，制成2×108/ml菌液备用。对照组和ANP组48 h后胃内插管给 予10 ml/kg鼠重吖啶橙标记菌液，24 h后动物麻醉取出肠系膜淋巴结，胰腺组 织制成10%的匀浆，取50 μl在荧光显微镜(20×20)下观察标记细菌是否存在(标记菌存在 者为阳性)，并计算标记细菌移位率。
, 百拇医药
1.3 肠粘膜DNA测定 用STS法分离核酸，二苯胺法测定单位长度肠组织粘膜DNA含量(μg/ cm，长度小肠)。
1.4 肠系膜淋巴结、胰腺组织细菌定量培养 无菌条件下取肠系膜淋巴结、胰腺组织行细 菌定量培养(37℃，24小时)。
1.5 肠粘膜组织学检查 肠粘膜光镜透射电镜检查均按常规方法进行。
2 结果
2.1 荧光标记菌示踪实验 ANP组肠系膜淋巴结，胰腺组织荧光标记菌检出率较对照组明 显升高(P<0.01)，Gln组较ANP组明显下降(P<0.01)，见表2。
表2 三组大鼠标记菌检出率(%) 分组
动物数(只)
, 百拇医药
肠系膜淋巴结
胰腺
对照组
20
10
5
ANP组
20
100
40
Gln
20
45
, 百拇医药 10
2.2 肠系膜淋巴结、胰腺组织细菌定量培养 ANP组较对照组明显升高(P<0.01)，G ln组较ANP组明显下降(P<0.01)，见表3。表3 细菌定量培养结果(cfu/g) 分 组
动物数(只)
肠系膜淋巴结
胰腺
对照组
10
14.5±2.0
5.40±2.60
ANP组
10
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325.27±50.52
62.52±21.40
Gln组
10
154.20±36.42
20.40±15.46
2.3 肠粘膜DNA含量 ANP组较对照组明显下降(P<0.01)，Gln组较ANP组明显上升( P<0.01)，见表4。表4 3组大鼠肠粘膜DNA含量(μg/cm) 分组
动物数(只)
DNA含量
对照组
, 百拇医药
10
70.04±9.05
ANP组
10
32.31±6.18
Gln组
10
60.35±4.57
2.4 肠粘膜组织学检查 光镜观察，对照组未见异常；ANP组绒毛上皮坏死脱落，绒毛顶 端间质显著水肿，血管扩张充血，固有膜中度水肿并炎症细胞浸润；Gln组肠粘膜损伤较A NP组明显减轻，表现为绒毛变短，固有膜轻度水肿和炎症细胞浸润。电镜观察，对照组未见 异常；ANP组：肠粘膜上皮微绒毛稀疏，脱落，基质外溢，线粒体空泡样变，内质网肿胀， 上皮细胞桥粒连接断裂；Gln组：肠粘膜上皮微绒毛排列紊乱，线粒体及内质网轻度肿胀。
, http://www.100md.com
3 讨论
本实验结果发现，大鼠诱发ANP后72小时，肠粘膜DNA含量明显下降，组织学检查示肠粘膜出 现明显的病理损害，肠系膜淋巴结，胰腺组织细菌定量培养较对照组明显升高，吖啶橙标记 大肠杆菌示踪直接显示大肠杆菌移位致肠系膜淋巴结，胰腺组织明显增加，这表明ANP大鼠 存在显著的肠粘膜屏障功能损害，肠细菌发生移位，这与Runkel等[4]的结论基本 一致，进一步证实了ANP时肠细菌移位。
肠道是消耗Gln的主要器官，其主要功能是为肠道上皮细胞提供能源，为上皮细胞合成蛋白 质、DNA提供原料，因此，Gln在肠上皮细胞正常代谢中起非常重要的作用[3]。Hu ghers[5]证实，应用标准TPN(即不含Gln)对大鼠静脉营养8天后发现，空肠粘膜明 显萎缩，但当在TPN液中加入Gln后，则可减轻它的萎缩程度。本实验研究发现，给予ANP大 鼠Gln能增加肠粘膜DNA含量，减轻肠粘膜病理损害，保护肠粘膜屏障功能，减少肠道细菌移 位。实验说明，补充Gln使肠粘膜有足够的氧化底物，产生大量的ATP，维持细胞的代谢及细 胞间 连接，促进肠粘膜细胞的分裂增殖、代谢等，加快上皮细胞的增生修复，有利于保护肠粘膜 屏障功能，减少肠道细菌的移位，为临床应用Gln防止ANP肠道细菌移位提供了依据。
, 百拇医药
[基金项目] 广东省医学科研基金 课题(B1997155)
[1]Beger HG,Bittner R,Blocks,et al.Bacterial contamiation of pancreati c necrosis[J].Gastroenterology,1986,91:433.
[2]Kazantsev GB，Hecht DW,Rao R,et al.Bacterial translocation in pancre atitis[J].Am J Surg,1994,207:201.
[3]白满喜，蒋朱明.谷氨酰胺对胃肠外营养时细菌移位的影响[J].普外临床 ，1996，11(4)：209.
[4]Runkel NE,Moody F,Smith GS,et al.The role of the gut in the developm ent of sepsis in acute pancreatitis[J]. J Surg Res ,1991,51:18.
[5]Hughes CA,Dowling RH.Speed of onset of adaptive mucosal hypoplosia and hypofunction in the intestine of parenterally fed rats[J].Clinical Science ,1980,59:317.
[收稿：1999-11-15], 百拇医药