卵巢浆液性肿瘤血管生成与ras p21表达及临床预后
作者：廖予妹 耿正惠 王嘉莉 魏丽惠
单位：廖予妹 耿正惠 王嘉莉(河南医科大学附属第二医院 郑州450003)；魏丽惠(北京医科大学人民医院)
关键词：卵巢肿瘤；微血管生成ras基因；免疫组织化学；预后
中国综合临床001246 【摘要】 目的 探讨血管生成卵巢浆液性肿瘤 ras p21表达及预后的关系。方法 应用免疫组化LSAB法，以CD34单克隆抗体标记血管内皮细胞对10例卵巢浆液性囊腺瘤(囊腺瘤)及50例卵巢浆液性囊腺癌组织微血管密度(MVD，微血管数/200×)进行了观察。同时，检测肿瘤组织中ras基因产物p21蛋白的表达情况，并结合临床资料进行分析。结果 卵巢癌的MVD显著高于囊腺瘤(P<0.05)，ras p21过度表达组卵巢癌 MVD显著高于ras p21非过度表达及阴性表达组(P均<0.01)。病理分级Ⅱ级及Ⅲ级癌的MVD均显著高于病理分级Ⅰ级癌(均P<0.01)。Kaplan-Meier分析MVD高密度组的生存率明显低于低密度组(P<0.01)。结论 卵巢浆液性肿瘤的血管生成与肿瘤细胞本身的生物学特性有关，肿瘤血管生成分析可以作为临床判断卵巢浆液性癌预后的指标之一。
, 百拇医药
Study of angiogensis of ovarian serous neoplasms and ras p21 expression as well as their clinical prognosis
Liao Yumei Wei Lihui Geng Zhenghui
The Second Affiliated Hospital of Henan Medical University,Zhengzhou 450003
【Abstract】 Objective To study the relationship between tumor angiogenesis and expression of ras p21 protein as well as the prognosis in serous ovarian neoplasms.Methods Microvessel density (MCD) and expression of ras p21 protein in issues of 10 adenomas and 50 serous ovarian cancers were observed by immunohistochemical staining methods with monoclonal antibody CD34 to mark vascular endotheliocytes.Results Microvessel density in specimens from over-expression of ras p21 protein and from grade Ⅱ and Ⅲ was significantly higher than that in specimens from low-expression or negative expression of ras p21 protein as well as from grade I (P<0.01).Microvessel density was associated with overall survival by Kaplan-Meier analysis.Conclusion Neocascularization of serous ovarian neoplasms is associated with differentiation of neoplasms,a significant relationship between microvesssel density and prognosis.Moreover,the analysis of neovascularization may be an useful prognostic factor in serous ovarian cancer.
, 百拇医药
【Key Words】 Ovarian neoplasms Angiogensis ras gene Immunohistochemistry Prognosis
本文重点研究卵巢肿瘤的最常见类——卵巢浆液性肿瘤微血管生成与ras基因产物表达的关系，及其对患者术后生存期的影响。
1 材料与方法
1.1 一般资料 1987～1996年手术切除的卵巢浆液性肿瘤标本共60例，其中囊腺瘤10例，囊腺癌50例。50例卵巢癌按1998年FIGO分期标准，Ⅰ、Ⅱ期23例，Ⅲ、Ⅳ期27例。全部病例术前均未行化疗与放射治疗，术后随访0.5～6年
1.2 免疫组化染色 鼠抗人CD34单克隆抗体(英国NOVO产品)标记血管内皮细胞，抗体稀释度为1∶30，鼠抗人p21蛋白单克隆抗体(DAKO公司产品)检测ras基因产物，抗体浓度为1∶70，采用LSAB法(试剂盒为丹麦DAKO公司产品)免疫组化染色，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，同时用实验室已知的p21阳性切片作为阳性对照。
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1.3 结果判定标准
1.3.1 肿瘤组织微血管密度(microvessel density,MVD)计数[1] 选取具有代表性的组织切片，排除肿瘤出血及坏死区，凡癌巢中及癌巢周围被CD34染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇团，作为一个微血管计数，先在100 x视野下观察确定每例切片中2个微血管染色最丰富的肿瘤区域，然后在200 x视野下(0.74 mm2)进行计数，每例标本共计数4个视野，取其平均数，200 x视野下的平均微血管数即为该例肿瘤的MVD值(微血管数/200 x)。
1.3.2 ras基因产物p21蛋白的表达 切片中细胞出现棕黄色或棕褐色颗粒物质为阳性反应。(-)为切片中无着色细胞，(±)为胞浆或胞膜着浅黄色，无颗粒物质出现。(+)为阳性细胞占75%以下，(
)为阳性细胞占75%以上，将(+)～()视为癌基因ras p21阳性表达，(±)及(-)为ras p21阴性表达。
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1.4 统计学处理 统计分析采用t (t')检验，Kaplan-Meier法计算生存率，不同组别的生存率比较采用log-rank检验。
2 结果
2.1 卵巢良恶性肿瘤中ras p21表达及MVD的比较 卵巢癌的MVD值为37.92±15.13，显著高于卵巢良性肿瘤14.70±9.45(t=4.657，P<0.01)。10例卵巢良性肿瘤中ras p21 阳性表达3例，表达强度()者仅1例；而在卵巢癌中，其表达强度()者20例，占40%。因此，在卵巢癌病例中将 ras p21表达强度()视为过度表达，ras p21表达强度(+)视为非过度表达。
, 百拇医药
2.2 卵巢癌MVD与ras p21表达水平的关系 结果见表1。由表1可知，癌基因ras p21过度表达组的MVD显著高于ras p21阴性表达组及非过度表达组(t＇=2.6599,2.3809,P<0.01)，而癌基因ras p21非过度表达与阴性表达组之间的MVD无显著差异(t＇=1.2433,P>0.05)。 表1 卵巢癌MVD与ras p21表达水平的关系(
±s)
rasp21
例数
MVD(微血管数/200x，阴性表达组
12
30.00±12.50**
, http://www.100md.com 非过度表达组
18
35.28±10.61**△
过度表达组
20
45.80±16.37
注：与过度表达组比较，**P<0.01；与阴性表达相比，△ P>0.05。2.3 卵巢癌MVD与病理分级的关系 结果见表2。
表2 卵巢癌MVD与病理分级的关第(±s) 病理分级
例数
, http://www.100md.com
MVD(微血管数/200 x，)
G1
12
27.67±9.71
G2
21
43.48±16.67*△
G3
17
38.29±13.00*
注：与G1级比较，*P<0.05；G2与G3级比较△P>0.05。2.4 血管生成与患者预后的关系 50例卵巢癌微血管计数范围为15～76(微血管数/200 x)，其中位数为36，以此为界，将卵巢癌分为两组，MVD≥36者列为高密度组，即卵巢癌高危患者组，该组患者术后10、30、60个月的生存率分别为73.91%、24.13%、11.49%；MVD<36者列入低危患者组，该组患者术后10、30、60个月的生存率分别为87.23%、71.68%、49.62%；两组卵巢癌患者的生存期经Log-rank检验(P<0.01)，表明微血管密度高的卵巢癌患者生存期缩短。
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3 讨论
卵巢癌是妇科肿瘤中对患者健康威胁最大的疾病。近年来人们注意到，血管的生成作为肿瘤生态系统中的一个重要因素，参与和影响着肿瘤的生物学行为，同时其又受到肿瘤细胞和宿主的共同调控 [2，3] 。肿瘤血管生成是指在特定的区域里生成了与肿瘤生长有关的新的毛细血管。业已证明，肿瘤能诱导肿瘤血管的形成过程受许多因子(TAF)的影响，恶性度高的肿瘤分泌TAF量一般较高[3]。本研究显示恶性卵巢肿瘤的微血管密度(微血管数/200 x)显著高于良性肿瘤，ras癌基因过度表达组卵巢癌的微血管密度显著高于非过度表达及阴性表达组，病理分级Ⅰ级卵巢癌微血管密度明显低于病理学Ⅱ级或Ⅲ级癌，提示卵巢浆液性肿瘤内微血管生成与肿瘤细胞本身的生物学特性有关。体外研究表明，突变的ras基因可上调血管内皮生长因子(vEGF)的表达[4]。肿瘤细胞在原发肿瘤形成前极少发生转移[3]，表明转移过程与肿瘤血管形成有关，肿瘤内血管生成增多，可增加瘤细胞向远处转移的机会，一方面由于新生毛细血管基底膜的不完整性，使肿瘤细胞更易通过；另一方面新生血管形成过程中，内皮细胞要产生多种降解酶，促进肿瘤细胞脱落及转移。研究表明，肿瘤血管生成与实体肿瘤的生长、转移及预后有关。研究发现，微血管密度高的卵巢癌患者术后生存期显著缩短，提示进行血管生成分析可能是判断卵巢浆液性癌患者预后的一项有用指标。对癌组织微血管密度增高的病例，术后在化疗的同时，利用血管生成抑制剂，如内皮抑制素等配合治疗，有助于改善卵巢癌患者的预后。
, 百拇医药
参考文献
1，Hollingsworth HC,Kohn EC,Steinberg SM,et al.Tumor
angiogenesis in advanced stage ovarian carcinoma.Am J Pathol,1995,147(1):33
2，Folkman J.The role of angiogenesis in tumor growth.Semin
Cancer Biol,1992,3(1):65
3，Folkman J,Wastonk,Ingber D,et al.Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia.Nature,1989,339(1):58
4，李晓明，综述.血管内皮生长因子及其受体与肿瘤血管形成.国外医学肿瘤学分册，1997，24(1)：11
2000-03-01
2000-08-19, http://www.100md.com
单位：廖予妹 耿正惠 王嘉莉(河南医科大学附属第二医院 郑州450003)；魏丽惠(北京医科大学人民医院)
关键词：卵巢肿瘤；微血管生成ras基因；免疫组织化学；预后
中国综合临床001246 【摘要】 目的 探讨血管生成卵巢浆液性肿瘤 ras p21表达及预后的关系。方法 应用免疫组化LSAB法，以CD34单克隆抗体标记血管内皮细胞对10例卵巢浆液性囊腺瘤(囊腺瘤)及50例卵巢浆液性囊腺癌组织微血管密度(MVD，微血管数/200×)进行了观察。同时，检测肿瘤组织中ras基因产物p21蛋白的表达情况，并结合临床资料进行分析。结果 卵巢癌的MVD显著高于囊腺瘤(P<0.05)，ras p21过度表达组卵巢癌 MVD显著高于ras p21非过度表达及阴性表达组(P均<0.01)。病理分级Ⅱ级及Ⅲ级癌的MVD均显著高于病理分级Ⅰ级癌(均P<0.01)。Kaplan-Meier分析MVD高密度组的生存率明显低于低密度组(P<0.01)。结论 卵巢浆液性肿瘤的血管生成与肿瘤细胞本身的生物学特性有关，肿瘤血管生成分析可以作为临床判断卵巢浆液性癌预后的指标之一。
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Study of angiogensis of ovarian serous neoplasms and ras p21 expression as well as their clinical prognosis
Liao Yumei Wei Lihui Geng Zhenghui
The Second Affiliated Hospital of Henan Medical University,Zhengzhou 450003
【Abstract】 Objective To study the relationship between tumor angiogenesis and expression of ras p21 protein as well as the prognosis in serous ovarian neoplasms.Methods Microvessel density (MCD) and expression of ras p21 protein in issues of 10 adenomas and 50 serous ovarian cancers were observed by immunohistochemical staining methods with monoclonal antibody CD34 to mark vascular endotheliocytes.Results Microvessel density in specimens from over-expression of ras p21 protein and from grade Ⅱ and Ⅲ was significantly higher than that in specimens from low-expression or negative expression of ras p21 protein as well as from grade I (P<0.01).Microvessel density was associated with overall survival by Kaplan-Meier analysis.Conclusion Neocascularization of serous ovarian neoplasms is associated with differentiation of neoplasms,a significant relationship between microvesssel density and prognosis.Moreover,the analysis of neovascularization may be an useful prognostic factor in serous ovarian cancer.
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【Key Words】 Ovarian neoplasms Angiogensis ras gene Immunohistochemistry Prognosis
本文重点研究卵巢肿瘤的最常见类——卵巢浆液性肿瘤微血管生成与ras基因产物表达的关系，及其对患者术后生存期的影响。
1 材料与方法
1.1 一般资料 1987～1996年手术切除的卵巢浆液性肿瘤标本共60例，其中囊腺瘤10例，囊腺癌50例。50例卵巢癌按1998年FIGO分期标准，Ⅰ、Ⅱ期23例，Ⅲ、Ⅳ期27例。全部病例术前均未行化疗与放射治疗，术后随访0.5～6年
1.2 免疫组化染色 鼠抗人CD34单克隆抗体(英国NOVO产品)标记血管内皮细胞，抗体稀释度为1∶30，鼠抗人p21蛋白单克隆抗体(DAKO公司产品)检测ras基因产物，抗体浓度为1∶70，采用LSAB法(试剂盒为丹麦DAKO公司产品)免疫组化染色，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，同时用实验室已知的p21阳性切片作为阳性对照。
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1.3 结果判定标准
1.3.1 肿瘤组织微血管密度(microvessel density,MVD)计数[1] 选取具有代表性的组织切片，排除肿瘤出血及坏死区，凡癌巢中及癌巢周围被CD34染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇团，作为一个微血管计数，先在100 x视野下观察确定每例切片中2个微血管染色最丰富的肿瘤区域，然后在200 x视野下(0.74 mm2)进行计数，每例标本共计数4个视野，取其平均数，200 x视野下的平均微血管数即为该例肿瘤的MVD值(微血管数/200 x)。
1.3.2 ras基因产物p21蛋白的表达 切片中细胞出现棕黄色或棕褐色颗粒物质为阳性反应。(-)为切片中无着色细胞，(±)为胞浆或胞膜着浅黄色，无颗粒物质出现。(+)为阳性细胞占75%以下，(
)为阳性细胞占75%以上，将(+)～()视为癌基因ras p21阳性表达，(±)及(-)为ras p21阴性表达。, http://www.100md.com
1.4 统计学处理 统计分析采用t (t')检验，Kaplan-Meier法计算生存率，不同组别的生存率比较采用log-rank检验。
2 结果
2.1 卵巢良恶性肿瘤中ras p21表达及MVD的比较 卵巢癌的MVD值为37.92±15.13，显著高于卵巢良性肿瘤14.70±9.45(t=4.657，P<0.01)。10例卵巢良性肿瘤中ras p21 阳性表达3例，表达强度(
)者仅1例；而在卵巢癌中，其表达强度()者20例，占40%。因此，在卵巢癌病例中将 ras p21表达强度()视为过度表达，ras p21表达强度(+)视为非过度表达。, 百拇医药
2.2 卵巢癌MVD与ras p21表达水平的关系 结果见表1。由表1可知，癌基因ras p21过度表达组的MVD显著高于ras p21阴性表达组及非过度表达组(t＇=2.6599,2.3809,P<0.01)，而癌基因ras p21非过度表达与阴性表达组之间的MVD无显著差异(t＇=1.2433,P>0.05)。 表1 卵巢癌MVD与ras p21表达水平的关系(
±s)rasp21
例数
MVD(微血管数/200x，阴性表达组
12
30.00±12.50**
, http://www.100md.com 非过度表达组
18
35.28±10.61**△
过度表达组
20
45.80±16.37
注：与过度表达组比较，**P<0.01；与阴性表达相比，△ P>0.05。2.3 卵巢癌MVD与病理分级的关系 结果见表2。
表2 卵巢癌MVD与病理分级的关第(
±s) 病理分级例数
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MVD(微血管数/200 x，)
G1
12
27.67±9.71
G2
21
43.48±16.67*△
G3
17
38.29±13.00*
注：与G1级比较，*P<0.05；G2与G3级比较△P>0.05。2.4 血管生成与患者预后的关系 50例卵巢癌微血管计数范围为15～76(微血管数/200 x)，其中位数为36，以此为界，将卵巢癌分为两组，MVD≥36者列为高密度组，即卵巢癌高危患者组，该组患者术后10、30、60个月的生存率分别为73.91%、24.13%、11.49%；MVD<36者列入低危患者组，该组患者术后10、30、60个月的生存率分别为87.23%、71.68%、49.62%；两组卵巢癌患者的生存期经Log-rank检验(P<0.01)，表明微血管密度高的卵巢癌患者生存期缩短。
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3 讨论
卵巢癌是妇科肿瘤中对患者健康威胁最大的疾病。近年来人们注意到，血管的生成作为肿瘤生态系统中的一个重要因素，参与和影响着肿瘤的生物学行为，同时其又受到肿瘤细胞和宿主的共同调控 [2，3] 。肿瘤血管生成是指在特定的区域里生成了与肿瘤生长有关的新的毛细血管。业已证明，肿瘤能诱导肿瘤血管的形成过程受许多因子(TAF)的影响，恶性度高的肿瘤分泌TAF量一般较高[3]。本研究显示恶性卵巢肿瘤的微血管密度(微血管数/200 x)显著高于良性肿瘤，ras癌基因过度表达组卵巢癌的微血管密度显著高于非过度表达及阴性表达组，病理分级Ⅰ级卵巢癌微血管密度明显低于病理学Ⅱ级或Ⅲ级癌，提示卵巢浆液性肿瘤内微血管生成与肿瘤细胞本身的生物学特性有关。体外研究表明，突变的ras基因可上调血管内皮生长因子(vEGF)的表达[4]。肿瘤细胞在原发肿瘤形成前极少发生转移[3]，表明转移过程与肿瘤血管形成有关，肿瘤内血管生成增多，可增加瘤细胞向远处转移的机会，一方面由于新生毛细血管基底膜的不完整性，使肿瘤细胞更易通过；另一方面新生血管形成过程中，内皮细胞要产生多种降解酶，促进肿瘤细胞脱落及转移。研究表明，肿瘤血管生成与实体肿瘤的生长、转移及预后有关。研究发现，微血管密度高的卵巢癌患者术后生存期显著缩短，提示进行血管生成分析可能是判断卵巢浆液性癌患者预后的一项有用指标。对癌组织微血管密度增高的病例，术后在化疗的同时，利用血管生成抑制剂，如内皮抑制素等配合治疗，有助于改善卵巢癌患者的预后。
, 百拇医药
参考文献
1，Hollingsworth HC,Kohn EC,Steinberg SM,et al.Tumor
angiogenesis in advanced stage ovarian carcinoma.Am J Pathol,1995,147(1):33
2，Folkman J.The role of angiogenesis in tumor growth.Semin
Cancer Biol,1992,3(1):65
3，Folkman J,Wastonk,Ingber D,et al.Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia.Nature,1989,339(1):58
4，李晓明，综述.血管内皮生长因子及其受体与肿瘤血管形成.国外医学肿瘤学分册，1997，24(1)：11
2000-03-01
2000-08-19, http://www.100md.com