内毒素休克大鼠肝线粒体H+-ATP酶活性变化及其与氧自由基 的关系
作者：刘建仓 陆松敏 杨鹤鸣 贾后军 万志红 李萍
单位：第三军医大学第三附 属医院野战外科研究所，重庆 400042
关键词：内毒素；线粒体；H+-ATP酶；FeSO4；VitC；脂质过氧化
中国急救医学001204 [摘 要]目的 本研究旨在探讨内毒素休克时肝线粒体H+-ATP酶和脂质 过氧化的改变。方法 成年健康Wistar大鼠80只，随机分为内毒素 注射前、内毒素注射后1、3、5、8 h组及其对照组；予各组相应时相点活杀取肝组织制备线 粒体，测定线粒体H+-ATP酶、MDA及血浆MDA含量。离体实验采用正常鼠肝线粒体和不同剂 量的氧自由基生成剂(FeSO4/VitC)共同孵育后，测量H+-ATP酶活性。结果 内毒素休克早期线粒体H+-ATP酶活性升高，3 h时其酶活性升高15.6%，8 h 时降至对照组的65%。内毒素休克早期肝线粒体MDA含量就显著增高，随着休克时间延长而加 重，8 h时为对照组的1.79倍。离体实验显示，小剂量FeSO4/VitC引起的H+-ATP酶活性 升高，大剂量引起H+-ATP酶活性下降，和在体实验结果平行。结论 内毒素休克早期H+-ATP酶升高，晚期H+-ATP酶活性降低。内毒素休克时脂质过氧化 物进行性增加，脂质过氧化可能是H+-ATP酶下降的重要原因。
, 百拇医药
[中图分类号] R 364.14 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)12-0699-02
Changes of H+-ATPase and LPO of liver metochondria in endotoxic shock rats
LIU Jian-cang,LU Song-min,YANG He-ming, et al.
(Research Institute of Sur gery,the Third Militory Medical University,Chongqing 400042,China)
[Abstract]Objective To investigate the changes of mitochondria H +-ATPase,Lipid peroxide(LPO) in endotoxic shock.Methods 80 healthy adult wistar rats were divided into ten groups:pre-injection group,and 1 , 3,5,8 hours after injection endotoxin and control groups respectively.The liver tissue samples were used for preparation of mitochondria.The H+-ATPase of mito chondria and plasma MDA were assayed.The mitochondria of liver cell was incubate d with different concentration of FeSO4/VitC,the H+-ATPase activity was assa yed.Results The mitochondrial H+-ATPase activity at the e a rly stage of endotoxic shock was significantly increased,at 3 h after inject ion E Coli H+-ATPase were elevated to 15.6% of control level(P<0.05).How ever it was significantly decreased at the later stage of endotoxic shock(P <0.0 1).At 8 h after injection of E Coli H+-ATPase lowed to 65%of contral level.Mit ochondria MDA,plasma MDA content at the early stage of endotoxic shock were sign ificantly increased than control level.MDA gradually elevated after injection of E Coli.MDA content at 8 h after injection E Coli was 1.79 times as much as cont r ol level.The result of experiments in vitro indicated:the mitochondrial H+-ATP ase activity was significantly changed with concentration of FeSO4/VitC.When concentration of FeSO4/VitC was lower the H+-ATPase activity was elevented, and the concentrantion of FeSO4/VitC was higher the H+-ATPase activity was d eclined.The results in vitro was paralleled with results in vito.Conc lusion The H+-ATPase activity was elevated at the early stage of end otoxic shock,and lowered at the later stage.Lipid peroxidate contents were progr essively rosed.The increasment of LPO may be the cause of H+-ATPase activity r eduction.
, 百拇医药
[Key words] Endotoxin shock; Mitochondria; H+-ATPase; FeSO4/V itC; Lipid peroxidate
呼吸链末端H+-ATPase，又称为F0F1-ATP合成酶，是ATP合成的关键酶。它由F0、F 1、F0F1连接部OSCP(Oligomycin Sensitivity-conffering protein)组成，兼有ATP 合成和水解双重功能。有证据提示，ATP水解和合成可能是在同一催化中心，只是因构象不 同而表现为合成或水解特性[1]。H+-ATPase比其它呼吸复合体更容易受损 [2]，是影响休克预后的重要因素[3]。本文采用内毒素休克模型，探讨肝线 粒体H+-ATPase活性及其脂质过氧化的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康成年Wistar大鼠80只，体重250±50 g，雌雄不拘，随机分为 内毒素注射前及注射后1、3、5、8 h和对照组共10个小组，每小组8只，实验前禁食过夜， 自由饮水。3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定，气管插管和右颈动脉插管(监测血 压)，全身肝素化(500 U/kg)。内毒素休克组于尾静脉注射大肠杆菌内毒素5 mg/kg；对照组 于尾静脉注射生理盐水1 ml/kg。各组动物分别于相应时相点断头活杀取肝组织制备肝细胞 线粒体，测定线粒体H+-ATPase酶、MDA及血浆MDA含量。离体实验采用正常肝线粒体(0.2 mg/ml)和不同浓度的氧自由基生成剂FeSO4/VitC(0/0、5/150、10/300、20/600 、30/900、90/1 800 μmol/L)共同孵育(30℃，30 min)后，测定H+-ATPase活性。
, 百拇医药
1.2 肝线粒体的制备 采用差速离心法制备线粒体；定磷法测定H+-ATPase活性[ 4]。按广州暨南大学医学院病理生理教研室的MDA试剂盒说明书测定MDA含量。Lowrry法 测定蛋白。
2 结果
2.1 在体实验结果
2.1.1 平均动脉压(MAP) 动物注射大肠杆菌内毒素后即刻，平均动脉压降至9.58±1. 26 kPa，与注射前差异非常显著(P<0.01)。此后血压缓慢回升，3 h后又开始下降，8 h时为同时相对照组的53.96%(P<0.001)。见表1。
表1 内毒素休克大鼠平均动脉压(MAP)的变化(kPa) Time(h)
0
, http://www.100md.com
1
3
5
8
Control group
14.55±1.33
14.51±1.57
13.35±1.55
13.62±1.22
12.32±1.68
ET group
14.63±1.40
, 百拇医药
9.58±1.26*
11.14±1.60*
10 .54±1.19*
7.83±1.47**
*P<0.05，与对照组比差别显著；**P<0.01，与对照组比差别非常显著
2.1.2 肝线粒体膜H+-ATPase水解活性 内毒素休克组早期线粒体膜H+-ATPase活性 升高，3 h时其酶活性升高15.6%(P<0.05)。8 h时降至对照组的65%(P<0.05) 。见表2。
表2 内毒素休克大鼠肝线粒体膜H+-ATPase
, 百拇医药
活性的变化[μmo l/(mg.min)] Time(h)
0
1
3
5
8
Control group
1.992±0.127
2.023±0.133
1.980 ±0.143
1.947±0.139
2.063±0.133
, 百拇医药
ET group
2.006±0.141
2.116±0.167
2.290±0.151*
1.937±0.05 8
1.740±0.125**
*P<0.05，与对照组比差别显著；**P<0.01，与对照组比差别非常显著
2.1.3 肝线粒体膜MDA含量的变化 内毒素休克早期线粒体MDA含量就显著增高(P<0 .05 )，随着休克时间延长而加重。5 h后呈非常显著增高，8 h时为对照组的1.79倍(P<0 .01)。见表3。
, http://www.100md.com
表3 内毒素休克大鼠肝线粒体膜脂质过氧化物
MDA含量的变化(n mol/mg) Time(h)
0
1
3
5
8
Control group
6.065±0.744
6.141±0.826
5.463 ±0.552
5.463±0.876
, http://www.100md.com
6.285±1.071
ET group
5.984±0.626
9.962±1.763*
9.304±2.370 **
12.642±2.636**
11.285±2.672**
*P<0.05，与对照组比差别显著；**P<0.01，与对照组比差别非常显著
2.2 离体实验结果
, 百拇医药 2.2.1 不同浓度FeSO4/VitC对肝线粒体H+-ATPase活性的影响 小剂量FeSO4/VitC (10/30 μmol/L与线粒体孵育后H+-ATPase活性显著提高(P<0.05)，而当FeSO4/V itC浓度为90/1 800 μmol/L时，H+-ATPase活性降为原来的69%(P<0.01)。见表4。
表4 不同浓度FeSO4/VitC(μmol/L)对肝线粒体
H+-ATPase 活性[μmol/(mg.min)]的影响 FeSO4/VitC
0/0
5/150
, 百拇医药
10/300
20/600
30/900
90/1800
H+-ATPase
1.98±0.01
2.16±0.05
2.19± 0.40*
1.82±0.13
1.45±0.27**
1.39±0.25* *
, 百拇医药
*P<0.05，与对照组比差别显著；**P<0.01，与对照组比差别非常显著3 讨论
H+-ATPase比其它呼吸链复合体更容易受损，是影响休克预后的重要因素。Iwata等[ 3]报道，出血性休克1 h肝线粒体H+-ATPase活性下降48%，动物死亡 率与H+-ATPase活性相关。本实验发现，内毒素注射早期(3 h)H+-ATPase活力显著增高( P<0.05)，而晚期(8 h)显著降低(P<0.01)。脂质过氧化物却随休克的时间而进 行性升高 ，即早期氧自由基浓度小于晚期。而体外实验却证明小剂量自由基可使线粒体H+-ATPase 活性升高，而大剂量的自由基造成线粒体H+-ATPase活性下降。H+-ATPase随自由基剂量 的变化曲线与H+-ATPase和休克时相的变化曲线非常相似。提示氧自由基和H+-ATPase 改变高度相关。我们推测内毒素注射早期，由于ATP和H+的下降，对ATP酶起到负反 馈 调控作用，刺激ATP酶使其水解活性上升。随着休克的进一步加重，线粒体内膜和H+-ATPa se的化学结构发生不利于酶活性的变化，如膜磷脂水解、膜流动性下降，膜内游离脂肪酸含 量增加[5]，脂质过氧化以及LPS的直接作用等，使膜完整性破坏，或者引起酶构 象变化、亚基结构受损，致ATP酶活性进行性下降。本实验发现，内毒素注射早期(1 h)MDA 含量就显著升高，晚期(8 h)非常显著升高，为对照组的1.79倍(P<0.01)。线粒体是 氧自 由基产生的主要部位，其本身又极易受氧自由基的损伤。脂质过氧化产物可以引起膜脂和膜 蛋白发生交联，致膜脂质和膜蛋白之间的内聚，膜脂链缩短，膜流动性下降[6]。 因此，我们认为脂质过氧化是内毒素休克时影响线粒体H+-ATPase活性的重要因素。
, 百拇医药
[参考文献]
[1]Lippe G,Sorgato MC,Harris DA.Kinetics of the release of the mitochon drial inhibition protection protein:correlation with synthesis and hydrolysis of ATP[J].Biochem Biophys Acta,1988,933:1.
[2]Beauseigneur F,Coubern,Mchapey MF,et al.F0F1-ATPase,early taarge t of radical initiator 2,2-azohis-(2-amidinopropance)dihydrochloride in rat live r mitochondria in vitro[J].Biochem J,1996,320:571.
, http://www.100md.com
[3]Iwata S,Tanak APT,Olawa K.Alternation in the proton ATPase activity of rat liver mitochondria after hemorrhaggic shock[J].J Lab Clin Med,1992,120: 420.
[4]朱世军，王孝铬，僬选茂，等.氧自由基产生体系及丹参素对大鼠心肌线粒体 质子ATP酶水解、合成活性的影响[J].中国病理生理杂志，1995，11：42.
[5]Lanza-Jacoby S,Feagans K,Tabares A.Fatty acid metabolism in the hear t during Escherichia Coli sepsis in rats[J].Circ Shcok,1989,29:361.
[6]Geron-Gelle J,Zwizinski CW,Schmid HH.Peroxidative damage to cardiac mitochondria[J].Arch Biochem Biophys,1994,315:1.
[收稿：2000-03-01]
, http://www.100md.com
单位：第三军医大学第三附 属医院野战外科研究所，重庆 400042
关键词：内毒素；线粒体；H+-ATP酶；FeSO4；VitC；脂质过氧化
中国急救医学001204 [摘 要]目的 本研究旨在探讨内毒素休克时肝线粒体H+-ATP酶和脂质 过氧化的改变。方法 成年健康Wistar大鼠80只，随机分为内毒素 注射前、内毒素注射后1、3、5、8 h组及其对照组；予各组相应时相点活杀取肝组织制备线 粒体，测定线粒体H+-ATP酶、MDA及血浆MDA含量。离体实验采用正常鼠肝线粒体和不同剂 量的氧自由基生成剂(FeSO4/VitC)共同孵育后，测量H+-ATP酶活性。结果 内毒素休克早期线粒体H+-ATP酶活性升高，3 h时其酶活性升高15.6%，8 h 时降至对照组的65%。内毒素休克早期肝线粒体MDA含量就显著增高，随着休克时间延长而加 重，8 h时为对照组的1.79倍。离体实验显示，小剂量FeSO4/VitC引起的H+-ATP酶活性 升高，大剂量引起H+-ATP酶活性下降，和在体实验结果平行。结论 内毒素休克早期H+-ATP酶升高，晚期H+-ATP酶活性降低。内毒素休克时脂质过氧化 物进行性增加，脂质过氧化可能是H+-ATP酶下降的重要原因。
, 百拇医药
[中图分类号] R 364.14 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)12-0699-02
Changes of H+-ATPase and LPO of liver metochondria in endotoxic shock rats
LIU Jian-cang,LU Song-min,YANG He-ming, et al.
(Research Institute of Sur gery,the Third Militory Medical University,Chongqing 400042,China)
[Abstract]Objective To investigate the changes of mitochondria H +-ATPase,Lipid peroxide(LPO) in endotoxic shock.Methods 80 healthy adult wistar rats were divided into ten groups:pre-injection group,and 1 , 3,5,8 hours after injection endotoxin and control groups respectively.The liver tissue samples were used for preparation of mitochondria.The H+-ATPase of mito chondria and plasma MDA were assayed.The mitochondria of liver cell was incubate d with different concentration of FeSO4/VitC,the H+-ATPase activity was assa yed.Results The mitochondrial H+-ATPase activity at the e a rly stage of endotoxic shock was significantly increased,at 3 h after inject ion E Coli H+-ATPase were elevated to 15.6% of control level(P<0.05).How ever it was significantly decreased at the later stage of endotoxic shock(P <0.0 1).At 8 h after injection of E Coli H+-ATPase lowed to 65%of contral level.Mit ochondria MDA,plasma MDA content at the early stage of endotoxic shock were sign ificantly increased than control level.MDA gradually elevated after injection of E Coli.MDA content at 8 h after injection E Coli was 1.79 times as much as cont r ol level.The result of experiments in vitro indicated:the mitochondrial H+-ATP ase activity was significantly changed with concentration of FeSO4/VitC.When concentration of FeSO4/VitC was lower the H+-ATPase activity was elevented, and the concentrantion of FeSO4/VitC was higher the H+-ATPase activity was d eclined.The results in vitro was paralleled with results in vito.Conc lusion The H+-ATPase activity was elevated at the early stage of end otoxic shock,and lowered at the later stage.Lipid peroxidate contents were progr essively rosed.The increasment of LPO may be the cause of H+-ATPase activity r eduction.
, 百拇医药
[Key words] Endotoxin shock; Mitochondria; H+-ATPase; FeSO4/V itC; Lipid peroxidate
呼吸链末端H+-ATPase，又称为F0F1-ATP合成酶，是ATP合成的关键酶。它由F0、F 1、F0F1连接部OSCP(Oligomycin Sensitivity-conffering protein)组成，兼有ATP 合成和水解双重功能。有证据提示，ATP水解和合成可能是在同一催化中心，只是因构象不 同而表现为合成或水解特性[1]。H+-ATPase比其它呼吸复合体更容易受损 [2]，是影响休克预后的重要因素[3]。本文采用内毒素休克模型，探讨肝线 粒体H+-ATPase活性及其脂质过氧化的关系。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康成年Wistar大鼠80只，体重250±50 g，雌雄不拘，随机分为 内毒素注射前及注射后1、3、5、8 h和对照组共10个小组，每小组8只，实验前禁食过夜， 自由饮水。3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定，气管插管和右颈动脉插管(监测血 压)，全身肝素化(500 U/kg)。内毒素休克组于尾静脉注射大肠杆菌内毒素5 mg/kg；对照组 于尾静脉注射生理盐水1 ml/kg。各组动物分别于相应时相点断头活杀取肝组织制备肝细胞 线粒体，测定线粒体H+-ATPase酶、MDA及血浆MDA含量。离体实验采用正常肝线粒体(0.2 mg/ml)和不同浓度的氧自由基生成剂FeSO4/VitC(0/0、5/150、10/300、20/600 、30/900、90/1 800 μmol/L)共同孵育(30℃，30 min)后，测定H+-ATPase活性。
, 百拇医药
1.2 肝线粒体的制备 采用差速离心法制备线粒体；定磷法测定H+-ATPase活性[ 4]。按广州暨南大学医学院病理生理教研室的MDA试剂盒说明书测定MDA含量。Lowrry法 测定蛋白。
2 结果
2.1 在体实验结果
2.1.1 平均动脉压(MAP) 动物注射大肠杆菌内毒素后即刻，平均动脉压降至9.58±1. 26 kPa，与注射前差异非常显著(P<0.01)。此后血压缓慢回升，3 h后又开始下降，8 h时为同时相对照组的53.96%(P<0.001)。见表1。
表1 内毒素休克大鼠平均动脉压(MAP)的变化(kPa) Time(h)
0
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1
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Control group
14.55±1.33
14.51±1.57
13.35±1.55
13.62±1.22
12.32±1.68
ET group
14.63±1.40
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9.58±1.26*
11.14±1.60*
10 .54±1.19*
7.83±1.47**
*P<0.05，与对照组比差别显著；**P<0.01，与对照组比差别非常显著
2.1.2 肝线粒体膜H+-ATPase水解活性 内毒素休克组早期线粒体膜H+-ATPase活性 升高，3 h时其酶活性升高15.6%(P<0.05)。8 h时降至对照组的65%(P<0.05) 。见表2。
表2 内毒素休克大鼠肝线粒体膜H+-ATPase
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活性的变化[μmo l/(mg.min)] Time(h)
0
1
3
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Control group
1.992±0.127
2.023±0.133
1.980 ±0.143
1.947±0.139
2.063±0.133
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ET group
2.006±0.141
2.116±0.167
2.290±0.151*
1.937±0.05 8
1.740±0.125**
*P<0.05，与对照组比差别显著；**P<0.01，与对照组比差别非常显著
2.1.3 肝线粒体膜MDA含量的变化 内毒素休克早期线粒体MDA含量就显著增高(P<0 .05 )，随着休克时间延长而加重。5 h后呈非常显著增高，8 h时为对照组的1.79倍(P<0 .01)。见表3。
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表3 内毒素休克大鼠肝线粒体膜脂质过氧化物
MDA含量的变化(n mol/mg) Time(h)
0
1
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8
Control group
6.065±0.744
6.141±0.826
5.463 ±0.552
5.463±0.876
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6.285±1.071
ET group
5.984±0.626
9.962±1.763*
9.304±2.370 **
12.642±2.636**
11.285±2.672**
*P<0.05，与对照组比差别显著；**P<0.01，与对照组比差别非常显著
2.2 离体实验结果
, 百拇医药 2.2.1 不同浓度FeSO4/VitC对肝线粒体H+-ATPase活性的影响 小剂量FeSO4/VitC (10/30 μmol/L与线粒体孵育后H+-ATPase活性显著提高(P<0.05)，而当FeSO4/V itC浓度为90/1 800 μmol/L时，H+-ATPase活性降为原来的69%(P<0.01)。见表4。
表4 不同浓度FeSO4/VitC(μmol/L)对肝线粒体
H+-ATPase 活性[μmol/(mg.min)]的影响 FeSO4/VitC
0/0
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10/300
20/600
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90/1800
H+-ATPase
1.98±0.01
2.16±0.05
2.19± 0.40*
1.82±0.13
1.45±0.27**
1.39±0.25* *
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*P<0.05，与对照组比差别显著；**P<0.01，与对照组比差别非常显著3 讨论
H+-ATPase比其它呼吸链复合体更容易受损，是影响休克预后的重要因素。Iwata等[ 3]报道，出血性休克1 h肝线粒体H+-ATPase活性下降48%，动物死亡 率与H+-ATPase活性相关。本实验发现，内毒素注射早期(3 h)H+-ATPase活力显著增高( P<0.05)，而晚期(8 h)显著降低(P<0.01)。脂质过氧化物却随休克的时间而进 行性升高 ，即早期氧自由基浓度小于晚期。而体外实验却证明小剂量自由基可使线粒体H+-ATPase 活性升高，而大剂量的自由基造成线粒体H+-ATPase活性下降。H+-ATPase随自由基剂量 的变化曲线与H+-ATPase和休克时相的变化曲线非常相似。提示氧自由基和H+-ATPase 改变高度相关。我们推测内毒素注射早期，由于ATP和H+的下降，对ATP酶起到负反 馈 调控作用，刺激ATP酶使其水解活性上升。随着休克的进一步加重，线粒体内膜和H+-ATPa se的化学结构发生不利于酶活性的变化，如膜磷脂水解、膜流动性下降，膜内游离脂肪酸含 量增加[5]，脂质过氧化以及LPS的直接作用等，使膜完整性破坏，或者引起酶构 象变化、亚基结构受损，致ATP酶活性进行性下降。本实验发现，内毒素注射早期(1 h)MDA 含量就显著升高，晚期(8 h)非常显著升高，为对照组的1.79倍(P<0.01)。线粒体是 氧自 由基产生的主要部位，其本身又极易受氧自由基的损伤。脂质过氧化产物可以引起膜脂和膜 蛋白发生交联，致膜脂质和膜蛋白之间的内聚，膜脂链缩短，膜流动性下降[6]。 因此，我们认为脂质过氧化是内毒素休克时影响线粒体H+-ATPase活性的重要因素。
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[参考文献]
[1]Lippe G,Sorgato MC,Harris DA.Kinetics of the release of the mitochon drial inhibition protection protein:correlation with synthesis and hydrolysis of ATP[J].Biochem Biophys Acta,1988,933:1.
[2]Beauseigneur F,Coubern,Mchapey MF,et al.F0F1-ATPase,early taarge t of radical initiator 2,2-azohis-(2-amidinopropance)dihydrochloride in rat live r mitochondria in vitro[J].Biochem J,1996,320:571.
, http://www.100md.com
[3]Iwata S,Tanak APT,Olawa K.Alternation in the proton ATPase activity of rat liver mitochondria after hemorrhaggic shock[J].J Lab Clin Med,1992,120: 420.
[4]朱世军，王孝铬，僬选茂，等.氧自由基产生体系及丹参素对大鼠心肌线粒体 质子ATP酶水解、合成活性的影响[J].中国病理生理杂志，1995，11：42.
[5]Lanza-Jacoby S,Feagans K,Tabares A.Fatty acid metabolism in the hear t during Escherichia Coli sepsis in rats[J].Circ Shcok,1989,29:361.
[6]Geron-Gelle J,Zwizinski CW,Schmid HH.Peroxidative damage to cardiac mitochondria[J].Arch Biochem Biophys,1994,315:1.
[收稿：2000-03-01]
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