顶体蛋白酶抑制剂4-胍基苯甲酸盐对人精子功能的影响
作者：赵亚南 纪亚忠 吕加国 易冰 盛毅 蒋丹
单位：赵亚南 纪亚忠 易冰 盛毅 蒋丹(第二军医大学长海医院全军生殖医学技术中心，上海200433)；吕加国(第二军医大学药学院药物化学教研室)
关键词：顶体蛋白酶抑制剂；精子；顶体
第二军医大学学报001217 [摘要] 目的：研究顶体蛋白酶抑制剂4-胍基苯甲酸盐(KF-950) 对人精子功能的影响。方法：体外用不同浓度的KF-950作用于人精子 ，观察其活动率；用免疫组化ABC法观察KF-950对精子顶体结构的影响。结果：[ HT5”SS〗KF-950对人精子的作用与其浓度和作用时间有关。经≥0.2 mg/ml KF-950处理 ，随着时间的延长以精子活动率明显下降，精子膜功能有不同程度的损害，顶体脱落率以及 已发生顶体反应的精子死亡率明显上升。结论：KF-950可通过破坏精 子膜而影响精子的功能。
, 百拇医药
[中图分类号] R 979.21 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1149-03
Effects of acrosin inhibitor 4-guanidinobenzoate on human sperm function
ZHAO Ya-Nan JI Ya-Zhong YI Bing SHENG Yi JIANG Dan
(Reproductive Medicine Center of PLA, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
Lü Jia-Guo
, 百拇医药
(Depart ment of Pharmaceutical Chemistry, College of Pharmacy)
[ABSTRACT] Objective: To study the effects of acrosin inhibi tor 4-guanidinobenzoate (KF-950) on human sperm function. Methods: The viability, and membrane structure of human sperm were studied in vitro after treatment wit h a series concentration of KF-950. Results: With KF-950 more than 0.2 mg/ml and the time increasing,sperm mobility decreased, sperm membrane in tegrity was injur ed,and the shedding ratio of sperm acrosome and death ratio of sperm after acros ome reaction increased markedly. Conclusion: KF-950 may affect sperm function by damaging its membrane integrity.
, http://www.100md.com
[KEY WORDS] acrosin inhibitor; sperm; acrosome
顶体蛋白酶作为受精过程中的关键酶， 其主要作用在于当精子发生顶体反应时协助顶体 中其他酶的释放[1，2]，也可能与透明带溶解有关[3，4]。如果顶体蛋 白酶能被有效抑制，将直接影响受精[5，6]。4-胍基苯甲酸盐(简称KF-950)是 我校药学院药物化学教研室合成的新型顶体蛋白酶抑制剂，研究表明其对精子顶体蛋白酶有 很强的抑制作用[7]。本研究将分析KF-950对人精子膜结构、顶体反应、精子活力 等的影响，旨在进一步探讨其抗生育的机制。
1 材料和方法
1.1 精子悬液的制备 正常献精者精液(精子活动率≥70%，前向运动精子≥75% ，畸形≤20%)，经0.1 mol/L PBS(pH7.4)洗涤2次后,悬液中精子密度为2×107/ml。
, 百拇医药
1.2 KF-950溶液的配制 原药KF-950由第二军医大学药学院药物化学教研室提 供。称取原药4 mg，加入二甲基亚砜(DMSO)80 μl，完全溶解后，再加生理盐水至10 ml 备用。
1.3 KF-950对精子活动率的影响 实验组将KF-950液稀释为0.1，0.2，0.3，0. 5 mg/ml 4种浓度，各取1 ml并分别加入0.1 ml精子悬液；对照组取8%的DMSO溶液1 ml，并 加 入0.1 ml精子悬液。37℃水浴10 min，离心600×g，10 min。PBS重悬精子，密度调整 为2 ×107/ml。经不同浓度KF-950处理后于不同时间点观察精子活动率的变化。
1.4 KF-950对精子顶体结构影响的观察 洗涤后的精子悬液250 μl分置于24孔 培养板中，分别加入实验组各种浓度的KF-950溶液和对照组DMSO中，在孵育不同时间后， 经600×g, 5 min离心，调整精子密度至6×107个/ml。取精子悬液10 μl，丙酮固定 ，加入 生物素标记的PSA(美国Vector公司产品，1∶100)孵育60 min(37℃)，再按ABC方法标记 (ABC试剂盒为美国Vector公司产品)。观察精子顶体的完整率。每次每组计数200个精子， 共10次。取实验1.1中所得精子悬液1 ml加入2 ml精子获能液(BWW)中，在CO2孵箱(5% CO 2，37℃)中孵育1,2,3,6,10 h，取上述获能精子0.1 ml，用锥虫蓝(台盼蓝)、俾士麦 棕、玫瑰红三染法染色。每次每组计数200个精子，共10次。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 KF-950对精子活动率的影响 结果见表1。经Dunett-t检验可见， 经0.2，0.3和0.5 mg/ml KF-950处理后的精子活动率与对照组(8% DMSO)的差别均有统计 学意义(P<0.05)。经SNK-q检验，0.2 mg/ml KF-950处理组分别与0.3 mg/ml 及0.5 mg/ml处理组相比，对精子活动率影响的差别均有统计学意义(P<0.05)。提 示随着KF-950浓度的增加，精子活动率减少并呈剂量依赖性。以上述方法检验同一浓度不 同时间下精子活动率，统计学上无明显差异(P>0.05)。
表 1 KF-950对精子活动率的影响
Tab 1 Effect of KF-950 on human sperm mobility
(n=10,
±s, %) Group
, http://www.100md.com
Time(t/min)
0
5
10
30
KF-950 (ρB/mg.ml-1)
0.1
66.1±1.41
65.3±1.68
65.1±2.10
65. 1±1.91
, 百拇医药
0.2
63.2±1.87*
62.1±1.92*
61.8±2.11*
60.9±1.98*
0.3
58.3±1.94*△
57.4±1.42*△
57.3±0.93*△
58.2±2.43*△
, 百拇医药
0.5
42.3±1.82*△
41.9±0.83*△
41.8±1.04*△
39.9±2.41*△
DMSO
66.8±1.37
66.7±1.21
65.3±2.23
66.2±1.9 7
*P<0.05 vs DMSO group; △ P<0.05 vs KF-950 0.2 mg/ml gro up2.2 KF-950对精子顶体结构的影响 对照组(8%DMSO)活精子顶体完整，呈致密 的棕色着色，顶体后区无着色，加入KF-950后，活精子顶体部无棕色着色，赤道板仅少量 棕色着色或无着色，顶体后区无着色。KF-950作用下已发生顶体反应的精子死亡率见表2 。经Dunnett-t检验，KF-950浓度≥0.2 mg/ml时 ，其作用下已发生顶体反应的死精率与对照组(8% DMSO)相比有统计学意义(P<0.01 )。经SNK-q检验，KF-950浓度≥0.2 mg/ml时，随着孵育时间的延长，已发生顶体反 应的精子的死精率不断上升，与对照组比较相差非常显著(P<0.01)，呈明显的时间依 赖性。
, http://www.100md.com
表 2 KF-950作用下已发生顶体反应的精子的死亡率
Tab 2 Mortality of sperm with acrosome reaction treated with KF-950
(n=10，±s， %) Group
Time(t/h)
0
1
2
3
6
10
, 百拇医药
KF-950 (ρB/mg.ml-1)
0.1
3.1±0.97
5.0±1.34
6.9±1.77
9.1±0 .88
17.1±2.82
47.1±2.11
0.2
5.2±2.77
6.7±2.33**
, http://www.100md.com
10.2±0.99**
15.4±1.13 **
27.6±0.98**
50.4±1.33
0.5
7.5±2.03
16.7±1.16**
29.5±0.98**
37.4±1.32 **
50.4±1.45**
, 百拇医药
77.8±1.76**
DMSO
3.6±1.54
4.8±1.03
6.9±1.53
9.2±1.43
15.3±2.08
49.3±2.13
**P<0.01 vs DMSO group3 讨 论
Kaminski和Zaneveld等曾用酚基取代对-硝基苯，合成了一系列芳香族-4-胍基苯甲酸盐 ，经体外及动物体内抗生育研究表明其具有低毒和高效的抗生育作用，认为它能与精子顶体 蛋白酶不可逆地结合，形成酶-抑制剂复合物使顶体蛋白酶失活[6,8]。KF-950对 人精子顶体蛋白酶有很强的抑制作用[7]。我们在另外的实验研究表明，KF-950对 大鼠精子顶体蛋白酶完全抑制的浓度为盐酸-N2-对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基甲酮 (TLCK)的1/200；在体外其有效杀精浓度随作用时间延长而降低,但较表面活性剂壬苯醇醚 高6～7倍(另文发表)。
, http://www.100md.com
本研究发现， KF-950的药物浓度≥0.2 mg/ml时，对人精子活动率、顶体及顶体反应均有 明显的影响；浓度<0.2 mg/ml在体外作用10 min时，对人精子功能影响不大，而这浓度远 大于体外抑制精子顶体蛋白酶的有效浓度[7]。
精子与顶体膜及顶体内容物中有大量糖蛋白或糖脂等，其中的α-D甘露糖基可与豌豆 凝集素(PSA)结合[9]。生物素标记的PSA探针与α-D甘露糖基结合，经免疫 组化的ABC法，加入显色剂，在发生顶体反应前的精子顶体与赤道板出现棕褐色反应，已死 精子被锥虫蓝所染色来判断精子的存活状态。随着孵育时间的延长(本实验孵育时间延长至1 0 h)，已发生顶体反应的精子逐渐死亡，这可能与精子获能后未被“去获能”，可很快因能 量耗竭而死亡有关。这与KF-950浓度≥0.2 mg/ml，致人精子的活力及活动率下降的结果 也是一致的。可能是由于KF-950较小的水溶性，容易穿过膜脂质双分子层(包括线粒体膜 )，增加精子膜的通透性或破坏精子膜的结构，从而影响精子的功能。KF-950体内抗生育 作用的有效浓度有待实验中获得，但在较高浓度时其抗生育作用与对膜结构的破坏作用相关 。
, 百拇医药
[基金项目] 上海市科委重大课题基金(924313014).
[作者简介] 赵亚南(1929-)，女(汉族)，教授，博士生导师.
参考文献
[1] Yamagata K, Murayama K, Okabe M, et al. Acrosin accelerat es the dispersal proteins during acrosome reaction[J]. J Biol Chem, 1998,273 (17):10470-10474.
[2] Adham IM, Nayernia K, Engel W. Spermatozoa lacking acrosin protein sh ow delayed fertilization[J]. Mol Reprod Dev, 1997,46(3):370-376.
, http://www.100md.com
[3] Liu DY, Baker HW. Inhibition of acrosin with a trypsin inhibitor bloc ks human sperm penetration of the zona pellucida[J]. Biol Reprod, 1993,48(2): 340-348.
[4] van der Ven HH, Kaminski JM, Bauer L, et al. Inhibition of human sperm penetration into zone-free hamster oocytes by proteinase inhibitor[J]. Fertil Steril, 1985,43(4):609-616.
[5] Joyce C, Freurd M, Peterson RN. Contraceptive effects of intravaginal application of acrosin and hyaluronidase inhibitors in rabbit[J]. Contracept ion, 1979,19(1):95-106.
, http://www.100md.com
[6] Kaminski JM, Smith D, Reid DS, et al. Effect of ary1 4-guanidino benzoates on the acrosin activity of human spermatozoa[J]. Biol Reprod, 1987, 36(5):1170-1176.
[7] 杨建华.一种新型高效的顶体酶抑制剂KF-950[J].男性学杂志 ,1994,8(3) ：145-146.
[8] Zaneveld LTD, Beyler SA, Kim DS, et al. Acrosin inhibitors as vag inal contraceptives in the primate and their acute toxicity[J]. Biol Reprod, 1979,20(5):1045-1054.
[9] Nicholas LC, Patrico M, James W, et al. Two simple methods for de tecting acrosome-reacted human sperm[J]. Gamete Res, 1986,15(4):213-216.
[收稿日期] 2000-06-08
[修回日期] 2000-11-22, http://www.100md.com
单位：赵亚南 纪亚忠 易冰 盛毅 蒋丹(第二军医大学长海医院全军生殖医学技术中心，上海200433)；吕加国(第二军医大学药学院药物化学教研室)
关键词：顶体蛋白酶抑制剂；精子；顶体
第二军医大学学报001217 [摘要] 目的：研究顶体蛋白酶抑制剂4-胍基苯甲酸盐(KF-950) 对人精子功能的影响。方法：体外用不同浓度的KF-950作用于人精子 ，观察其活动率；用免疫组化ABC法观察KF-950对精子顶体结构的影响。结果：[ HT5”SS〗KF-950对人精子的作用与其浓度和作用时间有关。经≥0.2 mg/ml KF-950处理 ，随着时间的延长以精子活动率明显下降，精子膜功能有不同程度的损害，顶体脱落率以及 已发生顶体反应的精子死亡率明显上升。结论：KF-950可通过破坏精 子膜而影响精子的功能。
, 百拇医药
[中图分类号] R 979.21 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1149-03
Effects of acrosin inhibitor 4-guanidinobenzoate on human sperm function
ZHAO Ya-Nan JI Ya-Zhong YI Bing SHENG Yi JIANG Dan
(Reproductive Medicine Center of PLA, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
Lü Jia-Guo
, 百拇医药
(Depart ment of Pharmaceutical Chemistry, College of Pharmacy)
[ABSTRACT] Objective: To study the effects of acrosin inhibi tor 4-guanidinobenzoate (KF-950) on human sperm function. Methods: The viability, and membrane structure of human sperm were studied in vitro after treatment wit h a series concentration of KF-950. Results: With KF-950 more than 0.2 mg/ml and the time increasing,sperm mobility decreased, sperm membrane in tegrity was injur ed,and the shedding ratio of sperm acrosome and death ratio of sperm after acros ome reaction increased markedly. Conclusion: KF-950 may affect sperm function by damaging its membrane integrity.
, http://www.100md.com
[KEY WORDS] acrosin inhibitor; sperm; acrosome
顶体蛋白酶作为受精过程中的关键酶， 其主要作用在于当精子发生顶体反应时协助顶体 中其他酶的释放[1，2]，也可能与透明带溶解有关[3，4]。如果顶体蛋 白酶能被有效抑制，将直接影响受精[5，6]。4-胍基苯甲酸盐(简称KF-950)是 我校药学院药物化学教研室合成的新型顶体蛋白酶抑制剂，研究表明其对精子顶体蛋白酶有 很强的抑制作用[7]。本研究将分析KF-950对人精子膜结构、顶体反应、精子活力 等的影响，旨在进一步探讨其抗生育的机制。
1 材料和方法
1.1 精子悬液的制备 正常献精者精液(精子活动率≥70%，前向运动精子≥75% ，畸形≤20%)，经0.1 mol/L PBS(pH7.4)洗涤2次后,悬液中精子密度为2×107/ml。
, 百拇医药
1.2 KF-950溶液的配制 原药KF-950由第二军医大学药学院药物化学教研室提 供。称取原药4 mg，加入二甲基亚砜(DMSO)80 μl，完全溶解后，再加生理盐水至10 ml 备用。
1.3 KF-950对精子活动率的影响 实验组将KF-950液稀释为0.1，0.2，0.3，0. 5 mg/ml 4种浓度，各取1 ml并分别加入0.1 ml精子悬液；对照组取8%的DMSO溶液1 ml，并 加 入0.1 ml精子悬液。37℃水浴10 min，离心600×g，10 min。PBS重悬精子，密度调整 为2 ×107/ml。经不同浓度KF-950处理后于不同时间点观察精子活动率的变化。
1.4 KF-950对精子顶体结构影响的观察 洗涤后的精子悬液250 μl分置于24孔 培养板中，分别加入实验组各种浓度的KF-950溶液和对照组DMSO中，在孵育不同时间后， 经600×g, 5 min离心，调整精子密度至6×107个/ml。取精子悬液10 μl，丙酮固定 ，加入 生物素标记的PSA(美国Vector公司产品，1∶100)孵育60 min(37℃)，再按ABC方法标记 (ABC试剂盒为美国Vector公司产品)。观察精子顶体的完整率。每次每组计数200个精子， 共10次。取实验1.1中所得精子悬液1 ml加入2 ml精子获能液(BWW)中，在CO2孵箱(5% CO 2，37℃)中孵育1,2,3,6,10 h，取上述获能精子0.1 ml，用锥虫蓝(台盼蓝)、俾士麦 棕、玫瑰红三染法染色。每次每组计数200个精子，共10次。
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2 结 果
2.1 KF-950对精子活动率的影响 结果见表1。经Dunett-t检验可见， 经0.2，0.3和0.5 mg/ml KF-950处理后的精子活动率与对照组(8% DMSO)的差别均有统计 学意义(P<0.05)。经SNK-q检验，0.2 mg/ml KF-950处理组分别与0.3 mg/ml 及0.5 mg/ml处理组相比，对精子活动率影响的差别均有统计学意义(P<0.05)。提 示随着KF-950浓度的增加，精子活动率减少并呈剂量依赖性。以上述方法检验同一浓度不 同时间下精子活动率，统计学上无明显差异(P>0.05)。
表 1 KF-950对精子活动率的影响
Tab 1 Effect of KF-950 on human sperm mobility
(n=10,
±s, %) Group, http://www.100md.com
Time(t/min)
0
5
10
30
KF-950 (ρB/mg.ml-1)
0.1
66.1±1.41
65.3±1.68
65.1±2.10
65. 1±1.91
, 百拇医药
0.2
63.2±1.87*
62.1±1.92*
61.8±2.11*
60.9±1.98*
0.3
58.3±1.94*△
57.4±1.42*△
57.3±0.93*△
58.2±2.43*△
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0.5
42.3±1.82*△
41.9±0.83*△
41.8±1.04*△
39.9±2.41*△
DMSO
66.8±1.37
66.7±1.21
65.3±2.23
66.2±1.9 7
*P<0.05 vs DMSO group; △ P<0.05 vs KF-950 0.2 mg/ml gro up2.2 KF-950对精子顶体结构的影响 对照组(8%DMSO)活精子顶体完整，呈致密 的棕色着色，顶体后区无着色，加入KF-950后，活精子顶体部无棕色着色，赤道板仅少量 棕色着色或无着色，顶体后区无着色。KF-950作用下已发生顶体反应的精子死亡率见表2 。经Dunnett-t检验，KF-950浓度≥0.2 mg/ml时 ，其作用下已发生顶体反应的死精率与对照组(8% DMSO)相比有统计学意义(P<0.01 )。经SNK-q检验，KF-950浓度≥0.2 mg/ml时，随着孵育时间的延长，已发生顶体反 应的精子的死精率不断上升，与对照组比较相差非常显著(P<0.01)，呈明显的时间依 赖性。
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表 2 KF-950作用下已发生顶体反应的精子的死亡率
Tab 2 Mortality of sperm with acrosome reaction treated with KF-950
(n=10，
±s， %) GroupTime(t/h)
0
1
2
3
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10
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KF-950 (ρB/mg.ml-1)
0.1
3.1±0.97
5.0±1.34
6.9±1.77
9.1±0 .88
17.1±2.82
47.1±2.11
0.2
5.2±2.77
6.7±2.33**
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10.2±0.99**
15.4±1.13 **
27.6±0.98**
50.4±1.33
0.5
7.5±2.03
16.7±1.16**
29.5±0.98**
37.4±1.32 **
50.4±1.45**
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77.8±1.76**
DMSO
3.6±1.54
4.8±1.03
6.9±1.53
9.2±1.43
15.3±2.08
49.3±2.13
**P<0.01 vs DMSO group3 讨 论
Kaminski和Zaneveld等曾用酚基取代对-硝基苯，合成了一系列芳香族-4-胍基苯甲酸盐 ，经体外及动物体内抗生育研究表明其具有低毒和高效的抗生育作用，认为它能与精子顶体 蛋白酶不可逆地结合，形成酶-抑制剂复合物使顶体蛋白酶失活[6,8]。KF-950对 人精子顶体蛋白酶有很强的抑制作用[7]。我们在另外的实验研究表明，KF-950对 大鼠精子顶体蛋白酶完全抑制的浓度为盐酸-N2-对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基甲酮 (TLCK)的1/200；在体外其有效杀精浓度随作用时间延长而降低,但较表面活性剂壬苯醇醚 高6～7倍(另文发表)。
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本研究发现， KF-950的药物浓度≥0.2 mg/ml时，对人精子活动率、顶体及顶体反应均有 明显的影响；浓度<0.2 mg/ml在体外作用10 min时，对人精子功能影响不大，而这浓度远 大于体外抑制精子顶体蛋白酶的有效浓度[7]。
精子与顶体膜及顶体内容物中有大量糖蛋白或糖脂等，其中的α-D甘露糖基可与豌豆 凝集素(PSA)结合[9]。生物素标记的PSA探针与α-D甘露糖基结合，经免疫 组化的ABC法，加入显色剂，在发生顶体反应前的精子顶体与赤道板出现棕褐色反应，已死 精子被锥虫蓝所染色来判断精子的存活状态。随着孵育时间的延长(本实验孵育时间延长至1 0 h)，已发生顶体反应的精子逐渐死亡，这可能与精子获能后未被“去获能”，可很快因能 量耗竭而死亡有关。这与KF-950浓度≥0.2 mg/ml，致人精子的活力及活动率下降的结果 也是一致的。可能是由于KF-950较小的水溶性，容易穿过膜脂质双分子层(包括线粒体膜 )，增加精子膜的通透性或破坏精子膜的结构，从而影响精子的功能。KF-950体内抗生育 作用的有效浓度有待实验中获得，但在较高浓度时其抗生育作用与对膜结构的破坏作用相关 。
, 百拇医药
[基金项目] 上海市科委重大课题基金(924313014).
[作者简介] 赵亚南(1929-)，女(汉族)，教授，博士生导师.
参考文献
[1] Yamagata K, Murayama K, Okabe M, et al. Acrosin accelerat es the dispersal proteins during acrosome reaction[J]. J Biol Chem, 1998,273 (17):10470-10474.
[2] Adham IM, Nayernia K, Engel W. Spermatozoa lacking acrosin protein sh ow delayed fertilization[J]. Mol Reprod Dev, 1997,46(3):370-376.
, http://www.100md.com
[3] Liu DY, Baker HW. Inhibition of acrosin with a trypsin inhibitor bloc ks human sperm penetration of the zona pellucida[J]. Biol Reprod, 1993,48(2): 340-348.
[4] van der Ven HH, Kaminski JM, Bauer L, et al. Inhibition of human sperm penetration into zone-free hamster oocytes by proteinase inhibitor[J]. Fertil Steril, 1985,43(4):609-616.
[5] Joyce C, Freurd M, Peterson RN. Contraceptive effects of intravaginal application of acrosin and hyaluronidase inhibitors in rabbit[J]. Contracept ion, 1979,19(1):95-106.
, http://www.100md.com
[6] Kaminski JM, Smith D, Reid DS, et al. Effect of ary1 4-guanidino benzoates on the acrosin activity of human spermatozoa[J]. Biol Reprod, 1987, 36(5):1170-1176.
[7] 杨建华.一种新型高效的顶体酶抑制剂KF-950[J].男性学杂志 ,1994,8(3) ：145-146.
[8] Zaneveld LTD, Beyler SA, Kim DS, et al. Acrosin inhibitors as vag inal contraceptives in the primate and their acute toxicity[J]. Biol Reprod, 1979,20(5):1045-1054.
[9] Nicholas LC, Patrico M, James W, et al. Two simple methods for de tecting acrosome-reacted human sperm[J]. Gamete Res, 1986,15(4):213-216.
[收稿日期] 2000-06-08
[修回日期] 2000-11-22, http://www.100md.com