高效液相色谱法测定澄清剂处理黄柏水提液中小檗碱的含量
作者：王曙东 宋炳生 陶建生
单位：王曙东 宋炳生(南京军区南京总医院 210002)；陶建生(上海中医药大学)
关键词：
中草药001219
中药制剂过程中，现多采用乙醇作为澄清剂，以除去醇不溶性成分而达到澄清目的，这样极 易造成有效成分的丢失而影响药物疗效，同时需耗用大量酒精。本文以肾舒冲剂(黄柏为例) ，采用水煎液壳聚糖澄清处理，HPLC法测定小檗碱的含量，并与水醇法作比较。
1 药品、试剂和仪器
中药购自上海市药材公司，小檗碱对照品购于中国药品生物制品检定所，壳聚糖购于华东理 工大学理学院华凯科技贸易公司(用1 %醋酸溶液配成1 %壳聚糖溶液)。所用试剂均为AR。
, 百拇医药
色谱仪系统包括UV200紫外可变波长检测器，P200高压恒流泵(大连化物所)，GJ-605型高压 六通进样阀(进样杯体积20 μL)。数据采集及处理采用WDL-95色谱工作站(国家色谱中心) ， 在486微机上实现。色谱柱：Spherisorb C18 5μm 4.6 mm×250 mm(大连化物所)。
2 小檗碱的含量测定方法
2.1 色谱条件：流动相为乙腈-0.04 mol/L H3PO4(42∶58)，检测波长349 nm，流 速1.0 mL/min，柱温：室温。
2.2 标准曲线：精密称取105 ℃干燥至恒重的小檗碱2.4 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶 解至刻度，得240 μg/mL对照溶液。加甲醇配成120 μg/mL溶液，分别取0.1，0.2，0.4 ，0.8，1.6 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，进样量10 μL测定。以对照品浓 度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=263 09.60X-355.42,r=0.999 8。小檗碱在1.2～19.2 μg/mL 范围内峰面积与进样浓度呈线性关系。
, 百拇医药
2.3 精密度试验：精密吸取小檗碱对照品液(0.36 μg/mL)0.5 mL 于10 mL容量瓶中， 加醇至刻度，连续进样5次，每次2 μL,得平均峰面积值为48 122，RSD为0.60%。
2.4 重现性试验：平行取处方水煎液10 mL(相当含黄柏2 g)5份于三角瓶中，水浴挥干， 依法测定峰面积，得小檗碱面积均值为402 320，RSD为2.50%。
2.5 回收率试验：精密吸取已知含量的水煎液，精密加入小檗碱对照品，依法测定，结果 回收率为89.99%，RSD=3.9%(n=4)。
3 不同澄清剂澄清工艺的比较
3.1 不同澄清剂的澄清工艺：取处方水提液10 mL(相当含黄柏2 g)各3份，按下述方法分 别处理。1号：50%乙醇沉淀，滤过，滤液水浴挥干；2号：40%壳聚糖溶液沉淀，80 ℃水浴 加热片刻至澄清，滤过，滤液水浴挥干；3号：未经任何澄清处理，直接水浴挥干。
, http://www.100md.com
3.2 样品处理与测定结果：取上述样品分别加入10 mL氯仿，超声提取10 min，过滤，挥 干氯仿，残渣甲醇溶解并定容10 mL。取50 μL甲醇混匀，注入液相色谱仪，进样量20 μL 。结果见表1。
表1 不同澄清方法的肾舒冲剂样品的含量测定 编号
1
2
3
平均值
RSD%
1峰面积
400 000
409 000
, 百拇医药
383 500
397 500
3.25
浓度(μ/mL)
15.22
15.56
14.59
15.12
2峰面积
394 700
378 100
384 900
, 百拇医药 385 900
2.16
浓度(μ/mL)
15.02
14.38
14.64
14.68
3峰面积
420 900
433 600
420 200
424 900
1.75
, http://www.100md.com
浓度(μ/mL)
16.01
16.49
15.98
16.16
4 正交设计优选壳聚糖最佳澄清工艺
4.1 试验因素与因素水平的确定：根据壳聚糖本身的特点以及实际应用的情况，影响澄清 效果的相关因素主要包括：壳聚糖加入量、药液浓度、药液的pH值，利用L9(34)正交表 进行试验。
因素A 壳聚糖加入量：A1=0.4 mL,A2=0.8 mL,A3=1.6 mL;
, 百拇医药
因素B 药液浓度(g/mL)：B1=2.0，B2=1.0，B3=0.5；
因素C 药液的pH值：C1=4,C2=5，C3=6。
4.2 结果与分析：按L9(34)正交设计表所设定的工艺条件试验，结果见表2、表3。
表2 壳聚糖澄清工艺的正交试验结果 试验号
A
B
C
峰面积
, 百拇医药
浓度
(μg/mL)
1
2
3
4
1
1
1
1
1
128 600
4.90
2
, http://www.100md.com
1
2
2
2
131 300
5.00
3
1
3
3
3
109 500
4.18
4
, 百拇医药
2
1
2
3
90 090
3.44
5
2
2
3
1
116 400
4.44
6
, http://www.100md.com
2
3
1
2
106 000
4.04
7
3
1
3
2
101 200
3.86
8
, 百拇医药
3
2
1
3
106 400
4.06
9
3
3
2
1
103 400
3.94
Ⅰ
, http://www.100md.com
14.08
12.20
13.00
13.28
Ⅱ
11.92
13.50
12.38
12.90
Ⅲ
11.86
12.16
12.48
, 百拇医药
11.68
Ⅰ
4.69
4.07
4.33
4.43
Ⅱ
3.97
4.50
4.13
4.30
Ⅲ
3.95
, http://www.100md.com
4.05
4.16
3.89
R
0.74
0.45
0.20
0.54
Rj
480.99
478.96
478.01
497.19
, 百拇医药
Rj=Ⅰ2+Ⅱ2+Ⅲ2
Sj=Rj/3-CT
1.07
0.39
0.08
0.47
CT=(ΣX)2/n=159.26
表3 壳聚糖澄清工艺的方差分析 变异来源
L
V
MS
, http://www.100md.com
F
A
1.07
2
0.535
2.28
B
0.39
2
0.195
0.83
C
0.08
, 百拇医药 2
0.040
0.17
误差
0.47
2
0.235
F0.05(2.2)=19.0
实验结果表明，壳聚糖处理的样品含量较醇沉法略低，都低于未处理样品，正交试验方差分 析表明，壳聚糖加入量、药液浓度、药液的pH，在所选择的3个水平中对样品含量的影响无 显著性差异。直观分析可知因素主次关系为A、B、C，较好的方案为A1B2C1。 (2000-01-10收稿), 百拇医药
单位：王曙东 宋炳生(南京军区南京总医院 210002)；陶建生(上海中医药大学)
关键词：
中草药001219
中药制剂过程中，现多采用乙醇作为澄清剂，以除去醇不溶性成分而达到澄清目的，这样极 易造成有效成分的丢失而影响药物疗效，同时需耗用大量酒精。本文以肾舒冲剂(黄柏为例) ，采用水煎液壳聚糖澄清处理，HPLC法测定小檗碱的含量，并与水醇法作比较。
1 药品、试剂和仪器
中药购自上海市药材公司，小檗碱对照品购于中国药品生物制品检定所，壳聚糖购于华东理 工大学理学院华凯科技贸易公司(用1 %醋酸溶液配成1 %壳聚糖溶液)。所用试剂均为AR。
, 百拇医药
色谱仪系统包括UV200紫外可变波长检测器，P200高压恒流泵(大连化物所)，GJ-605型高压 六通进样阀(进样杯体积20 μL)。数据采集及处理采用WDL-95色谱工作站(国家色谱中心) ， 在486微机上实现。色谱柱：Spherisorb C18 5μm 4.6 mm×250 mm(大连化物所)。
2 小檗碱的含量测定方法
2.1 色谱条件：流动相为乙腈-0.04 mol/L H3PO4(42∶58)，检测波长349 nm，流 速1.0 mL/min，柱温：室温。
2.2 标准曲线：精密称取105 ℃干燥至恒重的小檗碱2.4 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶 解至刻度，得240 μg/mL对照溶液。加甲醇配成120 μg/mL溶液，分别取0.1，0.2，0.4 ，0.8，1.6 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，进样量10 μL测定。以对照品浓 度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=263 09.60X-355.42,r=0.999 8。小檗碱在1.2～19.2 μg/mL 范围内峰面积与进样浓度呈线性关系。
, 百拇医药
2.3 精密度试验：精密吸取小檗碱对照品液(0.36 μg/mL)0.5 mL 于10 mL容量瓶中， 加醇至刻度，连续进样5次，每次2 μL,得平均峰面积值为48 122，RSD为0.60%。
2.4 重现性试验：平行取处方水煎液10 mL(相当含黄柏2 g)5份于三角瓶中，水浴挥干， 依法测定峰面积，得小檗碱面积均值为402 320，RSD为2.50%。
2.5 回收率试验：精密吸取已知含量的水煎液，精密加入小檗碱对照品，依法测定，结果 回收率为89.99%，RSD=3.9%(n=4)。
3 不同澄清剂澄清工艺的比较
3.1 不同澄清剂的澄清工艺：取处方水提液10 mL(相当含黄柏2 g)各3份，按下述方法分 别处理。1号：50%乙醇沉淀，滤过，滤液水浴挥干；2号：40%壳聚糖溶液沉淀，80 ℃水浴 加热片刻至澄清，滤过，滤液水浴挥干；3号：未经任何澄清处理，直接水浴挥干。
, http://www.100md.com
3.2 样品处理与测定结果：取上述样品分别加入10 mL氯仿，超声提取10 min，过滤，挥 干氯仿，残渣甲醇溶解并定容10 mL。取50 μL甲醇混匀，注入液相色谱仪，进样量20 μL 。结果见表1。
表1 不同澄清方法的肾舒冲剂样品的含量测定 编号
1
2
3
平均值
RSD%
1峰面积
400 000
409 000
, 百拇医药
383 500
397 500
3.25
浓度(μ/mL)
15.22
15.56
14.59
15.12
2峰面积
394 700
378 100
384 900
, 百拇医药 385 900
2.16
浓度(μ/mL)
15.02
14.38
14.64
14.68
3峰面积
420 900
433 600
420 200
424 900
1.75
, http://www.100md.com
浓度(μ/mL)
16.01
16.49
15.98
16.16
4 正交设计优选壳聚糖最佳澄清工艺
4.1 试验因素与因素水平的确定：根据壳聚糖本身的特点以及实际应用的情况，影响澄清 效果的相关因素主要包括：壳聚糖加入量、药液浓度、药液的pH值，利用L9(34)正交表 进行试验。
因素A 壳聚糖加入量：A1=0.4 mL,A2=0.8 mL,A3=1.6 mL;
, 百拇医药
因素B 药液浓度(g/mL)：B1=2.0，B2=1.0，B3=0.5；
因素C 药液的pH值：C1=4,C2=5，C3=6。
4.2 结果与分析：按L9(34)正交设计表所设定的工艺条件试验，结果见表2、表3。
表2 壳聚糖澄清工艺的正交试验结果 试验号
A
B
C
峰面积
, 百拇医药
浓度
(μg/mL)
1
2
3
4
1
1
1
1
1
128 600
4.90
2
, http://www.100md.com
1
2
2
2
131 300
5.00
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4.18
4
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2
1
2
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3.44
5
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2
3
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116 400
4.44
6
, http://www.100md.com
2
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1
2
106 000
4.04
7
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3
2
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106 400
4.06
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1
103 400
3.94
Ⅰ
, http://www.100md.com
14.08
12.20
13.00
13.28
Ⅱ
11.92
13.50
12.38
12.90
Ⅲ
11.86
12.16
12.48
, 百拇医药
11.68
Ⅰ
4.69
4.07
4.33
4.43
Ⅱ
3.97
4.50
4.13
4.30
Ⅲ
3.95
, http://www.100md.com
4.05
4.16
3.89
R
0.74
0.45
0.20
0.54
Rj
480.99
478.96
478.01
497.19
, 百拇医药
Rj=Ⅰ2+Ⅱ2+Ⅲ2
Sj=Rj/3-CT
1.07
0.39
0.08
0.47
CT=(ΣX)2/n=159.26
表3 壳聚糖澄清工艺的方差分析 变异来源
L
V
MS
, http://www.100md.com
F
A
1.07
2
0.535
2.28
B
0.39
2
0.195
0.83
C
0.08
, 百拇医药 2
0.040
0.17
误差
0.47
2
0.235
F0.05(2.2)=19.0
实验结果表明，壳聚糖处理的样品含量较醇沉法略低，都低于未处理样品，正交试验方差分 析表明，壳聚糖加入量、药液浓度、药液的pH，在所选择的3个水平中对样品含量的影响无 显著性差异。直观分析可知因素主次关系为A、B、C，较好的方案为A1B2C1。 (2000-01-10收稿), 百拇医药