1999年福建省暴发不明热病毒病原的分离与鉴定
于曼 秦鄂德 王鹏程 耿丽卿 黄祥瑞 杨佩英
摘 要 目的：对1999年8月福建省福州市暴发的不明热的病毒病原进行分离与鉴定。方法：首先采用传代蚊细胞的微量培养方法进行病毒分离，并通过脑内接种途径观察对乳小鼠的致病性。然后经间接免疫荧光法和RT-PCR技术对毒株进行型别鉴定。 结果：患者恢复期血清标本中存在登革2型病毒特异抗体。从急性期血清标本中分离出11株病毒，在传代蚊细胞中可产生稳定的细胞病变并对乳小鼠致病。其基因组为登革2型病毒特异的RNA分子。结论：福建省福州市流行的不明热疾病是由登革2型病毒感染所致。
关键词：登革病毒福建株；病毒分离，鉴定；不明热疾病
1999年8月，在福建省福州市的城乡交界处暴发了以发热为主的传染性疾病，仅在短期内发病人数急增至1 000多人。患者在发高热的同时伴有头痛、全身关节和肌肉疼痛，出现皮疹等症状。少数患者伴有出血并发症。发热期长达10多天，但无呕吐等脑炎症状。血常规检查，除淋巴细胞略高于正常值外，其他指标均正常或偏低，故排除了细菌感染的可能性。福建省卫生防疫站对这次流行疾病非常重视，并请我们协助查明病因。为此，本实验室首先采用间接免疫荧光法对送检的患者恢复期血清标本进行了病毒特异抗体检测，并对急性期血清标本进行了病毒分离，还观察了对乳小鼠的致病性，最后对所分离病毒的基因组特异性进行了鉴定。现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 患者血清标本
急性期患者血清标本11份,于发病2～8 d内采集；恢复期血清标本27份，于发病2周后采集。均由福建省卫生防疫站提供。
1.2 病毒株与抗体
登革1～4型病毒参考株，由本室保存。登革2型病毒多克隆抗体及羊抗人IgG荧光抗体均由本室制备。羊抗鼠IgG荧光抗体由本所十室提供。
1.3 细胞和实验动物
白纹伊蚊传代细胞(C6/36)和BHK-21细胞由我所细胞库提供。细胞培养基为RPMI-1640，含10%小牛血清和1%青、链霉素。乳小鼠为昆明纯种，1～2日龄，每窝8～10只，由本院实验动物中心提供。
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1.4 登革病毒1～4型参考株抗原片的制备
将登革1～4型病毒参考毒株分别接种BHK-21细胞，置37℃培养，4 d后将感染细胞制成55×104/ml的细胞悬液，并分别将其滴加在玻片上，30 μl/孔。同样温度培养5～6 h后，将玻片用冷丙酮固定30 min。室温晾干后，把玻片密封，置-20℃保存备用。
1.5 病毒分离和乳小鼠脑内接种
采用微量细胞培养方法[1]，将C6/36细胞按照常规于96孔板中传代。经28℃的CO2温箱培养24 h，然后将患者急性期血清加到C6/36细胞单层上。于37℃吸附后，加入维持液。再置CO2温箱培养，逐日于显微镜下观察细胞病变(CPE)情况。将接种患者血清标本出现CPE的细胞培养液，通过脑内途径接种乳小鼠，观察乳小鼠发病情况。
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1.6 间接免疫荧光法
将患者血清标本按30 μl/孔分别滴加到登革1～4型病毒感染细胞的抗原片上，于37℃放置30 min后，用水冲洗10 min。晾干后再滴加羊抗人IgG荧光抗体，同样放置30 min，分别用水和PBS冲洗10 min。然后于荧光显微镜下观察。
1.7 RT-PCR扩增
用从接种患者血清标本的C6/36细胞培养液感染的乳小鼠脑中制备RNA，采用登革2型病毒NS1基因的特异引物，分别进行RT-PCR扩增，详见文献[2]。
2 结果
2.1 血清标本中病毒特异抗体的检测
福建省送检的38份患者血清标本，包括11份急性期血清和27份恢复期血清。首先采用间接免疫荧光法，利用登革2型病毒参考株感染的BHK-21细胞作为抗原，检测27份恢复期血清中的IgG抗体。从图1可以看出，特异荧光主要分布在细胞胞浆中，与登革病毒在细胞中的复制部位是一致的。在所检测的27份标本中，24份为登革2型病毒抗体阳性，3份为阴性。而用登革1、3和4型病毒抗原片检测这些标本均为抗体阴性。表明患者曾被登革2型病毒感染。
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图1 登革病毒特异抗体的间接免疫荧光检测
登革2型病毒参考株感染的BHK-21 细胞与患者恢复期血清反应
2.2 急性期血清标本的病毒分离
把急性期血清标本适当稀释后，分别接种到对登革病毒敏感的C6/36细胞单层上，于不同时间观察细胞病变情况。在接种后的第2天，有5份标本出现细胞聚集、细胞间质疏松。第4天，其中3份标本出现登革病毒特有的CPE，细胞破碎、融合(图2B)。第6天，11份标本全部出现登革病毒典型的CPE(图2C)。从图2 D可以看出，在第7天病变细胞形成大小不等的空泡和网状结构。为了进一步观察产生细胞病变的稳定性，将第7天收取的11份病毒标本感染的细胞培养上清液，继续进行细胞传代。在接种后24 h，其中6份标本即出现CPE。第3天全部标本出现典型的登革病毒的CPE。表明所分离病毒产生的细胞病变是稳定的。
, 百拇医药 2.3 分离病毒株对乳小鼠致病性的观察
为了进一步观察分离病毒株对动物的致病性，将病毒感染C6/36细胞的培养液通过脑内途径接种乳小鼠。于接种后的第7～8天，少数乳小鼠开始出现毛松、不吃奶、嗜睡等症状。第9天症状加重，出现四肢抽搐，角弓反张，后肢麻痹等登革病毒感染后典型发病症状，且有个别乳小鼠开始死亡。在接种11份标本的乳小鼠中，除其中2份标本外，其余9份均产生典型症状，表明所分离的病毒对乳小鼠是致病的。
图2 分离的登革病毒在C6/36细胞中引起的细胞病变
A.正常C6/36细胞；B,C,D.分离的登革2型病毒株感染的C6/36 细胞于第4，6，7天引起的细胞病变
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2.4 病毒基因组特异性鉴定
登革病毒为单股正链RNA病毒，为从病毒基因组RNA水平进一步证明所分离病毒的特异性，首先采用逆转录方法将从病毒感染的乳小鼠脑中制备的RNA合成为cDNA，然后通过登革2型病毒非结构基因(NS1)特异引物进行PCR扩增。图3显示其中4份标本的扩增结果。可以看出扩增片段的大小均为420 bp，与预期的分子量是一致的。证明分离病毒的基因组为RNA，而且是登革2型病毒特异的。
图3 登革病毒分离株基因组的RT-PCR鉴定
M.λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ；
1.阳性对照：登革2型病毒参考株NS1基因片段；
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2～5.4株分离的登革2型病毒RT-PCR扩增的NS1基因片段
3 讨论
本研究采用微量细胞培养方法，从福建省福州市暴发的以发热为主的传染病的患者急性期血清标本中分离出11株登革2型病毒。将这些毒株分别于C6/36细胞单层上连续传代，观察其对细胞致病变作用。初次接种(第1代)后典型细胞病变出现的时间为第6天，传至第2代，细胞病变的时间提前至第3天。这种CPE产生时间的缩短可能与病毒毒力有关。将分离的11株病毒连传3代以上，仍可产生登革病毒典型的CPE，表明分离病毒株的细胞病变是稳定的。从对乳小鼠致病性的观察结果发现，有7个毒株致病性最强，乳小鼠发病率达100%。2株较弱，仅引起30%的乳小鼠发病。另外2株对乳小鼠不致病，盲传2代后仍无致病性。这些毒株之间存在的明显差异表明，所分离的登革病毒株对传代细胞的致病变作用与对乳小鼠致病性之间并不存在相关性。这提示福建省流行的登革热可能是由该地区存在的登革2型病毒不同基因型所致，也可能是由从东南亚其他登革热流行区输入的不同基因型毒株所致，这仍有待进一步研究。
, 百拇医药
福建省历史上曾发生过多次登革热的大流行，但自1944年福州发生流行以来的50多年均未再流行过。1999年8月的这次流行是解放后的第一次。由于登革热是由蚊媒传播，具有起病急、传播快、发病率高、极易造成暴发流行的特点。加之，全球气候变暖，蚊虫媒介分布范围扩大及交通旅游频繁，使得登革热的流行有扩大之势[3]。东南沿海各省区均为我国重要的经济开发区，对外交往极为广泛。因此，登革热的流行应引起我们的高度重视。这次从福建省分离的登革病毒株以及自1978年以来从海南、广东、广西等流行区分离的不同型别的毒株，对我国登革热的传播来源、流行特点及登革热疫苗的研究，具有重要的意义。
感谢福建省卫生防疫站提供患者血清标本。
[作者简介] 于曼(1953-)，女，山西湘垣人，高级实验师。
于曼(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
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秦鄂德(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
王鹏程(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
耿丽卿(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
黄祥瑞(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
杨佩英(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
参考文献
[1] 杨佩英，秦鄂德.登革热和登革出血热——基础理论与实验技术[M].北京：人民军医出版社,1999.152～160.
[2] 于 曼，秦鄂德，徐品芳，等.我国登革2型病毒株NS1基因的克隆与表达[J].军事医学科学院院刊，1999，23(3)：161.
[3] Monath TP.Dengue：the risk of developed and developing countries[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:2395., http://www.100md.com
摘 要 目的：对1999年8月福建省福州市暴发的不明热的病毒病原进行分离与鉴定。方法：首先采用传代蚊细胞的微量培养方法进行病毒分离，并通过脑内接种途径观察对乳小鼠的致病性。然后经间接免疫荧光法和RT-PCR技术对毒株进行型别鉴定。 结果：患者恢复期血清标本中存在登革2型病毒特异抗体。从急性期血清标本中分离出11株病毒，在传代蚊细胞中可产生稳定的细胞病变并对乳小鼠致病。其基因组为登革2型病毒特异的RNA分子。结论：福建省福州市流行的不明热疾病是由登革2型病毒感染所致。
关键词：登革病毒福建株；病毒分离，鉴定；不明热疾病
1999年8月，在福建省福州市的城乡交界处暴发了以发热为主的传染性疾病，仅在短期内发病人数急增至1 000多人。患者在发高热的同时伴有头痛、全身关节和肌肉疼痛，出现皮疹等症状。少数患者伴有出血并发症。发热期长达10多天，但无呕吐等脑炎症状。血常规检查，除淋巴细胞略高于正常值外，其他指标均正常或偏低，故排除了细菌感染的可能性。福建省卫生防疫站对这次流行疾病非常重视，并请我们协助查明病因。为此，本实验室首先采用间接免疫荧光法对送检的患者恢复期血清标本进行了病毒特异抗体检测，并对急性期血清标本进行了病毒分离，还观察了对乳小鼠的致病性，最后对所分离病毒的基因组特异性进行了鉴定。现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 患者血清标本
急性期患者血清标本11份,于发病2～8 d内采集；恢复期血清标本27份，于发病2周后采集。均由福建省卫生防疫站提供。
1.2 病毒株与抗体
登革1～4型病毒参考株，由本室保存。登革2型病毒多克隆抗体及羊抗人IgG荧光抗体均由本室制备。羊抗鼠IgG荧光抗体由本所十室提供。
1.3 细胞和实验动物
白纹伊蚊传代细胞(C6/36)和BHK-21细胞由我所细胞库提供。细胞培养基为RPMI-1640，含10%小牛血清和1%青、链霉素。乳小鼠为昆明纯种，1～2日龄，每窝8～10只，由本院实验动物中心提供。
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1.4 登革病毒1～4型参考株抗原片的制备
将登革1～4型病毒参考毒株分别接种BHK-21细胞，置37℃培养，4 d后将感染细胞制成55×104/ml的细胞悬液，并分别将其滴加在玻片上，30 μl/孔。同样温度培养5～6 h后，将玻片用冷丙酮固定30 min。室温晾干后，把玻片密封，置-20℃保存备用。
1.5 病毒分离和乳小鼠脑内接种
采用微量细胞培养方法[1]，将C6/36细胞按照常规于96孔板中传代。经28℃的CO2温箱培养24 h，然后将患者急性期血清加到C6/36细胞单层上。于37℃吸附后，加入维持液。再置CO2温箱培养，逐日于显微镜下观察细胞病变(CPE)情况。将接种患者血清标本出现CPE的细胞培养液，通过脑内途径接种乳小鼠，观察乳小鼠发病情况。
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1.6 间接免疫荧光法
将患者血清标本按30 μl/孔分别滴加到登革1～4型病毒感染细胞的抗原片上，于37℃放置30 min后，用水冲洗10 min。晾干后再滴加羊抗人IgG荧光抗体，同样放置30 min，分别用水和PBS冲洗10 min。然后于荧光显微镜下观察。
1.7 RT-PCR扩增
用从接种患者血清标本的C6/36细胞培养液感染的乳小鼠脑中制备RNA，采用登革2型病毒NS1基因的特异引物，分别进行RT-PCR扩增，详见文献[2]。
2 结果
2.1 血清标本中病毒特异抗体的检测
福建省送检的38份患者血清标本，包括11份急性期血清和27份恢复期血清。首先采用间接免疫荧光法，利用登革2型病毒参考株感染的BHK-21细胞作为抗原，检测27份恢复期血清中的IgG抗体。从图1可以看出，特异荧光主要分布在细胞胞浆中，与登革病毒在细胞中的复制部位是一致的。在所检测的27份标本中，24份为登革2型病毒抗体阳性，3份为阴性。而用登革1、3和4型病毒抗原片检测这些标本均为抗体阴性。表明患者曾被登革2型病毒感染。
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图1 登革病毒特异抗体的间接免疫荧光检测
登革2型病毒参考株感染的BHK-21 细胞与患者恢复期血清反应
2.2 急性期血清标本的病毒分离
把急性期血清标本适当稀释后，分别接种到对登革病毒敏感的C6/36细胞单层上，于不同时间观察细胞病变情况。在接种后的第2天，有5份标本出现细胞聚集、细胞间质疏松。第4天，其中3份标本出现登革病毒特有的CPE，细胞破碎、融合(图2B)。第6天，11份标本全部出现登革病毒典型的CPE(图2C)。从图2 D可以看出，在第7天病变细胞形成大小不等的空泡和网状结构。为了进一步观察产生细胞病变的稳定性，将第7天收取的11份病毒标本感染的细胞培养上清液，继续进行细胞传代。在接种后24 h，其中6份标本即出现CPE。第3天全部标本出现典型的登革病毒的CPE。表明所分离病毒产生的细胞病变是稳定的。
, 百拇医药 2.3 分离病毒株对乳小鼠致病性的观察
为了进一步观察分离病毒株对动物的致病性，将病毒感染C6/36细胞的培养液通过脑内途径接种乳小鼠。于接种后的第7～8天，少数乳小鼠开始出现毛松、不吃奶、嗜睡等症状。第9天症状加重，出现四肢抽搐，角弓反张，后肢麻痹等登革病毒感染后典型发病症状，且有个别乳小鼠开始死亡。在接种11份标本的乳小鼠中，除其中2份标本外，其余9份均产生典型症状，表明所分离的病毒对乳小鼠是致病的。
图2 分离的登革病毒在C6/36细胞中引起的细胞病变
A.正常C6/36细胞；B,C,D.分离的登革2型病毒株感染的C6/36 细胞于第4，6，7天引起的细胞病变
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2.4 病毒基因组特异性鉴定
登革病毒为单股正链RNA病毒，为从病毒基因组RNA水平进一步证明所分离病毒的特异性，首先采用逆转录方法将从病毒感染的乳小鼠脑中制备的RNA合成为cDNA，然后通过登革2型病毒非结构基因(NS1)特异引物进行PCR扩增。图3显示其中4份标本的扩增结果。可以看出扩增片段的大小均为420 bp，与预期的分子量是一致的。证明分离病毒的基因组为RNA，而且是登革2型病毒特异的。
图3 登革病毒分离株基因组的RT-PCR鉴定
M.λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ；
1.阳性对照：登革2型病毒参考株NS1基因片段；
, 百拇医药
2～5.4株分离的登革2型病毒RT-PCR扩增的NS1基因片段
3 讨论
本研究采用微量细胞培养方法，从福建省福州市暴发的以发热为主的传染病的患者急性期血清标本中分离出11株登革2型病毒。将这些毒株分别于C6/36细胞单层上连续传代，观察其对细胞致病变作用。初次接种(第1代)后典型细胞病变出现的时间为第6天，传至第2代，细胞病变的时间提前至第3天。这种CPE产生时间的缩短可能与病毒毒力有关。将分离的11株病毒连传3代以上，仍可产生登革病毒典型的CPE，表明分离病毒株的细胞病变是稳定的。从对乳小鼠致病性的观察结果发现，有7个毒株致病性最强，乳小鼠发病率达100%。2株较弱，仅引起30%的乳小鼠发病。另外2株对乳小鼠不致病，盲传2代后仍无致病性。这些毒株之间存在的明显差异表明，所分离的登革病毒株对传代细胞的致病变作用与对乳小鼠致病性之间并不存在相关性。这提示福建省流行的登革热可能是由该地区存在的登革2型病毒不同基因型所致，也可能是由从东南亚其他登革热流行区输入的不同基因型毒株所致，这仍有待进一步研究。
, 百拇医药
福建省历史上曾发生过多次登革热的大流行，但自1944年福州发生流行以来的50多年均未再流行过。1999年8月的这次流行是解放后的第一次。由于登革热是由蚊媒传播，具有起病急、传播快、发病率高、极易造成暴发流行的特点。加之，全球气候变暖，蚊虫媒介分布范围扩大及交通旅游频繁，使得登革热的流行有扩大之势[3]。东南沿海各省区均为我国重要的经济开发区，对外交往极为广泛。因此，登革热的流行应引起我们的高度重视。这次从福建省分离的登革病毒株以及自1978年以来从海南、广东、广西等流行区分离的不同型别的毒株，对我国登革热的传播来源、流行特点及登革热疫苗的研究，具有重要的意义。
感谢福建省卫生防疫站提供患者血清标本。
[作者简介] 于曼(1953-)，女，山西湘垣人，高级实验师。
于曼(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
, 百拇医药
秦鄂德(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
王鹏程(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
耿丽卿(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
黄祥瑞(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
杨佩英(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100850)
参考文献
[1] 杨佩英，秦鄂德.登革热和登革出血热——基础理论与实验技术[M].北京：人民军医出版社,1999.152～160.
[2] 于 曼，秦鄂德，徐品芳，等.我国登革2型病毒株NS1基因的克隆与表达[J].军事医学科学院院刊，1999，23(3)：161.
[3] Monath TP.Dengue：the risk of developed and developing countries[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:2395., http://www.100md.com