角蛋白14在胎儿表皮发育中表达的研究
作者：宋川 杨恬 曾益军
单位：第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室，重庆 400038
关键词：角蛋白14；人胚胎；角朊细胞
第三军医大学学报001212
提 要： 目的 了解角蛋白14(K14)在人胎儿表皮发育中的变化及意义。方法 早、中、晚期胎儿皮肤做冰冻切片，进行K14的免疫细胞化学染色(Immunocytochemistry，ICC)和原位杂交染色(in situ hybridization，ISH)，通过图像分析和统计学处理分析K14的变化及规律。结果 人胚胎12周表皮已表达K14，中期表达量最高，晚期也有较高表达，但主要局限于表皮基底层细胞。结论 胎儿表皮基底层角朊细胞(KC)表达K14，对维持KC形态,防止细胞溶解起重要作用。
中图法分类号： R329.1；R341.26 文献识别码： A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-5404(2000)12-1159-03
Expression of K14 in development of human fetal epidermis
SONG Chuan, YANG Tian, ZENG Yi-jun
(Department of Cell Biology,Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract： Objective To study the expression of K14 during the development of human fetal epidermis. Methods Human skin was taken from the early, middle and late human fetus respectively. K14 was determined with immunocytochemical and in situ hybridization techniques. Results were dealt with image analysis and the mophlogical and biochemical date were analyzed statistically. Results K14 were found in the early, middle and late human fetal epidermis. But highest level was found in the middle gestion. K14 was also found in higher level in the late gestation but mainly localized in the basal layer. Conclusion K14 is expressed by human fetal epidermal basal cell. It plays a pivotal role in the maintenance of epidermal cell shape and protecting the cell from lysing.
, 百拇医药
Key words: keratin 14; human fetus; keratinocyte
角蛋白属于直径10 nm左右的中间纤维超家族，主要存在于上皮细胞胞浆内，是构成细胞骨架的重要成分。按照分子量大小和等电点不同可将角蛋白分成许多组分，其中分子量为50×103的角蛋白14(Keratin 14,K14)是近年研究的热点。它分布在表皮的基底层细胞内，对维持细胞形态及完整性有重要作用。胚胎期是表皮发生、形成的重要时期，此时K14的变化和它对表皮形成的影响成为本研究的目的。
1 材料和方法
1.1 标本分组及处理
9例经人工流产术终止妊娠的胎儿背部皮肤，根据胚胎龄
分为：早期(约12周)4例，中期(约24周)2例，晚期(约36周)3例。标本经4%多聚甲醛固定。低温恒冷箱切片机切12 μm冰冻切片。
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1.2 免疫细胞化学染色[1]
标本切片先经鼠抗人K14单抗(广州中山公司，1∶100稀释)37℃中孵育2h，后于ABC试剂盒中(武汉博士德公司)A液、B液中37℃各孵育1h，DAB室温显色5min。以PBS液代替K14单抗作为阴性对照，以婴儿和成人(25岁)包皮标本同上染色作为阳性对照。
1.3 原位杂交染色
将重组有K14 cDNA的pGEM-3Z质粒(American Type Culture Collection)转化到JM109空白菌内，扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，分别加入HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶使之线性化，用Dig RNA标记试剂盒，分别标记成正义和反义探针，用贴片法进行原位杂交。分别以正义探针和空白杂交液替代K14 cDNA探针作为阴性对照，以婴儿和成人皮肤标本同上杂交染色作为阳性对照，质粒抽提试剂盒、限制性内切酶及Dig RNA标记试剂盒购于德国宝灵曼公司。
, 百拇医药
1.4 图像处理
Tiger图像分析软件(重庆大学)，测定表皮层平均积分光密度(AOD)值。
1.5 统计学处理
微软EXCEL 97 student's t检验。
2 结果
2.1 胚胎早期
表皮可见K14蛋白及mRNA阳性角朊细胞(Keratinocyte,KC)。ICC染色结果见图1，阳性细胞主要位于表皮基底层，基底层上层也有分布，阳性颗粒位于胞浆，阳性强度(+)；AOD为0.291±0.100。ISH染色结果见图2，阳性细胞有1～2层，位于基底层及基底上层，阳性颗粒位于胞浆内，阳性强度(+)；真皮其它细胞未见阳性染色；AOD为0.575±0.247。
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2.2 胚胎中期
ICC染色结果见图3，阳性细胞有2～3层，阳性细胞主要分布于基底层及基底上层，阳性颗粒大小均匀，位于胞浆内，染色强度(
)；AOD为0.975±0.035。ISH染色显示阳性细胞层数有2～3层，主要分布于基底层及基上层，毛囊、汗腺外层上皮也有阳性着色，阳性颗粒大小均匀，位于细胞内，染色强度()；AOD为1.132±0.685。
2.3 胚胎晚期
ICC染色显示阳性细胞主要局限于表皮基底层，阳性颗粒大小一致，位于胞浆内，染色强度()；AOD为1.041±0.500。ISH染色结果见图4，表皮基底层有阳性细胞，阳性颗粒位于胞浆内，染色强度()；AOD为1.198±0.739。
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图1 早期胎儿皮肤K14免疫细胞化学染色 (ABC×200)
Fig 1 ICC for K14 in early human fetus skin (ABC×200)
图2 早期胎儿皮肤K14原位杂交染色 (ISH×200)
Fig 2 ISH for K14 in early human fetus skin (ISH×200)
图3 中期胎儿皮肤K14免疫细胞化学染色 (ABC×200)
Fig 3 ICC for K14 in middle human fetus skin (ABC×200)
, 百拇医药
图4 晚期胎儿皮肤K14原位杂交染色 (ISH×400)
Fig 4 ISH for K14 in late human fetus skin (ISH×400)
3 讨论
文献认为K14与角蛋白5(Keratin 5，K5)组成一组角蛋白对[2]，所有的复层上皮和假复层上皮的角朊细胞都表达这组角蛋白对，因此称它们为角朊细胞标记物。在正常成人表皮内，K5和K14的转录主要在基底层，而基底上层基本没有，其蛋白的表达主要位于基底层并随角朊细胞分化成熟而明显的下降，但少数基底上层细胞可以持续表达[3]。近年研究认为K14是基底层KC的基本成分,对维持KC形态,防止细胞溶解起关键作用。临床表皮溶解大泡症即是K14基因突变导致蛋白表达减少所至[4，5]。用基因敲除或转基因致使K14基因缺失的小鼠也会造成相似的皮肤水疱病变，其原因是基底层细胞缺乏K14蛋白，不能耐受机械性的压力或张力而碎裂崩解[6]。
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本实验首次观察到胎儿表皮在12周已表达K14蛋白及mRNA，表达部位是基底层及基底上层细胞。胚胎中期K14的表达量明显增高，表达部位为基底层及基底上层2～3层细胞。胚胎晚期K14阳性细胞局限于基底层细胞及汗腺、毛囊处的角朊细胞，基底上层细胞未见表达。K14在人胚胎中期表皮基底层表达量最高，这与许多物质在胚胎中期表达峰值相一致[7]。
本研究证实早、中期人胚胎表皮基底层及基底上层角朊细胞均转录和翻译K14 mRNA及蛋白，而晚期只局限于表皮基底层。人胚胎早、中期表皮未完全发育成熟，基底层及基底上层KC均有很强的增殖、分化能力，K14的持续表达对维持KC形态,防止细胞溶解起重要作用。晚期随着胚胎表皮KC的分化成熟，基底上层细胞开始大量表达其他角蛋白(如K1、K10等)成分，K14表达显著降低。
K14持续存在于表皮基底层细胞内，与此层细胞不断分裂、迁移特性及所处张力环境有密切关系。研究表明基底层细胞内由K14形成的角蛋白纤维网架极富弹性，既有一定的抗张强度，又便于细胞分裂和细胞运动。基底上层细胞内由K10形成的纤维网架，只做为机械屏障则有很强的硬度而没有很大弹性[8]。因此，不同部位的上皮细胞适应不同的环境需要不同的角蛋白。
, 百拇医药
作者简介：宋 川(1969-)，男，四川省阆中市人，硕士，助教，主要从事上皮分化方面的研究。电话：(023)68752259
参考文献：
[1] 蔡文琴，王伯
.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M].成都：四川科学技术出版社，1994.74-82.
[2] Michael O W，Schermer A，Lynch M，et al.Differentiation-Specific expression of keratin pairs[J]. Am J Pathol，1990,134(3):571-579.
[3] Fisher C，Angus B，Rees J. In situ hybridization using digoxigenin-labelled probes in human skin[J]. Br J Dermatol，1991,125(6):516-520.
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[4] Troy T C，Turksen K. In vitro characteristics of early epidermal progenitors isolated from keratin 14(k14)-deficient mice:insights into the role of keratin 17 in mouse keratinocytes[J]. J Cell Phy-siol.1999,180(3):409-421.
[5] Irvine A D，Mckenna K E，Bingham A， et al. A novel mutation in the helix termination peptide of keratin 5 causing epidermolysis bullosa simplex Dowling-Meara[J]. J Invest Dermatal，1997，109(6):815-816.
[6] Hutton E, Paladini R D, Yu Q C，et al. Functional differences between keratins of stratified and simple epithelia[J]. J Cell Biol，1998，143(2):487-499.
[7] 杨 恬,蔡文琴.人胚胎期肠道肽能神经发育的定量研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1993,2(1):58-61.
[8] Purkis P E, Steel J B, Mackenzie I C, et al.Antiboty markers of basal cells in complex epithelia[J]. J Cell Sci，1990，97(Pt1):39-50.
收稿日期：2000-03-07；修回日期：2000-07-26, 百拇医药
单位：第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室，重庆 400038
关键词：角蛋白14；人胚胎；角朊细胞
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提 要： 目的 了解角蛋白14(K14)在人胎儿表皮发育中的变化及意义。方法 早、中、晚期胎儿皮肤做冰冻切片，进行K14的免疫细胞化学染色(Immunocytochemistry，ICC)和原位杂交染色(in situ hybridization，ISH)，通过图像分析和统计学处理分析K14的变化及规律。结果 人胚胎12周表皮已表达K14，中期表达量最高，晚期也有较高表达，但主要局限于表皮基底层细胞。结论 胎儿表皮基底层角朊细胞(KC)表达K14，对维持KC形态,防止细胞溶解起重要作用。
中图法分类号： R329.1；R341.26 文献识别码： A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-5404(2000)12-1159-03
Expression of K14 in development of human fetal epidermis
SONG Chuan, YANG Tian, ZENG Yi-jun
(Department of Cell Biology,Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract： Objective To study the expression of K14 during the development of human fetal epidermis. Methods Human skin was taken from the early, middle and late human fetus respectively. K14 was determined with immunocytochemical and in situ hybridization techniques. Results were dealt with image analysis and the mophlogical and biochemical date were analyzed statistically. Results K14 were found in the early, middle and late human fetal epidermis. But highest level was found in the middle gestion. K14 was also found in higher level in the late gestation but mainly localized in the basal layer. Conclusion K14 is expressed by human fetal epidermal basal cell. It plays a pivotal role in the maintenance of epidermal cell shape and protecting the cell from lysing.
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Key words: keratin 14; human fetus; keratinocyte
角蛋白属于直径10 nm左右的中间纤维超家族，主要存在于上皮细胞胞浆内，是构成细胞骨架的重要成分。按照分子量大小和等电点不同可将角蛋白分成许多组分，其中分子量为50×103的角蛋白14(Keratin 14,K14)是近年研究的热点。它分布在表皮的基底层细胞内，对维持细胞形态及完整性有重要作用。胚胎期是表皮发生、形成的重要时期，此时K14的变化和它对表皮形成的影响成为本研究的目的。
1 材料和方法
1.1 标本分组及处理
9例经人工流产术终止妊娠的胎儿背部皮肤，根据胚胎龄
分为：早期(约12周)4例，中期(约24周)2例，晚期(约36周)3例。标本经4%多聚甲醛固定。低温恒冷箱切片机切12 μm冰冻切片。
, http://www.100md.com
1.2 免疫细胞化学染色[1]
标本切片先经鼠抗人K14单抗(广州中山公司，1∶100稀释)37℃中孵育2h，后于ABC试剂盒中(武汉博士德公司)A液、B液中37℃各孵育1h，DAB室温显色5min。以PBS液代替K14单抗作为阴性对照，以婴儿和成人(25岁)包皮标本同上染色作为阳性对照。
1.3 原位杂交染色
将重组有K14 cDNA的pGEM-3Z质粒(American Type Culture Collection)转化到JM109空白菌内，扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，分别加入HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶使之线性化，用Dig RNA标记试剂盒，分别标记成正义和反义探针，用贴片法进行原位杂交。分别以正义探针和空白杂交液替代K14 cDNA探针作为阴性对照，以婴儿和成人皮肤标本同上杂交染色作为阳性对照，质粒抽提试剂盒、限制性内切酶及Dig RNA标记试剂盒购于德国宝灵曼公司。
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1.4 图像处理
Tiger图像分析软件(重庆大学)，测定表皮层平均积分光密度(AOD)值。
1.5 统计学处理
微软EXCEL 97 student's t检验。
2 结果
2.1 胚胎早期
表皮可见K14蛋白及mRNA阳性角朊细胞(Keratinocyte,KC)。ICC染色结果见图1，阳性细胞主要位于表皮基底层，基底层上层也有分布，阳性颗粒位于胞浆，阳性强度(+)；AOD为0.291±0.100。ISH染色结果见图2，阳性细胞有1～2层，位于基底层及基底上层，阳性颗粒位于胞浆内，阳性强度(+)；真皮其它细胞未见阳性染色；AOD为0.575±0.247。
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2.2 胚胎中期
ICC染色结果见图3，阳性细胞有2～3层，阳性细胞主要分布于基底层及基底上层，阳性颗粒大小均匀，位于胞浆内，染色强度(
)；AOD为0.975±0.035。ISH染色显示阳性细胞层数有2～3层，主要分布于基底层及基上层，毛囊、汗腺外层上皮也有阳性着色，阳性颗粒大小均匀，位于细胞内，染色强度()；AOD为1.132±0.685。2.3 胚胎晚期
ICC染色显示阳性细胞主要局限于表皮基底层，阳性颗粒大小一致，位于胞浆内，染色强度(
)；AOD为1.041±0.500。ISH染色结果见图4，表皮基底层有阳性细胞，阳性颗粒位于胞浆内，染色强度()；AOD为1.198±0.739。, http://www.100md.com
图1 早期胎儿皮肤K14免疫细胞化学染色 (ABC×200)
Fig 1 ICC for K14 in early human fetus skin (ABC×200)
图2 早期胎儿皮肤K14原位杂交染色 (ISH×200)
Fig 2 ISH for K14 in early human fetus skin (ISH×200)
图3 中期胎儿皮肤K14免疫细胞化学染色 (ABC×200)
Fig 3 ICC for K14 in middle human fetus skin (ABC×200)
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图4 晚期胎儿皮肤K14原位杂交染色 (ISH×400)
Fig 4 ISH for K14 in late human fetus skin (ISH×400)
3 讨论
文献认为K14与角蛋白5(Keratin 5，K5)组成一组角蛋白对[2]，所有的复层上皮和假复层上皮的角朊细胞都表达这组角蛋白对，因此称它们为角朊细胞标记物。在正常成人表皮内，K5和K14的转录主要在基底层，而基底上层基本没有，其蛋白的表达主要位于基底层并随角朊细胞分化成熟而明显的下降，但少数基底上层细胞可以持续表达[3]。近年研究认为K14是基底层KC的基本成分,对维持KC形态,防止细胞溶解起关键作用。临床表皮溶解大泡症即是K14基因突变导致蛋白表达减少所至[4，5]。用基因敲除或转基因致使K14基因缺失的小鼠也会造成相似的皮肤水疱病变，其原因是基底层细胞缺乏K14蛋白，不能耐受机械性的压力或张力而碎裂崩解[6]。
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本实验首次观察到胎儿表皮在12周已表达K14蛋白及mRNA，表达部位是基底层及基底上层细胞。胚胎中期K14的表达量明显增高，表达部位为基底层及基底上层2～3层细胞。胚胎晚期K14阳性细胞局限于基底层细胞及汗腺、毛囊处的角朊细胞，基底上层细胞未见表达。K14在人胚胎中期表皮基底层表达量最高，这与许多物质在胚胎中期表达峰值相一致[7]。
本研究证实早、中期人胚胎表皮基底层及基底上层角朊细胞均转录和翻译K14 mRNA及蛋白，而晚期只局限于表皮基底层。人胚胎早、中期表皮未完全发育成熟，基底层及基底上层KC均有很强的增殖、分化能力，K14的持续表达对维持KC形态,防止细胞溶解起重要作用。晚期随着胚胎表皮KC的分化成熟，基底上层细胞开始大量表达其他角蛋白(如K1、K10等)成分，K14表达显著降低。
K14持续存在于表皮基底层细胞内，与此层细胞不断分裂、迁移特性及所处张力环境有密切关系。研究表明基底层细胞内由K14形成的角蛋白纤维网架极富弹性，既有一定的抗张强度，又便于细胞分裂和细胞运动。基底上层细胞内由K10形成的纤维网架，只做为机械屏障则有很强的硬度而没有很大弹性[8]。因此，不同部位的上皮细胞适应不同的环境需要不同的角蛋白。
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作者简介：宋 川(1969-)，男，四川省阆中市人，硕士，助教，主要从事上皮分化方面的研究。电话：(023)68752259
参考文献：
[1] 蔡文琴，王伯
.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M].成都：四川科学技术出版社，1994.74-82.[2] Michael O W，Schermer A，Lynch M，et al.Differentiation-Specific expression of keratin pairs[J]. Am J Pathol，1990,134(3):571-579.
[3] Fisher C，Angus B，Rees J. In situ hybridization using digoxigenin-labelled probes in human skin[J]. Br J Dermatol，1991,125(6):516-520.
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[4] Troy T C，Turksen K. In vitro characteristics of early epidermal progenitors isolated from keratin 14(k14)-deficient mice:insights into the role of keratin 17 in mouse keratinocytes[J]. J Cell Phy-siol.1999,180(3):409-421.
[5] Irvine A D，Mckenna K E，Bingham A， et al. A novel mutation in the helix termination peptide of keratin 5 causing epidermolysis bullosa simplex Dowling-Meara[J]. J Invest Dermatal，1997，109(6):815-816.
[6] Hutton E, Paladini R D, Yu Q C，et al. Functional differences between keratins of stratified and simple epithelia[J]. J Cell Biol，1998，143(2):487-499.
[7] 杨 恬,蔡文琴.人胚胎期肠道肽能神经发育的定量研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1993,2(1):58-61.
[8] Purkis P E, Steel J B, Mackenzie I C, et al.Antiboty markers of basal cells in complex epithelia[J]. J Cell Sci，1990，97(Pt1):39-50.
收稿日期：2000-03-07；修回日期：2000-07-26, 百拇医药