非肝硬化性胆道梗阻对大鼠肝部分切除术后肝细胞再生的影响
作者：徐明清 韩本立 薛兰 龚建平 董家鸿 王曙光
单位：徐明清 韩本立 龚建平 董家鸿 王曙光(第三军医大学附属西南医院肝胆外科中心、西南肝胆外科医院，重庆 400038)；薛兰(解放军208医院，长春 130062)
关键词：胆道梗阻；肝再生；肝部分切除；TNFα
第三军医大学学报001203
提 要： 目的 观察非肝硬化性胆道梗阻(BDO)对大鼠70%肝部分切除(PH)术后肝细胞再生的影响。方法 Wistar大鼠分为正常肝部分切除组(N-PH)、胆道梗阻胆流再通(RBF)肝部分切除组(BDO-RBF-PH)及胆道梗阻胆流再通组(BDO-RBF)。BDO-RBF-PH组大鼠胆总管梗阻1周后行胆流再通及70%PH。免疫组化法检测再生肝细胞增殖细胞核抗原(PCNA)及溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)标记， Western-Blot法检测肝细胞PCNA蛋白表达，RT-PCR与ELISA法检测肝内TNFα mRNA与TNFα表达。结果 N-PH组肝细胞PCNA表达及BrdU阳性标记指数于70%PH术后24 h达到高峰，而BDO-RBF-PH组肝细胞DNA合成高峰延后至术后48 h，其PCNA高峰表达量及BrdU高峰标记指数均低于N-PH组；BDO-RBF-PH组大鼠70%PH后0～72 h肝内TNFα mRNA及TNFα表达量显著高于N-PH组。结论 非肝硬化性胆道梗阻胆汁淤积大鼠70%PH术后肝细胞再生受抑制，肝内长时间异常高表达的TNFα可能是肝细胞再生受抑制的重要原因。
, 百拇医药
中图法分类号： R575;R657.3 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)12-1129-03
Effect of noncirrhotic biliary obstruction on the liver regeneration after partial hepatectomy in rats
XU Ming-qing, HAN Ben-li,XUE Lan，GONG Jian-ping,DONG Jia-hong, WANG Shu-guang (Department of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract： Objective To investigate the effect of noncirrhotic biliary duct obstruction (BDO) on the liver regeneration after 70% partial hepatectomy (PH) in rats. Methods The rats were divided into normal PH group (N-PH), BDO-RBF group in which restoration of bile flow (RBF) was obtained after 1 week's common bile duct obstruction, and BDO-RBF-PH group in which 70% PH was performed after the same procedures as BDO-RBF group. The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and labeling of bromodeoxyuridine (BrdU) were determined with immunohistochemical methods in the regenerating hepatocytes. The expressions of PCNA protein, TNFα mRNA and TNFα were measured with Western-Blot, RT-PCR and ELISA respectively. Results The expression of PCNA and labeling of BrdU reached the peak at 24 h after PH in N-PH group, and at 48 h in BDO-RBF-PH group, and the peak levels of PCNA and BrdU of hepatocytes in BDO-RBF-PH rats were decreased significantly compared with those of N-PH group. The expression levels of TNFα mRNA and TNFα were significantly higher in BDO-RBF-PH rats than in N-PH group from 0～72 h after 70% PH. Conclusion The hepatocyte proliferation is inhibited in the rats with BDO and 70% PH, and the increased expression of TNFα may be one of the causes of the inhibited liver regeneration.
, 百拇医药
Key words: biliary duct obstruction; liver regeneration; partial hepatectomy; TNFα
梗阻性黄疸肝脏行肝部分切除(Partial hepatectomy,PH)在临床上已是常见手术，而肝部分切除术后肝衰的防止亦是临床医生所必须考虑的。非肝硬化性胆道梗阻对肝部分切除术后肝细胞再生能力的影响目前并不十分清楚，本实验应用胆总管梗阻肝部分切除模型，检测了胆道梗阻1周大鼠70%PH术后肝细胞PCNA表达和BrdU标记、以及肝内TNFα mRNA和TNFα的表达变化，以探讨非肝硬化性胆道梗阻对肝部分切除术后肝细胞再生的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及模型制作 健康雄性大鼠90只，随机分为正常大鼠70%肝部分切除(N-PH)组，胆道梗阻(Biliary duct obstruction,BDO)胆流再通(Restoration of biliary flow ,RBF)70%肝部分切除(BDO-RBF-PH)组和胆道梗阻胆流再通(BDO-RBF)组。胆总管双重结扎并切断制成BDO模型。BDO 1周后胆总管与十二指肠间架设一直径约2 mm的硅胶管制作胆流再通模型[1]。70%肝叶切除采用Higgins创建的方法，即切除大鼠左肝叶和中肝叶，70%PH术后腹腔内注射5%葡萄糖液5 ml以防止低血糖。观察时相为术后0、6、12、24、48、72 h，每个时相点5只动物。取材前1 h腹腔内注射溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU) 5 mg/kg[2]，以使BrdU掺合入肝细胞DNA合成。
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1.2 免疫组化法检测肝细胞PCNA及BrdU标记
参照武汉博士得生物工程有限公司提供的试剂盒说明书(S-ABC法)进行操作。结果判定[3]：随机观察5个高倍镜下(×400)视野，每视野约有肝细胞1 000个，统计核黄染肝细胞数，计算阳性细胞指数，阳性细胞指数=阳性核黄染细胞数/1 000×100%。
1.3 Western-Blot法检测肝细胞PCNA蛋白表达
采用Callery等[4]的方法分离肝细胞。参照F.奥斯伯等[5]介绍的Western-Blot法检测肝细胞PCNA蛋白表达。即肝细胞总蛋白提取后考马斯亮蓝法浓度测定(根据样品浓度调整上样蛋白量为每孔100 μg)、蛋白质聚丙烯酰胺电泳、蛋白质转膜、蛋白杂交、DAB显色。蛋白含量以相对密度ROD×面积表示，并以其占N-PH组、BDO-RBF-PH组、BDO-RBF组所有PCNA蛋白含量的百分率(%)为统计资料。
, 百拇医药
1.4 RT-PCR法检测肝内TNFα mRNA表达
一步法肝组织总RNA提取，二步法RT-PCR扩增。参照文献[6]设计引物序列，由上海生工合成，扩增产物大小为：TNFα(目的基因)692bp，β-actin(内参照基因)281bp。引物退火温度为60℃，扩增30个循环。扩增产物在2%琼脂糖上电泳。以目的基因mRNA扫描密度值/参照基因mRNA扫描密度值的百分数(%)作为目的基因mRNA的相对表达量。
1.5 ELISA法检测肝组织内TNFα的表达
参照TNFαELISAKit(北京，邦定泰克)说明书进行操作。
1.6 统计学处理
数据用
±s表示，采用t检验。
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2 结果
2.1 肝细胞PCNA表达
免疫组化及Western-Blot法检测显示N-PH组大鼠70%PH后24h为肝细胞PCNA高峰表达时间，肝细胞PCNA阳性标记指数(%)为59.62±7.36，PCNA蛋白表达量(%)为22.07±1.86。而BDO-RBF-PH组肝细胞PCNA表达高峰延后至70%PH后48h，肝细胞PCNA阳性标记指数及PCNA蛋白表达量(%)分别为32.97±4.61及12.37±1.02，均显著低于N-PH组峰值(t=6.869,P<0.001；t=10.221,P<0.001)。BDO-RBF及BDO-RBF-PH二组肝细胞在术后0h的PCNA表达量相似，但前者在胆流再通术后逐渐减少，说明两组肝细胞PCNA表达差异是由肝部分切除所致。
2.2 肝细胞BrdU免疫组化标记
N-PH组大鼠70%PH后24h肝细胞BrdU免疫组化标记达到高峰值，肝细胞BrdU阳性标记指数(%)为63.57±9.56，BDO-RBF-PH组肝细胞BrdU高峰标记时间延后至70%PH后48h，高峰标记指数(%)为34.78±6.37，低于N-PH组峰值(t=5.603,P<0.001)。BDO-RBF及BDO-RBF-PH二组肝细胞在术后0h的BrdU标记指数相似，但前者的标记指数在胆肠再通术后逐渐减少，说明两组肝细胞BrdU标记差异是由肝部分切除所致。
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2.3 肝组织TNFαmRNA及TNFα的表达
N-PH组大鼠70%PH后6h为肝内TNFαmRNA及TNFα高峰表达时间，以后降低至基础水平以下，至术后72h才回升到基础水平。而BDO-RBF-PH组大鼠70%PH后0～72hTNFαmRNA与TNFα表达量显著高于N-PH组，其中TNFαmRNA的表达量为N-PH组的2～3倍(P<0.001)，72h后方有明显下降(肝内TNFαmRNA见图1，TNFα值见表1)。BDO-RBF组肝组织0hTNFαmRNA与TNFα表达量与BDO-RBF-PH组相似，但术后呈持续下降趋势，说明两组的TNFα表达差异是由70%PH所致。
图1 70%PH后肝内TNFα mRNA表达(RT-PCR)
Fig 1 RT-PCR for expression of TNFα mRNA
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in liver after 70%PH
M：Marker；Lane 1,3,5: Expression of TNFα mRNA in liver 0, 6, 12 h after 70%PH in N-PH group respectively； Lane 2,4,6: Expression of TNFα mRNA in liver 0, 6, 12 h after 70%PH in BDO-RBF-PH group respectively
表1 ELISA法检测70%PH后肝组织内TNFα含量(ωB/ng.g-1，±s)
Tab 1 Level of TNFα in liver after 70%PH by ELISA (ωB/ng.g-1，±s) Group
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0 h(n=5)
6 h(n=5)
12 h(n=5)
24 h(n=5)
48 h(n=5)
72 h(n=5)
N-PH
0.46±0.10
1.63±0.24
0.30±0.14
0.33±0.14
0.42±0.14
, 百拇医药
0.47±0.13
BDO-RBF-PH
2.95±0.70*
4.47±0.95*
3.14±0.55*
1.79±0.38*
1.08±0.24*
0.67±0.21
BDO-RBF
2.91±0.63
, 百拇医药
1.73±0.49
1.29±0.43
0.99±0.36
0.68±0.27
0.50±0.16
*:P<0.001 vs N-PH
3 讨论
临床上常对肝功能受损的非肝硬化性梗阻性黄疸肝脏(如肝门部胆管癌、肝内胆管结石等伴短时间胆道梗阻)行部分切除，而肝功能损害又可能影响肝部分切除术后肝细胞再生，从而限制肝切除量而影响手术效果，这就需要探讨病肝部分切除术后肝细胞再生机制以防治可能发生的肝衰。研究表明正常大鼠70%PH后24～48 h为肝细胞DNA合成高峰期，各种病因所引发的肝硬化抑制70%PH后的肝细胞再生。非肝硬化性胆道梗阻对70%PH后肝细胞再生有何影响目前并不十分清楚，我们通过检测胆道梗阻1周大鼠(此时大鼠肝功损害明显但肝细胞无片状坏死，且无肝硬变形成)70%PH后肝细胞PCNA蛋白表达与BrdU标记以及肝内TNFα表达变化，以探讨非肝硬化性胆道梗阻肝脏部分切除术后肝细胞的再生机制。
, 百拇医药
PCNA是DNA聚合酶δ的一种辅助性蛋白,它的表达具有细胞周期依赖性，在G1后期开始表达，于S期表达最明显[3]，它与其它的细胞增殖指标有很好的相符性。BrdU是一种胸腺嘧碇脱氧核苷类似物，在DNA合成过程中掺合入DNA，是检测肝细胞DNA合成的敏感指标[3]，免疫组化法应用抗BrdU抗体可检测到BrdU的掺入。我们应用免疫组化与Western-Blot法检测了梗阻性黄疸1周大鼠70%PH后肝细胞PCNA蛋白表达与BrdU标记变化，发现肝细胞PCNA蛋白表达与BrdU标记结果相似，N-PH组大鼠70%PH术后24 h肝细胞PCNA蛋白表达与 BrdU标记均达到高峰,即DNA合成达到高峰，而BDO-RBF-PH组大鼠70%PH术后肝细胞再生延缓，肝细胞PCNA蛋白表达与 BrdU标记高峰均延后至术后48 h，其高峰表达量亦显著低于N-PH组大鼠，说明胆道梗阻1周大鼠70%PH术后肝细胞再生受抑制。
既往研究表明TNFα是肝细胞再生的重要调节因子，适量表达的TNFα在肝部分切除术后的肝再生过程中启动肝再生[7]，TNFα在以下的肝再生启动信号传导途径中是必不可少的[8]：①TNF-α→肝细胞膜TNFαⅠ型受体→肝细胞AP-1、NFkB激活→肝细胞增殖。②TNFα→Kupffer细胞→IL-6→肝细胞AP-1、NFkB激活→肝细胞增殖。既往研究还发现TNFα对肝细胞具有双重作用，由于表达量的不同，TNFα既能促进肝细胞再生，又能通过多种途径导致肝细胞损害，表现为肝细胞坏死与凋亡，高剂量的TNFα还可引起类似内毒素诱发的多器官损伤症状。由于胆道梗阻常并发胆道感染，我们因此检测了70%PH后肝内TNFα的表达变化，结果发现梗阻性黄疸1周大鼠70%PH术后72 h前肝内TNFα mRNA及TNFα表达量均数倍于N-PH组，明显高于正常大鼠，TNFα如此大量而持久的表达，产生的功效可能有别于N-PH组。从梗阻性黄疸大鼠70%PH术后肝细胞再生受抑制来看,持续异常高表达的TNFα可能不是启动肝再生而是导致肝细胞损害，从而延缓肝细胞再生。
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作者简介：徐明清(1968-)，男，四川省乐山市人，博士，主治医师，主要从事肝再生方面的研究。电话：13022303642
参考文献：
[1] 杨翔，吴天鸣，石民生，等.胆道梗阻再通前后病理转归的研究[J].中华实验外科杂志,1996,13(1)：43-45.
[2] Boulton R A, Allison M R, Golding M, et al. Augmentation of the early phase of liver regeneration after 70%PH in rats following selective Kupffer cell depletion[J]. J Hepatology，1998,29(2):271-280.
[3] Assy N, Minuk G Y. Liver regeneration: methods for monitoring and their applications[J]. J Hepatol，1997,26(4):945-952.
, 百拇医药
[4] Callery M P,Kamei T, Flye M W. Kuffer cell tumor necrosis factor-α production is suppressed during liver regeneration[J]. J Surg Res，1991,50(2):515-519.
[5] F.奥斯伯 著，颜子颖 译.精编分子生物学实验指南[M].北京：科学出版社，1998.366.
[6] Ikejima K, Enomoto N, Iimuro Y, et al. Estrogen increase sensitivity of hepatic Kupffer cells to endotoxin[J]. Am J Physiol,1998,274(4) (Gastrointest. Liver Physiol.37):G669-G676.
[7] Michalopoulos G K, DeFrances M C. Liver regeneration[J]. Science，1997, 276(5 309): 60-66.
[8] Taub R, Greenbaum L, Peng Y. Transcriptional regulatory signals define cytokine-dependent and-independent pathways in liver regeneration[J]. Semin Liver Dis，1999,19(2):117-127.
收稿日期：2000-04-05；修回日期：2000-06-04, http://www.100md.com
单位：徐明清 韩本立 龚建平 董家鸿 王曙光(第三军医大学附属西南医院肝胆外科中心、西南肝胆外科医院，重庆 400038)；薛兰(解放军208医院，长春 130062)
关键词：胆道梗阻；肝再生；肝部分切除；TNFα
第三军医大学学报001203
提 要： 目的 观察非肝硬化性胆道梗阻(BDO)对大鼠70%肝部分切除(PH)术后肝细胞再生的影响。方法 Wistar大鼠分为正常肝部分切除组(N-PH)、胆道梗阻胆流再通(RBF)肝部分切除组(BDO-RBF-PH)及胆道梗阻胆流再通组(BDO-RBF)。BDO-RBF-PH组大鼠胆总管梗阻1周后行胆流再通及70%PH。免疫组化法检测再生肝细胞增殖细胞核抗原(PCNA)及溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)标记， Western-Blot法检测肝细胞PCNA蛋白表达，RT-PCR与ELISA法检测肝内TNFα mRNA与TNFα表达。结果 N-PH组肝细胞PCNA表达及BrdU阳性标记指数于70%PH术后24 h达到高峰，而BDO-RBF-PH组肝细胞DNA合成高峰延后至术后48 h，其PCNA高峰表达量及BrdU高峰标记指数均低于N-PH组；BDO-RBF-PH组大鼠70%PH后0～72 h肝内TNFα mRNA及TNFα表达量显著高于N-PH组。结论 非肝硬化性胆道梗阻胆汁淤积大鼠70%PH术后肝细胞再生受抑制，肝内长时间异常高表达的TNFα可能是肝细胞再生受抑制的重要原因。
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中图法分类号： R575;R657.3 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)12-1129-03
Effect of noncirrhotic biliary obstruction on the liver regeneration after partial hepatectomy in rats
XU Ming-qing, HAN Ben-li,XUE Lan，GONG Jian-ping,DONG Jia-hong, WANG Shu-guang (Department of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract： Objective To investigate the effect of noncirrhotic biliary duct obstruction (BDO) on the liver regeneration after 70% partial hepatectomy (PH) in rats. Methods The rats were divided into normal PH group (N-PH), BDO-RBF group in which restoration of bile flow (RBF) was obtained after 1 week's common bile duct obstruction, and BDO-RBF-PH group in which 70% PH was performed after the same procedures as BDO-RBF group. The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and labeling of bromodeoxyuridine (BrdU) were determined with immunohistochemical methods in the regenerating hepatocytes. The expressions of PCNA protein, TNFα mRNA and TNFα were measured with Western-Blot, RT-PCR and ELISA respectively. Results The expression of PCNA and labeling of BrdU reached the peak at 24 h after PH in N-PH group, and at 48 h in BDO-RBF-PH group, and the peak levels of PCNA and BrdU of hepatocytes in BDO-RBF-PH rats were decreased significantly compared with those of N-PH group. The expression levels of TNFα mRNA and TNFα were significantly higher in BDO-RBF-PH rats than in N-PH group from 0～72 h after 70% PH. Conclusion The hepatocyte proliferation is inhibited in the rats with BDO and 70% PH, and the increased expression of TNFα may be one of the causes of the inhibited liver regeneration.
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Key words: biliary duct obstruction; liver regeneration; partial hepatectomy; TNFα
梗阻性黄疸肝脏行肝部分切除(Partial hepatectomy,PH)在临床上已是常见手术，而肝部分切除术后肝衰的防止亦是临床医生所必须考虑的。非肝硬化性胆道梗阻对肝部分切除术后肝细胞再生能力的影响目前并不十分清楚，本实验应用胆总管梗阻肝部分切除模型，检测了胆道梗阻1周大鼠70%PH术后肝细胞PCNA表达和BrdU标记、以及肝内TNFα mRNA和TNFα的表达变化，以探讨非肝硬化性胆道梗阻对肝部分切除术后肝细胞再生的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及模型制作 健康雄性大鼠90只，随机分为正常大鼠70%肝部分切除(N-PH)组，胆道梗阻(Biliary duct obstruction,BDO)胆流再通(Restoration of biliary flow ,RBF)70%肝部分切除(BDO-RBF-PH)组和胆道梗阻胆流再通(BDO-RBF)组。胆总管双重结扎并切断制成BDO模型。BDO 1周后胆总管与十二指肠间架设一直径约2 mm的硅胶管制作胆流再通模型[1]。70%肝叶切除采用Higgins创建的方法，即切除大鼠左肝叶和中肝叶，70%PH术后腹腔内注射5%葡萄糖液5 ml以防止低血糖。观察时相为术后0、6、12、24、48、72 h，每个时相点5只动物。取材前1 h腹腔内注射溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU) 5 mg/kg[2]，以使BrdU掺合入肝细胞DNA合成。
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1.2 免疫组化法检测肝细胞PCNA及BrdU标记
参照武汉博士得生物工程有限公司提供的试剂盒说明书(S-ABC法)进行操作。结果判定[3]：随机观察5个高倍镜下(×400)视野，每视野约有肝细胞1 000个，统计核黄染肝细胞数，计算阳性细胞指数，阳性细胞指数=阳性核黄染细胞数/1 000×100%。
1.3 Western-Blot法检测肝细胞PCNA蛋白表达
采用Callery等[4]的方法分离肝细胞。参照F.奥斯伯等[5]介绍的Western-Blot法检测肝细胞PCNA蛋白表达。即肝细胞总蛋白提取后考马斯亮蓝法浓度测定(根据样品浓度调整上样蛋白量为每孔100 μg)、蛋白质聚丙烯酰胺电泳、蛋白质转膜、蛋白杂交、DAB显色。蛋白含量以相对密度ROD×面积表示，并以其占N-PH组、BDO-RBF-PH组、BDO-RBF组所有PCNA蛋白含量的百分率(%)为统计资料。
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1.4 RT-PCR法检测肝内TNFα mRNA表达
一步法肝组织总RNA提取，二步法RT-PCR扩增。参照文献[6]设计引物序列，由上海生工合成，扩增产物大小为：TNFα(目的基因)692bp，β-actin(内参照基因)281bp。引物退火温度为60℃，扩增30个循环。扩增产物在2%琼脂糖上电泳。以目的基因mRNA扫描密度值/参照基因mRNA扫描密度值的百分数(%)作为目的基因mRNA的相对表达量。
1.5 ELISA法检测肝组织内TNFα的表达
参照TNFαELISAKit(北京，邦定泰克)说明书进行操作。
1.6 统计学处理
数据用
±s表示，采用t检验。, 百拇医药
2 结果
2.1 肝细胞PCNA表达
免疫组化及Western-Blot法检测显示N-PH组大鼠70%PH后24h为肝细胞PCNA高峰表达时间，肝细胞PCNA阳性标记指数(%)为59.62±7.36，PCNA蛋白表达量(%)为22.07±1.86。而BDO-RBF-PH组肝细胞PCNA表达高峰延后至70%PH后48h，肝细胞PCNA阳性标记指数及PCNA蛋白表达量(%)分别为32.97±4.61及12.37±1.02，均显著低于N-PH组峰值(t=6.869,P<0.001；t=10.221,P<0.001)。BDO-RBF及BDO-RBF-PH二组肝细胞在术后0h的PCNA表达量相似，但前者在胆流再通术后逐渐减少，说明两组肝细胞PCNA表达差异是由肝部分切除所致。
2.2 肝细胞BrdU免疫组化标记
N-PH组大鼠70%PH后24h肝细胞BrdU免疫组化标记达到高峰值，肝细胞BrdU阳性标记指数(%)为63.57±9.56，BDO-RBF-PH组肝细胞BrdU高峰标记时间延后至70%PH后48h，高峰标记指数(%)为34.78±6.37，低于N-PH组峰值(t=5.603,P<0.001)。BDO-RBF及BDO-RBF-PH二组肝细胞在术后0h的BrdU标记指数相似，但前者的标记指数在胆肠再通术后逐渐减少，说明两组肝细胞BrdU标记差异是由肝部分切除所致。
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2.3 肝组织TNFαmRNA及TNFα的表达
N-PH组大鼠70%PH后6h为肝内TNFαmRNA及TNFα高峰表达时间，以后降低至基础水平以下，至术后72h才回升到基础水平。而BDO-RBF-PH组大鼠70%PH后0～72hTNFαmRNA与TNFα表达量显著高于N-PH组，其中TNFαmRNA的表达量为N-PH组的2～3倍(P<0.001)，72h后方有明显下降(肝内TNFαmRNA见图1，TNFα值见表1)。BDO-RBF组肝组织0hTNFαmRNA与TNFα表达量与BDO-RBF-PH组相似，但术后呈持续下降趋势，说明两组的TNFα表达差异是由70%PH所致。
图1 70%PH后肝内TNFα mRNA表达(RT-PCR)
Fig 1 RT-PCR for expression of TNFα mRNA
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in liver after 70%PH
M：Marker；Lane 1,3,5: Expression of TNFα mRNA in liver 0, 6, 12 h after 70%PH in N-PH group respectively； Lane 2,4,6: Expression of TNFα mRNA in liver 0, 6, 12 h after 70%PH in BDO-RBF-PH group respectively
表1 ELISA法检测70%PH后肝组织内TNFα含量(ωB/ng.g-1，
±s)Tab 1 Level of TNFα in liver after 70%PH by ELISA (ωB/ng.g-1，
±s) Group, http://www.100md.com
0 h(n=5)
6 h(n=5)
12 h(n=5)
24 h(n=5)
48 h(n=5)
72 h(n=5)
N-PH
0.46±0.10
1.63±0.24
0.30±0.14
0.33±0.14
0.42±0.14
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0.47±0.13
BDO-RBF-PH
2.95±0.70*
4.47±0.95*
3.14±0.55*
1.79±0.38*
1.08±0.24*
0.67±0.21
BDO-RBF
2.91±0.63
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1.73±0.49
1.29±0.43
0.99±0.36
0.68±0.27
0.50±0.16
*:P<0.001 vs N-PH
3 讨论
临床上常对肝功能受损的非肝硬化性梗阻性黄疸肝脏(如肝门部胆管癌、肝内胆管结石等伴短时间胆道梗阻)行部分切除，而肝功能损害又可能影响肝部分切除术后肝细胞再生，从而限制肝切除量而影响手术效果，这就需要探讨病肝部分切除术后肝细胞再生机制以防治可能发生的肝衰。研究表明正常大鼠70%PH后24～48 h为肝细胞DNA合成高峰期，各种病因所引发的肝硬化抑制70%PH后的肝细胞再生。非肝硬化性胆道梗阻对70%PH后肝细胞再生有何影响目前并不十分清楚，我们通过检测胆道梗阻1周大鼠(此时大鼠肝功损害明显但肝细胞无片状坏死，且无肝硬变形成)70%PH后肝细胞PCNA蛋白表达与BrdU标记以及肝内TNFα表达变化，以探讨非肝硬化性胆道梗阻肝脏部分切除术后肝细胞的再生机制。
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PCNA是DNA聚合酶δ的一种辅助性蛋白,它的表达具有细胞周期依赖性，在G1后期开始表达，于S期表达最明显[3]，它与其它的细胞增殖指标有很好的相符性。BrdU是一种胸腺嘧碇脱氧核苷类似物，在DNA合成过程中掺合入DNA，是检测肝细胞DNA合成的敏感指标[3]，免疫组化法应用抗BrdU抗体可检测到BrdU的掺入。我们应用免疫组化与Western-Blot法检测了梗阻性黄疸1周大鼠70%PH后肝细胞PCNA蛋白表达与BrdU标记变化，发现肝细胞PCNA蛋白表达与BrdU标记结果相似，N-PH组大鼠70%PH术后24 h肝细胞PCNA蛋白表达与 BrdU标记均达到高峰,即DNA合成达到高峰，而BDO-RBF-PH组大鼠70%PH术后肝细胞再生延缓，肝细胞PCNA蛋白表达与 BrdU标记高峰均延后至术后48 h，其高峰表达量亦显著低于N-PH组大鼠，说明胆道梗阻1周大鼠70%PH术后肝细胞再生受抑制。
既往研究表明TNFα是肝细胞再生的重要调节因子，适量表达的TNFα在肝部分切除术后的肝再生过程中启动肝再生[7]，TNFα在以下的肝再生启动信号传导途径中是必不可少的[8]：①TNF-α→肝细胞膜TNFαⅠ型受体→肝细胞AP-1、NFkB激活→肝细胞增殖。②TNFα→Kupffer细胞→IL-6→肝细胞AP-1、NFkB激活→肝细胞增殖。既往研究还发现TNFα对肝细胞具有双重作用，由于表达量的不同，TNFα既能促进肝细胞再生，又能通过多种途径导致肝细胞损害，表现为肝细胞坏死与凋亡，高剂量的TNFα还可引起类似内毒素诱发的多器官损伤症状。由于胆道梗阻常并发胆道感染，我们因此检测了70%PH后肝内TNFα的表达变化，结果发现梗阻性黄疸1周大鼠70%PH术后72 h前肝内TNFα mRNA及TNFα表达量均数倍于N-PH组，明显高于正常大鼠，TNFα如此大量而持久的表达，产生的功效可能有别于N-PH组。从梗阻性黄疸大鼠70%PH术后肝细胞再生受抑制来看,持续异常高表达的TNFα可能不是启动肝再生而是导致肝细胞损害，从而延缓肝细胞再生。
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作者简介：徐明清(1968-)，男，四川省乐山市人，博士，主治医师，主要从事肝再生方面的研究。电话：13022303642
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收稿日期：2000-04-05；修回日期：2000-06-04, http://www.100md.com