P16蛋白的表达与卵巢癌组织学类型及预后的相关性
作者：周晓宁 陈晓东 崔英 惠宁 顾青 韩青凤 丛文玲
单位：周晓宁 崔英 惠宁 顾青 韩青凤(第二军医大学长海医院妇产科， 上海 200433)；陈晓东(广州军区广州总医院病理科)；丛文玲(沈阳军区81820部队)
关键词：卵巢肿瘤；P16蛋白；免疫组织化学
第二军医大学学报001220 [摘要] 目的：探讨多肿瘤抑制基因编码 的P16蛋白表达与卵巢癌生物学特性及患者预后的相关性。方法：应用 免疫组织化学S-P法检测58例人卵巢癌组织中P16蛋白的表达。结果： (1) P16蛋白在不同病理组织学类型的卵巢癌组织中阳性表达率不同，表现为低分化腺癌的 阳性表达率低于交界性肿瘤，两者相差显著(P<0.05)。(2) 术中发现有淋巴结及网膜 转移的患者，其卵巢癌组织中P16蛋白的阳性表达率低于无转移者，两者相差非常显著 (P<0.01)；但其阳性率在原发灶与转移灶间相差不显著(P>0.05)。(3) 术后 存活期小于或等于2年的患者，其卵巢癌组织中P16蛋白的阳性表达率低于术后存活时间大于 2年者，两者相差显著(P<0.05)。结论：P16蛋白在抑制卵巢癌 的发生发展中起重要作用，检测卵巢组织P16蛋白的表达，可对患者的治疗方案选择及预后 判断提供有价值的信息。
, 百拇医药
[中图分类号] R 737.31 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1158-03
Correlation of protein P16 expression with histologic types and prognosis of o varian cancer
ZHOU Xiao-Ning CUI Ying HUI Ning GU Qing HA N Qing-Feng
(Department of Gynecology and Obstetrics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, http://www.100md.com
CHEN Xiao-Dong
(Department of Pathology, General Hospital of Guangzhou Army District, PLA)
CONG Wen-Ling
(Unit of 81820, Shenyang Military Area Command)
[ABSTRACT] Objective: To detect the expression of protein P16 in 58 cases of ovarian cancer, study its clinic significance and the function o f protein P16 in ovary carcinogenesis. Methods: The expression o f protein P16 in human ovarian cancer tissue was observed with immunohistochemica l method and streptavidin peroxdase conjugataed method. Results: T he expressi on of protein P16 was related to histologic types of ovarian cancer(P<0.05), the differences in positive rate were found mainly between adenocarcinoma and border line tumor; the former was lower. It was related closely to lymph nod al and great omental metastases(P<0.01), the positive rate of primary sites in patiants with metastases was lower than those who had no metastases; but ther e was no difference in positive rate between primary sites and metastases(P> 0.05). T he expression was also related to the survival time after operation(P<0.05). Conclusion: Protein P16 may play an important role in human o vary carcinogenesis. The expression of protein P16 in ovarian tumor tissue may ser ve as one of assessable factors for prognosis in patients with ovarian carcinoma .
, 百拇医药
[KEY WORDS] ovarian neoplasms; protein P16; immunohistochemistry
多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，MTS1)亦称p16基因，是1993年Serra no和Beach等[1]首先发现并分离的，进而克隆了其cDNA。人类p16基因位于9p21， 编码蛋白的相对分子质量约为16 000，是细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)的抑制因子。已 知视网膜母细胞瘤蛋白Rb在控制真核细胞周期中起重要作用，非磷酸化或低磷酸化Rb可阻止 细胞由G1相进入S相，而CDK可通过多途径调节Rb磷酸化的活性，各种细胞周期蛋白均可激 活CDK，P16蛋白与周期蛋白竞争结合CDK4，共同完成细胞周期调节[1，2]。
p16基因突变在人恶性肿瘤中普遍存在，突变率30%～80%不等。在肿瘤中如此广泛的突变说 明该基因与肿瘤的发生发展密切相关。本实验通过检测P16蛋白在人卵巢癌中的表达，探讨p 16基因与人卵巢癌发生发展的关系及其表达的临床意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本制备 卵巢癌组织取自本院病理科1978年～1996年存档的石蜡包埋标本 ，共58例。根据国际妇产联盟(FIGO)卵巢恶性肿瘤分期标准(1985)进行分期，Ⅰ～Ⅱ期 25例，Ⅲ～Ⅳ期33例，其中12例仅有原发灶标本，7例因手术困难，仅有活检所取网膜病灶 标本。所有病例均有完整病历及随访资料，其中44例随访时间超过2年。所有标本行连续切 片，厚4 μm。
1.2 主要试剂及仪器 兔抗人P16多克隆抗体由美国Santa Cruze生化公司生产； 通用型抗生蛋白链菌素-过氧化物酶(SP)试剂盒由美国Zymed公司生产；医用微波仪2D -Ⅱ由上海中达医学应用研究所生产。
1.3 实验方法 石蜡切片常规脱蜡到水，充分洗涤；微波抗原修复后冷却至室温 ；滴加10%非免疫性马血清，室温下孵育10 min；每张切片滴加50 μl抗P16多克隆抗体稀释 液(1∶50)，4℃孵育过夜；PBS液洗；滴加生物素标记的通用型第二抗体稀释液(1∶120 )，室温下孵育30 min，PBS液洗；滴加S-P复合物稀释液(1∶120)，室温下孵育30 min ，PBS液洗；DAB-H2O2显色，苏木精衬染，常规脱水，吹干封片。用PBS液替代特异性 一抗作为阴性对照；用已知表达P16蛋白的结肠癌组织作为阳性对照。
, 百拇医药
1.4 结果判定 阳性反应物质呈棕黄色颗粒分布于胞质中，胞核经苏木精衬染为 淡蓝色。肿瘤细胞无棕色反应为阴性(-)，肿瘤细胞内见棕黄色颗粒为阳性(+)，肿瘤 细胞内见棕褐色颗粒为强阳性(++)。
1.5 统计学处理 用χ2检验判定差异显著性。
2 结 果
2.1 P16蛋白的表达与卵巢癌组织学类型的关系 51例卵巢癌原 发灶标本中，浆液 性囊腺癌20例，阳性染色12例，阳性率60%；粘液性囊腺癌10例，阳性染色7例，阳性率70% ；子宫内膜样癌6例，阳性染色3例，阳性率50%；低分化腺癌8例，阳性染色3例，阳性率37. 5%；交界性肿瘤7例，阳性染色7例， 阳性率100%。各组间P16蛋白的阳性表达率经统计学处理，相差显著(P<0.05 )，进一步分别行两两组间比较，发现低分化腺癌组与交界性肿瘤组间阳性表达率相差显 著(P<0.05)，其余各组间相差不显著(P>0.05)。
, 百拇医药
2.2 P16蛋白的表达与卵巢癌淋巴结及网膜转移的关系 51例原发灶标本中，无淋 巴结及网膜转移者25例，阳性染色21例，阳性率84%；有转移者26例，阳性染色12例，阳 性率46.15%。两组间P16蛋白的阳性表达率经统计学处理，相差非常显著(P<0.0 1)。
2.3 卵巢癌原发灶和转移灶中P16蛋白的表达 在发生淋巴结网膜转移的33例患者 中，有原发灶26例，阳性率46.15%；转移灶21例，阳性染色11例，阳性率52.38%。两组间P1 6蛋白的阳性率经统计学处理，相差不显著(P>0.05)。
2.4 P16蛋白的表达与卵巢癌患者预后的关系 在44例随访满2年或术后2年内死 亡的病例中，术后生存期小于或等于2年的6例，阳性染色1例，阳性率16.67%；超过2年的 38例，阳性染色26例，阳性率68.42%。两组间P16蛋白的阳性表达率经统计学处理，相差显 著(P<0.05)。
, 百拇医药 3 讨 论
细胞作为机体的最小功能单位，其生长过程总是处于增殖与抑制增殖的动态平衡之中， 因此细胞内同时存在着促进与抑制增殖两种体系，即周期蛋白和抑制蛋白对CDK进行正负平 衡调节。P16蛋白即为CDK4的抑制因子，因而在调控细胞周期演进及细胞分化中起着举足轻 重的作用。Kamb等[3]分析了多种人恶性肿瘤细胞系中p16基因的缺失情况，发现卵 巢癌细胞系中p16基因的缺失率为29%；卵巢癌组织中p16基因的缺失率在15%～30% [4，5]。另外，染色体9p的异常在卵巢癌研究中也常常被提及。由于p16基因是近年来 新克隆成功的基因，它与卵巢癌临床特征的相关性研究目前开展还很少。 本实验检测了58例人卵巢癌组织中P16蛋白的表达情况，发现P16蛋白的表达与卵巢癌 原发灶的病理组织学类型相关，表现为低分化腺癌组与交界性肿瘤组间阳性表达率相差显著 。由于低分化腺癌细胞的增殖能力一般均强于交界性肿瘤细胞，实验结果与P16蛋白的功能 是一致的。因本实验中有些病理组织学类型的标本较少，可能对其阳性率的代表性有一定影 响，因此这方面的结果尚有待于今后扩大样本量后的进一步研究证实。本实验还发现：P16 蛋白的表达与卵巢癌发生淋巴结、网膜转移呈负相关，术时无转移的卵巢癌患者，其原发病 灶的P16蛋白阳性表达率明显高于有转移者，两者相差非常显著，说明肿瘤细胞增殖力的失 控与肿瘤转移发生有密切联系。但在有转移的病例中，其原发灶和转移灶间的阳性率却相差 不显著，提示无论原发灶还是转移灶，其肿瘤细胞的增殖失控状态是相似的。P16蛋白的表 达还与患者的预后呈正相关。Fujita等[6]的研究也发现，P16蛋白表达异常在低分 级的卵巢肿瘤 中频率更高，且与p16 mRNA的低表达密切相关。章小维等[7]用PCR技术对37例卵巢 癌的检测显示，p16基因缺失与卵巢肿瘤的分化、临床分期及有无淋巴结转移均无明显关系 ，但发现该基因缺失在上皮性肿瘤的不同组织学类型中均存在，认为p16基因异常可能是卵 巢上皮性癌发病的重要原因。本实验结果提示，P16蛋白的缺失与卵巢癌的发生发展有重要 的联系，检测肿瘤组织中P16蛋白的表达情况，对患者的治疗方案选择及预后判断有重要的 指导意义。
, 百拇医药
虽然p16基因与卵巢癌的相关性还有待于进一步研究，但它在肿瘤研究中的重要性已日益受 到重视。因为在基因诊断和基因治疗中，p16的潜在前景非常广阔：基因长度短，易于操作 ，易于标定；蛋白产物特异性强，作用直接；在肿瘤中基因突变率高，分布广，应用范围大 。因此对p16基因的深入探讨，将为卵巢癌的病因，治疗研究开辟一个崭新的领域。
[作者简介] 周晓宁(1964-)，女(汉族)，硕士，主治医师.
参考文献
[1] Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell -cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4[J]. Nature, 1993,366(6456):704-707.
, 百拇医药 [2] Marx J. New tumor suppressor may rival p53[J]. Science, 1994,264(5 157):344-345.
[3] Kamb A, Gruis NA, Weaver FJ, et al. A cell cycle regulator potent ially involved in genesis of many tumor types[J]. Science, 1994,264(5157):436 -440.
[4] Kanuma T, Nishida J, Gima T, et al. Alterations of the p16INK4A g ene in human ovarian cancers[J]. Mol Carcinog, 1997,18(3):134-141.
[5] Schuyer M, van Staveren IL, Klijn JG, et al. Sporadic CDKN2 (MTS1 /p16ink4) gene alterations in human ovarian tumours[J]. Br J Cancer, 19 96,74(7):1069-1073.
[6] Fujita M , Enomoto T, Haba T, et al. Alteration of p16 and p15 genes in common epithelial ovarian tumors[J]. Int J Cancer, 1997,74(2):148- 155.
[7] 章小维，张 琼，郭燕燕.卵巢恶性上皮性肿瘤组织中p16基因缺失的分析[J ].中华妇产科杂志，1997，32(8)：493-494.
[收稿日期] 2000-05-08
[修回日期] 2000-11-03, http://www.100md.com
单位：周晓宁 崔英 惠宁 顾青 韩青凤(第二军医大学长海医院妇产科， 上海 200433)；陈晓东(广州军区广州总医院病理科)；丛文玲(沈阳军区81820部队)
关键词：卵巢肿瘤；P16蛋白；免疫组织化学
第二军医大学学报001220 [摘要] 目的：探讨多肿瘤抑制基因编码 的P16蛋白表达与卵巢癌生物学特性及患者预后的相关性。方法：应用 免疫组织化学S-P法检测58例人卵巢癌组织中P16蛋白的表达。结果： (1) P16蛋白在不同病理组织学类型的卵巢癌组织中阳性表达率不同，表现为低分化腺癌的 阳性表达率低于交界性肿瘤，两者相差显著(P<0.05)。(2) 术中发现有淋巴结及网膜 转移的患者，其卵巢癌组织中P16蛋白的阳性表达率低于无转移者，两者相差非常显著 (P<0.01)；但其阳性率在原发灶与转移灶间相差不显著(P>0.05)。(3) 术后 存活期小于或等于2年的患者，其卵巢癌组织中P16蛋白的阳性表达率低于术后存活时间大于 2年者，两者相差显著(P<0.05)。结论：P16蛋白在抑制卵巢癌 的发生发展中起重要作用，检测卵巢组织P16蛋白的表达，可对患者的治疗方案选择及预后 判断提供有价值的信息。
, 百拇医药
[中图分类号] R 737.31 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1158-03
Correlation of protein P16 expression with histologic types and prognosis of o varian cancer
ZHOU Xiao-Ning CUI Ying HUI Ning GU Qing HA N Qing-Feng
(Department of Gynecology and Obstetrics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, http://www.100md.com
CHEN Xiao-Dong
(Department of Pathology, General Hospital of Guangzhou Army District, PLA)
CONG Wen-Ling
(Unit of 81820, Shenyang Military Area Command)
[ABSTRACT] Objective: To detect the expression of protein P16 in 58 cases of ovarian cancer, study its clinic significance and the function o f protein P16 in ovary carcinogenesis. Methods: The expression o f protein P16 in human ovarian cancer tissue was observed with immunohistochemica l method and streptavidin peroxdase conjugataed method. Results: T he expressi on of protein P16 was related to histologic types of ovarian cancer(P<0.05), the differences in positive rate were found mainly between adenocarcinoma and border line tumor; the former was lower. It was related closely to lymph nod al and great omental metastases(P<0.01), the positive rate of primary sites in patiants with metastases was lower than those who had no metastases; but ther e was no difference in positive rate between primary sites and metastases(P> 0.05). T he expression was also related to the survival time after operation(P<0.05). Conclusion: Protein P16 may play an important role in human o vary carcinogenesis. The expression of protein P16 in ovarian tumor tissue may ser ve as one of assessable factors for prognosis in patients with ovarian carcinoma .
, 百拇医药
[KEY WORDS] ovarian neoplasms; protein P16; immunohistochemistry
多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，MTS1)亦称p16基因，是1993年Serra no和Beach等[1]首先发现并分离的，进而克隆了其cDNA。人类p16基因位于9p21， 编码蛋白的相对分子质量约为16 000，是细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)的抑制因子。已 知视网膜母细胞瘤蛋白Rb在控制真核细胞周期中起重要作用，非磷酸化或低磷酸化Rb可阻止 细胞由G1相进入S相，而CDK可通过多途径调节Rb磷酸化的活性，各种细胞周期蛋白均可激 活CDK，P16蛋白与周期蛋白竞争结合CDK4，共同完成细胞周期调节[1，2]。
p16基因突变在人恶性肿瘤中普遍存在，突变率30%～80%不等。在肿瘤中如此广泛的突变说 明该基因与肿瘤的发生发展密切相关。本实验通过检测P16蛋白在人卵巢癌中的表达，探讨p 16基因与人卵巢癌发生发展的关系及其表达的临床意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本制备 卵巢癌组织取自本院病理科1978年～1996年存档的石蜡包埋标本 ，共58例。根据国际妇产联盟(FIGO)卵巢恶性肿瘤分期标准(1985)进行分期，Ⅰ～Ⅱ期 25例，Ⅲ～Ⅳ期33例，其中12例仅有原发灶标本，7例因手术困难，仅有活检所取网膜病灶 标本。所有病例均有完整病历及随访资料，其中44例随访时间超过2年。所有标本行连续切 片，厚4 μm。
1.2 主要试剂及仪器 兔抗人P16多克隆抗体由美国Santa Cruze生化公司生产； 通用型抗生蛋白链菌素-过氧化物酶(SP)试剂盒由美国Zymed公司生产；医用微波仪2D -Ⅱ由上海中达医学应用研究所生产。
1.3 实验方法 石蜡切片常规脱蜡到水，充分洗涤；微波抗原修复后冷却至室温 ；滴加10%非免疫性马血清，室温下孵育10 min；每张切片滴加50 μl抗P16多克隆抗体稀释 液(1∶50)，4℃孵育过夜；PBS液洗；滴加生物素标记的通用型第二抗体稀释液(1∶120 )，室温下孵育30 min，PBS液洗；滴加S-P复合物稀释液(1∶120)，室温下孵育30 min ，PBS液洗；DAB-H2O2显色，苏木精衬染，常规脱水，吹干封片。用PBS液替代特异性 一抗作为阴性对照；用已知表达P16蛋白的结肠癌组织作为阳性对照。
, 百拇医药
1.4 结果判定 阳性反应物质呈棕黄色颗粒分布于胞质中，胞核经苏木精衬染为 淡蓝色。肿瘤细胞无棕色反应为阴性(-)，肿瘤细胞内见棕黄色颗粒为阳性(+)，肿瘤 细胞内见棕褐色颗粒为强阳性(++)。
1.5 统计学处理 用χ2检验判定差异显著性。
2 结 果
2.1 P16蛋白的表达与卵巢癌组织学类型的关系 51例卵巢癌原 发灶标本中，浆液 性囊腺癌20例，阳性染色12例，阳性率60%；粘液性囊腺癌10例，阳性染色7例，阳性率70% ；子宫内膜样癌6例，阳性染色3例，阳性率50%；低分化腺癌8例，阳性染色3例，阳性率37. 5%；交界性肿瘤7例，阳性染色7例， 阳性率100%。各组间P16蛋白的阳性表达率经统计学处理，相差显著(P<0.05 )，进一步分别行两两组间比较，发现低分化腺癌组与交界性肿瘤组间阳性表达率相差显 著(P<0.05)，其余各组间相差不显著(P>0.05)。
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2.2 P16蛋白的表达与卵巢癌淋巴结及网膜转移的关系 51例原发灶标本中，无淋 巴结及网膜转移者25例，阳性染色21例，阳性率84%；有转移者26例，阳性染色12例，阳 性率46.15%。两组间P16蛋白的阳性表达率经统计学处理，相差非常显著(P<0.0 1)。
2.3 卵巢癌原发灶和转移灶中P16蛋白的表达 在发生淋巴结网膜转移的33例患者 中，有原发灶26例，阳性率46.15%；转移灶21例，阳性染色11例，阳性率52.38%。两组间P1 6蛋白的阳性率经统计学处理，相差不显著(P>0.05)。
2.4 P16蛋白的表达与卵巢癌患者预后的关系 在44例随访满2年或术后2年内死 亡的病例中，术后生存期小于或等于2年的6例，阳性染色1例，阳性率16.67%；超过2年的 38例，阳性染色26例，阳性率68.42%。两组间P16蛋白的阳性表达率经统计学处理，相差显 著(P<0.05)。
, 百拇医药 3 讨 论
细胞作为机体的最小功能单位，其生长过程总是处于增殖与抑制增殖的动态平衡之中， 因此细胞内同时存在着促进与抑制增殖两种体系，即周期蛋白和抑制蛋白对CDK进行正负平 衡调节。P16蛋白即为CDK4的抑制因子，因而在调控细胞周期演进及细胞分化中起着举足轻 重的作用。Kamb等[3]分析了多种人恶性肿瘤细胞系中p16基因的缺失情况，发现卵 巢癌细胞系中p16基因的缺失率为29%；卵巢癌组织中p16基因的缺失率在15%～30% [4，5]。另外，染色体9p的异常在卵巢癌研究中也常常被提及。由于p16基因是近年来 新克隆成功的基因，它与卵巢癌临床特征的相关性研究目前开展还很少。 本实验检测了58例人卵巢癌组织中P16蛋白的表达情况，发现P16蛋白的表达与卵巢癌 原发灶的病理组织学类型相关，表现为低分化腺癌组与交界性肿瘤组间阳性表达率相差显著 。由于低分化腺癌细胞的增殖能力一般均强于交界性肿瘤细胞，实验结果与P16蛋白的功能 是一致的。因本实验中有些病理组织学类型的标本较少，可能对其阳性率的代表性有一定影 响，因此这方面的结果尚有待于今后扩大样本量后的进一步研究证实。本实验还发现：P16 蛋白的表达与卵巢癌发生淋巴结、网膜转移呈负相关，术时无转移的卵巢癌患者，其原发病 灶的P16蛋白阳性表达率明显高于有转移者，两者相差非常显著，说明肿瘤细胞增殖力的失 控与肿瘤转移发生有密切联系。但在有转移的病例中，其原发灶和转移灶间的阳性率却相差 不显著，提示无论原发灶还是转移灶，其肿瘤细胞的增殖失控状态是相似的。P16蛋白的表 达还与患者的预后呈正相关。Fujita等[6]的研究也发现，P16蛋白表达异常在低分 级的卵巢肿瘤 中频率更高，且与p16 mRNA的低表达密切相关。章小维等[7]用PCR技术对37例卵巢 癌的检测显示，p16基因缺失与卵巢肿瘤的分化、临床分期及有无淋巴结转移均无明显关系 ，但发现该基因缺失在上皮性肿瘤的不同组织学类型中均存在，认为p16基因异常可能是卵 巢上皮性癌发病的重要原因。本实验结果提示，P16蛋白的缺失与卵巢癌的发生发展有重要 的联系，检测肿瘤组织中P16蛋白的表达情况，对患者的治疗方案选择及预后判断有重要的 指导意义。
, 百拇医药
虽然p16基因与卵巢癌的相关性还有待于进一步研究，但它在肿瘤研究中的重要性已日益受 到重视。因为在基因诊断和基因治疗中，p16的潜在前景非常广阔：基因长度短，易于操作 ，易于标定；蛋白产物特异性强，作用直接；在肿瘤中基因突变率高，分布广，应用范围大 。因此对p16基因的深入探讨，将为卵巢癌的病因，治疗研究开辟一个崭新的领域。
[作者简介] 周晓宁(1964-)，女(汉族)，硕士，主治医师.
参考文献
[1] Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell -cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4[J]. Nature, 1993,366(6456):704-707.
, 百拇医药 [2] Marx J. New tumor suppressor may rival p53[J]. Science, 1994,264(5 157):344-345.
[3] Kamb A, Gruis NA, Weaver FJ, et al. A cell cycle regulator potent ially involved in genesis of many tumor types[J]. Science, 1994,264(5157):436 -440.
[4] Kanuma T, Nishida J, Gima T, et al. Alterations of the p16INK4A g ene in human ovarian cancers[J]. Mol Carcinog, 1997,18(3):134-141.
[5] Schuyer M, van Staveren IL, Klijn JG, et al. Sporadic CDKN2 (MTS1 /p16ink4) gene alterations in human ovarian tumours[J]. Br J Cancer, 19 96,74(7):1069-1073.
[6] Fujita M , Enomoto T, Haba T, et al. Alteration of p16 and p15 genes in common epithelial ovarian tumors[J]. Int J Cancer, 1997,74(2):148- 155.
[7] 章小维，张 琼，郭燕燕.卵巢恶性上皮性肿瘤组织中p16基因缺失的分析[J ].中华妇产科杂志，1997，32(8)：493-494.
[收稿日期] 2000-05-08
[修回日期] 2000-11-03, http://www.100md.com