改良TRAP法检测胃粘膜标本端粒酶活性
作者：伍勇 陈正炎
单位：湖南医科大学湖南 长沙 410078
关键词：胃肿瘤；癌；端粒酶；实验室诊断；胃粘膜活检
中国医师杂志001208[中图分类号] R365；R446.8 [文献标识码] A [文章编号] 1008-1372(2000)12-0723-02
Detection of Telomerase Activity in Gastric Mucosa
by Improved TRAP Assay
WU Yong,CHEN Zheng-yan
(Faculty of Medical Laboratory Science,Hunan Medical University,Changsha,410078，China)
, 百拇医药
【Abstract】 Telomerase activity in 43 biopsy of gastric mucosa was detected with the modified telomeric repeat amplification protocol(TRAP) assay to elucidate pathogenesis of gastric cancer.The detected positive rates were as follows:87%(20/23) in gastric cancer,28.6%(2/7) in moderate and non-typical gastritis ,0%(0/10 in atrophic and superficial gastritis,respectively.These results suggest that the detection of telomerase activity may play a significant role in the diagnosis of gastric cancer.
, 百拇医药
Key Words Gastric tumor,cancer;Telomerase;Laboratory diagnosis;Gastric mucosa biopsy
新近研究表明，端粒酶是肿瘤细胞能够无限增殖的一个重要分子标志物，与肿瘤的发生有着密切关系。端粒酶活性的检测应用于胃粘膜标本对胃癌的诊断，目前尚鲜报道。本文采用改良TRAP法[1]对胃粘膜活检标本的端粒酶活性进行检测。以期初步探讨端粒酶与胃癌发生的关系及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 胃粘膜活检标本 湖南医科大学附三医院1998年1月至3月胃镜下取活检标本共43例。每例取4块可疑病变标本，2块作病理检查，2块做端粒酶活性检测。
1.2 雄性昆明小鼠睾丸 由湖南医科大学动物部提供，具有合格证。要求体重大于40g。即日龄超过60d的性成熟雄性昆明小鼠。
, 百拇医药
1.3 主要仪器 ZHP-2B型PCR扩增仪(中国华联科学技术开发公司)，ZF-3型紫外透射反射分析仪(上海长明光学电子仪器厂)，DYY-Ⅲ型垂直电泳槽(北京六一仪器厂)，BT228K-80LH型低温冰箱(法国RUA公司)。
1.3.1 细胞提取物的制备：取组织标本，称重后，用冰冷的0.1mmol/L PBS和洗涤液[含10mmol/L HEPES-KOH(pH7.5，FARCO，香港)，1.0mmol/L MgCl2，10mmol/L KCl]，在4℃条件下，3500rpm离心10min，各清洗一次，所得沉淀物置于-80℃冰箱中保存。将冰冻的沉淀物于冰浴中匀浆10min后，按5μl/mg组织加入冰冷的溶解液[含10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，1.0mmol/L MgCl2 1.0mmol/L EGTA,0.1mmol/L PMSF(sigma 美国)，5.0mmol/L BME,0.5% CHAPS(sigma美国)，10%甘油]，继续匀浆10min，再冰浴30min。在4℃条件下，以3500rpm离心30min，取上清液(此即细胞提取物)。用酚试剂法测定其所含蛋白质浓度[2]，提取物可再贮存于-80℃冰箱中。
, 百拇医药
1.3.2 端粒酶活性的检测[3]：于-80℃冰箱中取出细胞提取物，解冻后以冰冷的1×TRAP Buffer稀释至其所含蛋白质浓度为3g/L，即为待检样品。在10μl待检样品中加入1μg RNase A，将其置于37℃孵育30min，此为待检样品的阴性对照。在0.5ml的离心管中加入10×TRAP Buffer[含20mmol/L Tris-Hcl,1.5mmol/L MgCl2，63mmol/L Kcl，0.005% Tween-20,1.0mmol/L EGTA]5μl，0.5mmol/L dNTP各5μl，0.1%BSA 5μl，1.00 DTS引物5”-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’3μl，待检样品(或阴性对照)2μl，DDW10μl，石蜡油30μl，混合后，于23℃延伸30min。再加入2u/μl Taq DNA聚合酶1μl，1.00D CX引物5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3’3μl，混合后，进行PCR扩增。参数为：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min30s，循环35次，最后72℃持续5min。取PCR产物20μl，于0.9mm厚度的15%非变性聚丙烯酰胺凝胶中，以120V电泳6h，取下胶膜，于0.5μg/ml EB液中染色45min。将胶膜置于紫外透射分析仪上观察结果。
, 百拇医药
2 结果
以改良TRAP法对43例胃粘膜活检标本进行端粒酶活性定性检测，其结果见附表。经χ2检验，胃癌标本中端粒酶阳性(20/23，占87%)明显高于其它胃粘膜病变(P<0.005)。附表中43例胃粘膜活检标本的端粒酶检测结果见附图。
附表 43例不同胃粘膜病变标本
端粒酶活性的检测结果 病理诊断
例数
端粒酶阳性(%)
浅表性胃炎
10
0
萎缩性胃炎
, http://www.100md.com
3
0
中度胃炎、非典型性增生
7
2(28.6)
胃癌*
23
20(87)
*胃癌标本中，包括15例低分化腺癌，4例中度分化腺癌4例其它类型癌症
附图 胃粘膜活检标本端粒酶活性的检测结果
, http://www.100md.com
⑴浅表性胃炎；⑵中度胃炎，非典型性增生；⑶低分化腺癌；
⑷重度浅表性胃炎；⑸pGEM-7Zf(+)/HaeⅢMarkers；⑹阴性对照
3 讨论
端粒是由一段重复DNA序列组成的一种特殊结构，它位于真核细胞染色体末端。因为DNA聚合酶不能完全复制线性DNA分子的3’末端，导致细胞在每次分裂过程中将丢失大约50～200bp染色体末端的核苷酸。随着端粒缩短至某一临界值时，就将导致正常体细胞复制凋亡。端粒酶是一种以自身RNA为模板，在染色体3’末端合成端粒DNA寡核苷酸的蛋白质复合物[5]，它能通过阻止端粒缩短而使某些特定细胞逃避凋亡而获得无限生命力。一般认为这些特定细胞包括睾丸和卵巢中的胚胎系细胞，永生化细胞和肿瘤细胞，而不包括正常的体细胞[5]。
端粒酶已在多种恶性肿瘤中被检测出来，但都是检测手术后的切除标本。Hiyama[6]和Kuniyasu[8，7]取手术后胃癌切除标本，以TRAP法进行检测，其胃癌组织标本端粒酶阳性率分别为85%和87%。本文采用改良TRAP法对43例胃粘膜活检标本进行检测，其中，23例胃癌标本中有20例呈现阳性结果(87%)；7例胃粘膜癌前病变标本中有2例呈阳性(28.6%)；3例萎缩性胃炎和10例浅表性胃炎中无一例阳性。由此可见，胃癌标本端粒酶活性的阳性率明显高于其它胃粘膜病变(P<0.005)，端粒酶活性的检测可以作为胃癌临床诊断的一个指标。有3例胃癌标本未能检出端粒酶活性，可能是因为有些胃癌标本端粒酶尚未表达，或者是因为活检时未取到癌变组织。在这3例标本中，其病理结果有低分化腺癌，也有中度分化腺癌，提示虽然端粒酶与肿瘤的发生关系密切，但与肿瘤恶性程度的关系尚不能肯定。萎缩性胃炎组织中有2例呈现出端粒酶阳性，说明端粒酶在癌前病变组织中就可能于个别细胞中已有表达，这将有助于胃癌的早期发现。
, 百拇医药
参考文献
1，彭剑雄，陈正炎，李志坚，等.急性白血病端粒酶活性的表达.湖南医科大学学报 1998；23(3)：289～291
2，王文霞，郑铁生，陈正炎，等.临床生化检验技术.南京：南京大学出版社 1995；182～184
3，Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science 1994；266：2011～2015
4，Greider CW,Blackburn EH.A telomeric sequence in the RNA of Tetrahynema telomerase required for telomere repeat synthesis.Nature 1989；337：331～337
, 百拇医药
5，Counter CM,Hivt HW,Bacchetti S,et al.Telomerase activity in human overian cacinoma.Proc Natl Acad Sci USA 1994；91：2900～2904
6，Hiyama E,Yokoyama T,Totsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer.Cancer Res 1995；55：3258～3262
7，Kuniyasu H,Domen T,Hamamoto T,et al.Expression of human telomerase RNA is an early event of stomach carcinogenesis.Jpn J Cancer Res 1997；88：103～107
[收稿日期：1998-08-17], 百拇医药
单位：湖南医科大学湖南 长沙 410078
关键词：胃肿瘤；癌；端粒酶；实验室诊断；胃粘膜活检
中国医师杂志001208[中图分类号] R365；R446.8 [文献标识码] A [文章编号] 1008-1372(2000)12-0723-02
Detection of Telomerase Activity in Gastric Mucosa
by Improved TRAP Assay
WU Yong,CHEN Zheng-yan
(Faculty of Medical Laboratory Science,Hunan Medical University,Changsha,410078，China)
, 百拇医药
【Abstract】 Telomerase activity in 43 biopsy of gastric mucosa was detected with the modified telomeric repeat amplification protocol(TRAP) assay to elucidate pathogenesis of gastric cancer.The detected positive rates were as follows:87%(20/23) in gastric cancer,28.6%(2/7) in moderate and non-typical gastritis ,0%(0/10 in atrophic and superficial gastritis,respectively.These results suggest that the detection of telomerase activity may play a significant role in the diagnosis of gastric cancer.
, 百拇医药
Key Words Gastric tumor,cancer;Telomerase;Laboratory diagnosis;Gastric mucosa biopsy
新近研究表明，端粒酶是肿瘤细胞能够无限增殖的一个重要分子标志物，与肿瘤的发生有着密切关系。端粒酶活性的检测应用于胃粘膜标本对胃癌的诊断，目前尚鲜报道。本文采用改良TRAP法[1]对胃粘膜活检标本的端粒酶活性进行检测。以期初步探讨端粒酶与胃癌发生的关系及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 胃粘膜活检标本 湖南医科大学附三医院1998年1月至3月胃镜下取活检标本共43例。每例取4块可疑病变标本，2块作病理检查，2块做端粒酶活性检测。
1.2 雄性昆明小鼠睾丸 由湖南医科大学动物部提供，具有合格证。要求体重大于40g。即日龄超过60d的性成熟雄性昆明小鼠。
, 百拇医药
1.3 主要仪器 ZHP-2B型PCR扩增仪(中国华联科学技术开发公司)，ZF-3型紫外透射反射分析仪(上海长明光学电子仪器厂)，DYY-Ⅲ型垂直电泳槽(北京六一仪器厂)，BT228K-80LH型低温冰箱(法国RUA公司)。
1.3.1 细胞提取物的制备：取组织标本，称重后，用冰冷的0.1mmol/L PBS和洗涤液[含10mmol/L HEPES-KOH(pH7.5，FARCO，香港)，1.0mmol/L MgCl2，10mmol/L KCl]，在4℃条件下，3500rpm离心10min，各清洗一次，所得沉淀物置于-80℃冰箱中保存。将冰冻的沉淀物于冰浴中匀浆10min后，按5μl/mg组织加入冰冷的溶解液[含10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，1.0mmol/L MgCl2 1.0mmol/L EGTA,0.1mmol/L PMSF(sigma 美国)，5.0mmol/L BME,0.5% CHAPS(sigma美国)，10%甘油]，继续匀浆10min，再冰浴30min。在4℃条件下，以3500rpm离心30min，取上清液(此即细胞提取物)。用酚试剂法测定其所含蛋白质浓度[2]，提取物可再贮存于-80℃冰箱中。
, 百拇医药
1.3.2 端粒酶活性的检测[3]：于-80℃冰箱中取出细胞提取物，解冻后以冰冷的1×TRAP Buffer稀释至其所含蛋白质浓度为3g/L，即为待检样品。在10μl待检样品中加入1μg RNase A，将其置于37℃孵育30min，此为待检样品的阴性对照。在0.5ml的离心管中加入10×TRAP Buffer[含20mmol/L Tris-Hcl,1.5mmol/L MgCl2，63mmol/L Kcl，0.005% Tween-20,1.0mmol/L EGTA]5μl，0.5mmol/L dNTP各5μl，0.1%BSA 5μl，1.00 DTS引物5”-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’3μl，待检样品(或阴性对照)2μl，DDW10μl，石蜡油30μl，混合后，于23℃延伸30min。再加入2u/μl Taq DNA聚合酶1μl，1.00D CX引物5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3’3μl，混合后，进行PCR扩增。参数为：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min30s，循环35次，最后72℃持续5min。取PCR产物20μl，于0.9mm厚度的15%非变性聚丙烯酰胺凝胶中，以120V电泳6h，取下胶膜，于0.5μg/ml EB液中染色45min。将胶膜置于紫外透射分析仪上观察结果。
, 百拇医药
2 结果
以改良TRAP法对43例胃粘膜活检标本进行端粒酶活性定性检测，其结果见附表。经χ2检验，胃癌标本中端粒酶阳性(20/23，占87%)明显高于其它胃粘膜病变(P<0.005)。附表中43例胃粘膜活检标本的端粒酶检测结果见附图。
附表 43例不同胃粘膜病变标本
端粒酶活性的检测结果 病理诊断
例数
端粒酶阳性(%)
浅表性胃炎
10
0
萎缩性胃炎
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3
0
中度胃炎、非典型性增生
7
2(28.6)
胃癌*
23
20(87)
*胃癌标本中，包括15例低分化腺癌，4例中度分化腺癌4例其它类型癌症
附图 胃粘膜活检标本端粒酶活性的检测结果
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⑴浅表性胃炎；⑵中度胃炎，非典型性增生；⑶低分化腺癌；
⑷重度浅表性胃炎；⑸pGEM-7Zf(+)/HaeⅢMarkers；⑹阴性对照
3 讨论
端粒是由一段重复DNA序列组成的一种特殊结构，它位于真核细胞染色体末端。因为DNA聚合酶不能完全复制线性DNA分子的3’末端，导致细胞在每次分裂过程中将丢失大约50～200bp染色体末端的核苷酸。随着端粒缩短至某一临界值时，就将导致正常体细胞复制凋亡。端粒酶是一种以自身RNA为模板，在染色体3’末端合成端粒DNA寡核苷酸的蛋白质复合物[5]，它能通过阻止端粒缩短而使某些特定细胞逃避凋亡而获得无限生命力。一般认为这些特定细胞包括睾丸和卵巢中的胚胎系细胞，永生化细胞和肿瘤细胞，而不包括正常的体细胞[5]。
端粒酶已在多种恶性肿瘤中被检测出来，但都是检测手术后的切除标本。Hiyama[6]和Kuniyasu[8，7]取手术后胃癌切除标本，以TRAP法进行检测，其胃癌组织标本端粒酶阳性率分别为85%和87%。本文采用改良TRAP法对43例胃粘膜活检标本进行检测，其中，23例胃癌标本中有20例呈现阳性结果(87%)；7例胃粘膜癌前病变标本中有2例呈阳性(28.6%)；3例萎缩性胃炎和10例浅表性胃炎中无一例阳性。由此可见，胃癌标本端粒酶活性的阳性率明显高于其它胃粘膜病变(P<0.005)，端粒酶活性的检测可以作为胃癌临床诊断的一个指标。有3例胃癌标本未能检出端粒酶活性，可能是因为有些胃癌标本端粒酶尚未表达，或者是因为活检时未取到癌变组织。在这3例标本中，其病理结果有低分化腺癌，也有中度分化腺癌，提示虽然端粒酶与肿瘤的发生关系密切，但与肿瘤恶性程度的关系尚不能肯定。萎缩性胃炎组织中有2例呈现出端粒酶阳性，说明端粒酶在癌前病变组织中就可能于个别细胞中已有表达，这将有助于胃癌的早期发现。
, 百拇医药
参考文献
1，彭剑雄，陈正炎，李志坚，等.急性白血病端粒酶活性的表达.湖南医科大学学报 1998；23(3)：289～291
2，王文霞，郑铁生，陈正炎，等.临床生化检验技术.南京：南京大学出版社 1995；182～184
3，Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science 1994；266：2011～2015
4，Greider CW,Blackburn EH.A telomeric sequence in the RNA of Tetrahynema telomerase required for telomere repeat synthesis.Nature 1989；337：331～337
, 百拇医药
5，Counter CM,Hivt HW,Bacchetti S,et al.Telomerase activity in human overian cacinoma.Proc Natl Acad Sci USA 1994；91：2900～2904
6，Hiyama E,Yokoyama T,Totsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer.Cancer Res 1995；55：3258～3262
7，Kuniyasu H,Domen T,Hamamoto T,et al.Expression of human telomerase RNA is an early event of stomach carcinogenesis.Jpn J Cancer Res 1997；88：103～107
[收稿日期：1998-08-17], 百拇医药