切断面神经干后大鼠面神经元bcl-2、bax基因表达变化及意义
作者：杨军 方泽强 李慧增 张从纪
单位：第三军医大学附属西南医院口腔科，重庆 400038
关键词：bcl-2；bax；凋亡；面神经元；轴突切断；大鼠
第三军医大学学报001219
提 要： 目的 观察面神经干切断后面神经元bcl-2、bax基因表达与面神经元凋亡的关系。方法 采用大鼠面神经干切断模型，应用免疫组织化学方法观察面神经干切断后面神经元内bcl-2、bax基因表达变化和对面神经元凋亡的影响。结果 面神经干切断后可以导致bcl-2、bax基因表达的明显变化及面神经元的凋亡。结论 bcl-2、bax基因参与了面神经干切断诱导的面神经元凋亡过程的调控。
中图法分类号： R322.8;R394.3 文献标识码： A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-5404(2000)12-1183-03
Changes of expression of bcl-2 and bax gene in facial neurons of rats following facial nerve axotomy
YANG Jun, FANG Ze-qiang, LI Hui-zeng, ZHANG Cong-ji
(Department of Stomatology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract： Objective To investigate the relationship between the expressions of bcl-2, bax gene and apoptosis of facial neuron after facial nerve axotomy. Methods After the model of facial nerve axotomy was established in Wistar rats, the changes of bcl-2 and bax gene expressions in facial neurons and facial neuronal apoptosis were observed with immunohistochemical methods. Results Facial nerve axotomy resulted in the changes of bcl-2, bax gene expressions and facial neuronal apoptosis. Conclusion bcl-2 and bax gene might participate the process of apoptosis of the facial neuron induced by facial nerve axotomy.
, 百拇医药
Key words: bcl-2; bax; apoptosis; rat; facial neurons; axotomy
损伤周围神经可引起其源神经元胞体一系列形态学及生物化学变化，且周围神经损伤后的修复与其神经元存活状态紧密相关。近来研究表明bcl-2族基因与细胞凋亡的发生有密切关系[1]。本研究采用免疫组织化学方法，对切断面神经干后不同时相点的面神经元内bcl-2、bax基因表达及面神经元凋亡变化进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料 健康Wistar大白鼠60只，雌雄各半，体重为180～240 g,随机分为3、7、15、21、30、60 d时相组，每组10只。实验动物由第三军医大学实验动物中心提供。
主要试剂：兔抗大鼠bcl-2和bax抗体、生物素化羊抗兔IgG由武汉博士德生物工程公司提供。细胞凋亡测定试剂盒由德国宝灵曼公司提供。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1动物模型建立 1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)经腹腔麻醉后暴露左侧面神经，于茎乳孔下5mm处将其切断，并于远侧
神经干切除1cm以防止神经再生。止血，缝合切口。右侧面神经干未切断为对照侧。
1.2.2 取材与制片 各组动物均在麻醉下取材。经左心室穿刺升主动脉快速灌注37 ℃生理盐水150 ml及4 ℃4%多聚甲醛250 ml,固定后开颅取脑，取出脑组织再固定2 h，每只动物左右水平切面切取1块以小脑桥延沟为中心5 mm厚脑组织块，用4%多聚甲醛固定24 h，然后移入30%蔗糖溶液固定12 h。25 μm连续冰冻切片，切片浸泡于0.01 mol/L PBS备用。
1.2.3 bcl-2和bax基因表达检测 免疫组化ABC染色法。实验动物标本切片用3%H2O2室温孵育15 min,再用7.5%正常山羊血清封闭，室温孵育30 min。加入一抗(兔抗bcl-2-IgG或兔抗bax-IgG)37 ℃孵育60 min, 0.01 mol/L PBS冲洗。加入二抗(生物素化羊抗兔IgG)37 ℃孵育60 min，0.01 mol/L PBS冲洗。加入ABC复合物室温孵育15 min，0.01 mol/L PBS冲洗。 DAB显色。自来水冲洗，复染，封片。
, 百拇医药
1.2.4 面神经元凋亡观察 荧光标记的终末去氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labelling， TUNEL)。实验动物标本切片用0.1 mol/L Tris-HCl(3%BSA,20%正常牛血清) 室温孵育30 min, 0.15 mol/L PBS冲洗。加入试剂盒中的反应成份37 ℃孵育60 min，0.15 mol/L PBS冲洗。切片烘干，封片。用荧光显微镜观察。
1.3 统计学处理
采用重庆大学Tiger计算机图像分析仪分别计算每张切片左右侧面神经元内bcl-2、bax及凋亡神经元免疫荧光的光密度，结果以
±s表示，统计处理用方差分析和t检验。
2 结果
, 百拇医药
正常面神经核内可见神经元有散在分布的呈棕黄色的bcl-2、bax基因表达及有免疫荧光反应的凋亡神经元(TUNEL阳性细胞)。术后第3天，实验侧面神经核bcl-2、bax基因表达及TUNEL阳性细胞数较正常增加，第15天较正常明显增加，第21天 bcl-2、bax基因表达及TUNEL阳性细胞数增加达高峰。见表1、2及图1、2。
表1 大鼠面神经干离断后面神经核内bcl-2、bax免疫组化染色光密度(±s)
Tab 1 Optical density of bcl-2 and bax immunohistochemical staining in nucleus of facial nerve after axotomy(±s) Group
, 百拇医药
bcl-2
bax
3 d(n=10)
7 d(n=10)
15 d(n=10)
21 d(n=10)
30 d(n=10)
60 d(n=10)
3 d(n=10)
7 d(n=10)
15 d(n=10)
21 d(n=10)
, 百拇医药
30 d(n=10)
60 d(n=10)
Control
6.2±1.8
6.5±2.0
6.0±1.5
6.8±2.2
5.9±1.6
6.1± 1.9
15.1±4.8
15.4±4.9
14.9±4.2
, 百拇医药
15.5±4.7
15.3±4.5
15.6± 4.3
Experimental
8.1±2.8
11.3±4.2
16.7± 6.5*
20.5±8.6* *
9.4±3.2
7.3±2.5
18.4±6.3
, http://www.100md.com
25.2±9.8
40.7±14.3*
68.9±16.2* *
20.8±8.2
17.9 ±6.1
*：P<0.05, * *：P<0.01 vs control
表2 大鼠面神经干离断后面神经核内
TUNEL阳性细胞(±s)
Tab 2 Number of TUNEL positive cells in nucleus of facial
, http://www.100md.com
nerve after axotomy (±s) Group
3 d(n=10)
7 d(n=10)
15 d(n=10)
21 d(n=10)
30 d(n=10)
60 d(n=10)
Control
1.8±0.9
1.4±0.5
, 百拇医药
1.9±1.1
1.6±0.7
1.5±0.4
1.4±0.6
Experimental
10.9±3.8
15.3±5.9
20.5±8.6*
26.8±10.1* *
21.4±9.2
19.7±7.2
, 百拇医药
*：P<0.05, * *：P<0.01 vs control
图1 切断面神经后21 d，bcl-2在面神经元的表达 (ABC×100)
Fig 1 Expression of bcl-2 in facial neurons 21 d after facial
nerve axotomy (ABC×100)
图2 切断面神经后21 d，bax在面神经元的表达 (ABC×100)
Fig 2 Expression of bax in facial neurons 21 d after facial
, 百拇医药
nerve axotomy (ABC×100)
3 讨论
我们的研究发现，面神经干切断后面神经元区术后不同时间TUNEL阳性细胞数都较对照侧明显增加，表明面神经干切断后能引起相应的面神经元凋亡。同时，面神经元内bcl-2、bax基因表达较正常增多，术后21 d达高峰， bcl-2/bax变化与面神经元凋亡具有明显相关性，表明bcl-2、bax基因在面神经元凋亡过程中参与了调控。
包括fas配基、生长因子缺乏、自由基在内的许多因素能诱导细胞凋亡的发生[2]，但对凋亡的确切机制还不十分清楚。近年来，研究细胞凋亡的基因调控备受关注，其中bcl-2家族在细胞凋亡过程中的作用成为研究热点。bcl-2、bax基因是bcl-2家族中作用完全相反的基因[3] 。bcl-2 基因能够抑制多种因素诱导的细胞凋亡，可能是通过抗氧化效应[4] 、阻止细胞内Ca2+流动，使细胞膜超极化[5]或控制细胞信号传导途径而发挥作用。bax基因主要是通过其自身形成的bax同二聚体和/或与bcl-2形成异二聚体而调节细胞凋亡。bax同二聚体促进细胞凋亡，异二聚体则抑制细胞凋亡[6]。细胞凋亡能否发生，决定于bcl-2与bax的严格化学定量比。
, http://www.100md.com
我们的研究表明，bcl-2、bax基因在正常面神经元内均有表达，面神经干损伤后面神经元内bcl-2、bax基因较对照侧增多，在术后21 d达最高值，与对照侧相比，差异非常显著(P<0.01)。面神经元的凋亡在术后21 d达高峰，此时，bcl-2/bax比值达最低，面神经元的凋亡与bcl-2/bax比值具有显著相关性(P<0.01)。已有研究表明[7]，周围神经损伤后，相应的神经元胞体神经传导的蛋白合成明显减少，及神经元内5-HT2、α1-肾上腺素能受体、M型乙酰胆碱受体含量降低，这也从另一方面支持我们的研究结果，即面神经干损伤后可引起面神经元的凋亡。面神经干切断后面神经元内bcl-2、bax基因的升高及bcl-2/bax表达比率下降，以致神经元的凋亡数增加，提示bcl-2、bax基因参与了面神经元凋亡过程的调控。
我们的研究还发现，面神经元凋亡在术后21 d达高峰，30 d和60 d有所下降，但显著高于正常(P<0.05),然而bcl-2/bax比值接近正常，这可能与神经元是终端分化细胞，本身不具备分裂能力，一旦出现死亡，不能得到有效补充有关。
, 百拇医药
作者简介：杨 军(1962-)，男，江苏省淮安市人，硕士，副教授，主要从事口腔颌面部组织损伤方面的研究，发表论文10篇。电话：(023)68754114-73143
参考文献：
[1] Mu X, He J, Anderson D W. Altered expression of bcl-2 and bax mRNA in amyotriphic lateral sclerosis spinal cord motor neurons[J]. Ann Neurol，1996,40(3):379-386.
[2] Thompson C B, Freedman J C. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease[J]. Science，1995,267(4):1 455-1 457.
, 百拇医药
[3] Macaya A. Apoptosis in the nervous system[J]. Rev Neurol，1996,24(135):1 356-1 360.
[4] Steinman H M, Dambrine G. The bcl-2 oncoprotein function as a pro-oxidant[J]. J Biol Chem，1995,270(4):3 487-3 490.
[5] Gilbert M S, Saad A H, Rupnow B A, et al. Association of bcl-2 with membrane hyperpolarization and radioresistance[J]. J Cell Physiol，1996,168(2):114-122.
[6] Oitvai N Z, Milliman L C, Korsmeyer J S. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homology, bax that accelerates programmed cell death[J]. Cell,1993,74(1):609-619.
[7] 吴建中，Zilles K. 切断面神经后大鼠面神经核内5-HT2、M2和α1-肾上腺素能受体的变化[J].神经解剖学杂志，1998，14(1)：72-74.
收稿日期：2000-03-15；修回日期：2000-07-28, 百拇医药
单位：第三军医大学附属西南医院口腔科，重庆 400038
关键词：bcl-2；bax；凋亡；面神经元；轴突切断；大鼠
第三军医大学学报001219
提 要： 目的 观察面神经干切断后面神经元bcl-2、bax基因表达与面神经元凋亡的关系。方法 采用大鼠面神经干切断模型，应用免疫组织化学方法观察面神经干切断后面神经元内bcl-2、bax基因表达变化和对面神经元凋亡的影响。结果 面神经干切断后可以导致bcl-2、bax基因表达的明显变化及面神经元的凋亡。结论 bcl-2、bax基因参与了面神经干切断诱导的面神经元凋亡过程的调控。
中图法分类号： R322.8;R394.3 文献标识码： A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-5404(2000)12-1183-03
Changes of expression of bcl-2 and bax gene in facial neurons of rats following facial nerve axotomy
YANG Jun, FANG Ze-qiang, LI Hui-zeng, ZHANG Cong-ji
(Department of Stomatology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract： Objective To investigate the relationship between the expressions of bcl-2, bax gene and apoptosis of facial neuron after facial nerve axotomy. Methods After the model of facial nerve axotomy was established in Wistar rats, the changes of bcl-2 and bax gene expressions in facial neurons and facial neuronal apoptosis were observed with immunohistochemical methods. Results Facial nerve axotomy resulted in the changes of bcl-2, bax gene expressions and facial neuronal apoptosis. Conclusion bcl-2 and bax gene might participate the process of apoptosis of the facial neuron induced by facial nerve axotomy.
, 百拇医药
Key words: bcl-2; bax; apoptosis; rat; facial neurons; axotomy
损伤周围神经可引起其源神经元胞体一系列形态学及生物化学变化，且周围神经损伤后的修复与其神经元存活状态紧密相关。近来研究表明bcl-2族基因与细胞凋亡的发生有密切关系[1]。本研究采用免疫组织化学方法，对切断面神经干后不同时相点的面神经元内bcl-2、bax基因表达及面神经元凋亡变化进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料 健康Wistar大白鼠60只，雌雄各半，体重为180～240 g,随机分为3、7、15、21、30、60 d时相组，每组10只。实验动物由第三军医大学实验动物中心提供。
主要试剂：兔抗大鼠bcl-2和bax抗体、生物素化羊抗兔IgG由武汉博士德生物工程公司提供。细胞凋亡测定试剂盒由德国宝灵曼公司提供。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1动物模型建立 1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)经腹腔麻醉后暴露左侧面神经，于茎乳孔下5mm处将其切断，并于远侧
神经干切除1cm以防止神经再生。止血，缝合切口。右侧面神经干未切断为对照侧。
1.2.2 取材与制片 各组动物均在麻醉下取材。经左心室穿刺升主动脉快速灌注37 ℃生理盐水150 ml及4 ℃4%多聚甲醛250 ml,固定后开颅取脑，取出脑组织再固定2 h，每只动物左右水平切面切取1块以小脑桥延沟为中心5 mm厚脑组织块，用4%多聚甲醛固定24 h，然后移入30%蔗糖溶液固定12 h。25 μm连续冰冻切片，切片浸泡于0.01 mol/L PBS备用。
1.2.3 bcl-2和bax基因表达检测 免疫组化ABC染色法。实验动物标本切片用3%H2O2室温孵育15 min,再用7.5%正常山羊血清封闭，室温孵育30 min。加入一抗(兔抗bcl-2-IgG或兔抗bax-IgG)37 ℃孵育60 min, 0.01 mol/L PBS冲洗。加入二抗(生物素化羊抗兔IgG)37 ℃孵育60 min，0.01 mol/L PBS冲洗。加入ABC复合物室温孵育15 min，0.01 mol/L PBS冲洗。 DAB显色。自来水冲洗，复染，封片。
, 百拇医药
1.2.4 面神经元凋亡观察 荧光标记的终末去氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labelling， TUNEL)。实验动物标本切片用0.1 mol/L Tris-HCl(3%BSA,20%正常牛血清) 室温孵育30 min, 0.15 mol/L PBS冲洗。加入试剂盒中的反应成份37 ℃孵育60 min，0.15 mol/L PBS冲洗。切片烘干，封片。用荧光显微镜观察。
1.3 统计学处理
采用重庆大学Tiger计算机图像分析仪分别计算每张切片左右侧面神经元内bcl-2、bax及凋亡神经元免疫荧光的光密度，结果以
±s表示，统计处理用方差分析和t检验。2 结果
, 百拇医药
正常面神经核内可见神经元有散在分布的呈棕黄色的bcl-2、bax基因表达及有免疫荧光反应的凋亡神经元(TUNEL阳性细胞)。术后第3天，实验侧面神经核bcl-2、bax基因表达及TUNEL阳性细胞数较正常增加，第15天较正常明显增加，第21天 bcl-2、bax基因表达及TUNEL阳性细胞数增加达高峰。见表1、2及图1、2。
表1 大鼠面神经干离断后面神经核内bcl-2、bax免疫组化染色光密度(
±s)Tab 1 Optical density of bcl-2 and bax immunohistochemical staining in nucleus of facial nerve after axotomy(
±s) Group, 百拇医药
bcl-2
bax
3 d(n=10)
7 d(n=10)
15 d(n=10)
21 d(n=10)
30 d(n=10)
60 d(n=10)
3 d(n=10)
7 d(n=10)
15 d(n=10)
21 d(n=10)
, 百拇医药
30 d(n=10)
60 d(n=10)
Control
6.2±1.8
6.5±2.0
6.0±1.5
6.8±2.2
5.9±1.6
6.1± 1.9
15.1±4.8
15.4±4.9
14.9±4.2
, 百拇医药
15.5±4.7
15.3±4.5
15.6± 4.3
Experimental
8.1±2.8
11.3±4.2
16.7± 6.5*
20.5±8.6* *
9.4±3.2
7.3±2.5
18.4±6.3
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25.2±9.8
40.7±14.3*
68.9±16.2* *
20.8±8.2
17.9 ±6.1
*：P<0.05, * *：P<0.01 vs control
表2 大鼠面神经干离断后面神经核内
TUNEL阳性细胞(
±s)Tab 2 Number of TUNEL positive cells in nucleus of facial
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nerve after axotomy (
±s) Group3 d(n=10)
7 d(n=10)
15 d(n=10)
21 d(n=10)
30 d(n=10)
60 d(n=10)
Control
1.8±0.9
1.4±0.5
, 百拇医药
1.9±1.1
1.6±0.7
1.5±0.4
1.4±0.6
Experimental
10.9±3.8
15.3±5.9
20.5±8.6*
26.8±10.1* *
21.4±9.2
19.7±7.2
, 百拇医药
*：P<0.05, * *：P<0.01 vs control
图1 切断面神经后21 d，bcl-2在面神经元的表达 (ABC×100)
Fig 1 Expression of bcl-2 in facial neurons 21 d after facial
nerve axotomy (ABC×100)
图2 切断面神经后21 d，bax在面神经元的表达 (ABC×100)
Fig 2 Expression of bax in facial neurons 21 d after facial
, 百拇医药
nerve axotomy (ABC×100)
3 讨论
我们的研究发现，面神经干切断后面神经元区术后不同时间TUNEL阳性细胞数都较对照侧明显增加，表明面神经干切断后能引起相应的面神经元凋亡。同时，面神经元内bcl-2、bax基因表达较正常增多，术后21 d达高峰， bcl-2/bax变化与面神经元凋亡具有明显相关性，表明bcl-2、bax基因在面神经元凋亡过程中参与了调控。
包括fas配基、生长因子缺乏、自由基在内的许多因素能诱导细胞凋亡的发生[2]，但对凋亡的确切机制还不十分清楚。近年来，研究细胞凋亡的基因调控备受关注，其中bcl-2家族在细胞凋亡过程中的作用成为研究热点。bcl-2、bax基因是bcl-2家族中作用完全相反的基因[3] 。bcl-2 基因能够抑制多种因素诱导的细胞凋亡，可能是通过抗氧化效应[4] 、阻止细胞内Ca2+流动，使细胞膜超极化[5]或控制细胞信号传导途径而发挥作用。bax基因主要是通过其自身形成的bax同二聚体和/或与bcl-2形成异二聚体而调节细胞凋亡。bax同二聚体促进细胞凋亡，异二聚体则抑制细胞凋亡[6]。细胞凋亡能否发生，决定于bcl-2与bax的严格化学定量比。
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我们的研究表明，bcl-2、bax基因在正常面神经元内均有表达，面神经干损伤后面神经元内bcl-2、bax基因较对照侧增多，在术后21 d达最高值，与对照侧相比，差异非常显著(P<0.01)。面神经元的凋亡在术后21 d达高峰，此时，bcl-2/bax比值达最低，面神经元的凋亡与bcl-2/bax比值具有显著相关性(P<0.01)。已有研究表明[7]，周围神经损伤后，相应的神经元胞体神经传导的蛋白合成明显减少，及神经元内5-HT2、α1-肾上腺素能受体、M型乙酰胆碱受体含量降低，这也从另一方面支持我们的研究结果，即面神经干损伤后可引起面神经元的凋亡。面神经干切断后面神经元内bcl-2、bax基因的升高及bcl-2/bax表达比率下降，以致神经元的凋亡数增加，提示bcl-2、bax基因参与了面神经元凋亡过程的调控。
我们的研究还发现，面神经元凋亡在术后21 d达高峰，30 d和60 d有所下降，但显著高于正常(P<0.05),然而bcl-2/bax比值接近正常，这可能与神经元是终端分化细胞，本身不具备分裂能力，一旦出现死亡，不能得到有效补充有关。
, 百拇医药
作者简介：杨 军(1962-)，男，江苏省淮安市人，硕士，副教授，主要从事口腔颌面部组织损伤方面的研究，发表论文10篇。电话：(023)68754114-73143
参考文献：
[1] Mu X, He J, Anderson D W. Altered expression of bcl-2 and bax mRNA in amyotriphic lateral sclerosis spinal cord motor neurons[J]. Ann Neurol，1996,40(3):379-386.
[2] Thompson C B, Freedman J C. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease[J]. Science，1995,267(4):1 455-1 457.
, 百拇医药
[3] Macaya A. Apoptosis in the nervous system[J]. Rev Neurol，1996,24(135):1 356-1 360.
[4] Steinman H M, Dambrine G. The bcl-2 oncoprotein function as a pro-oxidant[J]. J Biol Chem，1995,270(4):3 487-3 490.
[5] Gilbert M S, Saad A H, Rupnow B A, et al. Association of bcl-2 with membrane hyperpolarization and radioresistance[J]. J Cell Physiol，1996,168(2):114-122.
[6] Oitvai N Z, Milliman L C, Korsmeyer J S. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homology, bax that accelerates programmed cell death[J]. Cell,1993,74(1):609-619.
[7] 吴建中，Zilles K. 切断面神经后大鼠面神经核内5-HT2、M2和α1-肾上腺素能受体的变化[J].神经解剖学杂志，1998，14(1)：72-74.
收稿日期：2000-03-15；修回日期：2000-07-28, 百拇医药