胶质细胞源性神经营养因子在神经系统损伤后表达变化意义
作者：宋海涛 沈强 贾连顺 王成海
单位：宋海涛(解放军第107中心医院骨科，山东烟台 264002)；沈强 贾连顺(第二军医大学附属长征医院)；王成海(第二军医大学神经科学研究所)
关键词：
中国矫形外科杂志001217 中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)12-1199-03
[ CX2〗近二十年的研究表明，中枢神经损伤后具有可塑性，也能再生；并且在神经营养因子(NTFs) 作用下再生速度及质量都有显著增强[1～3]，因而NTFs与神经系统损伤修复的研 究已 成为神经科学研究领域的一个“热点”。胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell linederi ved neurotrophic factor,GDNF)是新近(1993)发现并已克隆其基因的一种蛋白质，由于它 的氨基酸残基的构象与转化生长因子(TGF-β)超家族成员相同，而且其序列中有近20%的同 源性，从结构上看属于TGF-β超家族远亲[4]。
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通过分子杂交、RNase保护分析及RT-PCR等方法，研究GDNF在体内的表达趋势，发现GDNF神 经损伤后其靶器官及损伤区域GDNF表达增加，提示损伤神经元对GDNF的需求增加，可能是损 伤神经元自我保护的一种形式。由于外源性NTFs对运动神经元损伤及疾病可能有重要的治疗 作用，因而它倍受神经生物学家与神经伤病学家的重视。
1 GDNF的生物学功能
最早发现GDNF的功能是使体外培养的鼠胚中脑腹侧DA能神经元存活延长[4]，是目 前特异性最强的多巴胺(DA)能NTF，对离体、在体交感、感觉神经元的存活起促进作用。对 离体培养的运动神经元助存活的50%有效浓度(EC50)为BDNF的1/75、CNTF的1/650及 白细胞抑制因子(LIF)的1/2?500[7]。在新生鼠面神经损伤模型中，损伤后使用N TFs可提高运动神经元的存活率，CNTF由19%增加到76%，BDNF由13%增至47%，NT-3从13%增 至28%，NT-4/5则从28%增至70%，而GDNF却由6%增至100%[8，9]。实验表明，GDNF 对运动神经元的损伤有显著的修复功能：切断稚鸡面神经，可使脑核团中90%运动神经元死 亡，少数存活的神经元也萎缩；若在断端加入GDNF，则可使几乎全部运动神经元存活[ 10]。Oppenheim的实验还表明，切断新生鼠脊髓运动神经元，可使脊髓中40%～50%相应 运动神经元死亡，存活者也呈现萎缩；在断端加入GDNF则可有效阻止神经元死亡和萎缩，存 活神经元胞体还有一定程度增大[11]。GDNF对外周神经元的影响有限，不能促进三 叉感觉或交感神经元的存活；但用GDNF处理胚胎发育期的交感神经元，可以增加交感神经节 内神经元的数目，说明GDNF能保护这些神经元免遭细胞程序化死亡[10]。
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2 GDNF的表达及神经损伤对表达的影响
2.1GDNF在中枢神经系统的表达及损伤对表达的影响
对大鼠不同发育阶段GDNFmRNA分布的检测发现，许多接受GDNF营养作用的神经元的靶组织一 般都表达GDNFmRNA。在鼠胚发育过程中，纹状体表达GDNFmRNA是中枢神经系统中最高的，脊 髓也呈高水平表达(在Clarke柱及脊髓背侧角)；小脑原基、丘脑、间脑、端脑及脑干低表达 ；出生后中枢神经系统GDNFmRNA表达显著下降，成年大鼠则表达甚微。Pochon观察GDNF在成 年大鼠脑内表达，发现GDNFmRNA主要表达在神经元，大多数多巴胺能神经元表达GDNF，它还 广泛表达在皮质、海马、纹状体、黑质、丘脑、小脑及脊髓，但表达量各区域差异较大，这 提示在应用GDNF治疗Parkinson病时，需被限制在病变区域以避免可能的副作用[21] 。Holstege研究明确GDNF在腰髓背角初级传入神经元的表达部位，发现GDNF高表达在Ⅰ和 Ⅱ层神经纤维及末梢，其它层中表达强度渐弱，一些神经节细胞也表达GDNF；背根切断之后 ，GDNF从背角消失；背根结扎后GDNF集聚在结扎侧神经节表面[14]。
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2.2 GDNF在周围神经的表达及损伤对表达的影响
在含有感觉神经元的背根及颈前神经节、坐骨神经的髓鞘中也有GDNFmRNA的表达，说明神经 元所处的局部也有GDNF生成，它们可能通过自泌或旁泌的方式作用于这些神经元。Bar首次 观察到在损伤的周围神经及从脊髓撕脱损伤的背根节中，GDNF及其受体Ret表达的数量及分 布。发现切断大鼠坐骨神经后，损伤神经远端较近端或未损伤神经表达明显高的GDNF水平； 在雪旺氏细胞及DRG神经元，特别是在小型及中型神经元中发现GDNFmRNA表达明显增加。背 根撕脱后表达GDNFmRNA的中型感觉神经元数量也明显增多，Ret表达被限制在DRG神经元及轴 突，而DRG细胞总数目无明显变化。结果提示GDNF在损伤神经和感觉神经节(特别是在中型感 觉神经元)生物活动中起重要作用[22]。Jongen研究表明，切断一侧坐骨神经，使G DNF在脊髓背角表达较健侧5d后减少40%，10d后减少超过80%，并持续100d。这种快速而强烈 的下降提示，GDNF表达主动的下调是由周围神经切断引起的[12]。Nosrat研究证实 ，GDNF在发育期骨骼肌的表达与对α运动神经元的营养活性有关[23]。
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衰老往往伴随有神经肌肉和感觉功能的衰退。普遍认为衰老的肌肉萎缩是神经源性的，同时 感觉的阈值增加，但罕见运动及感觉神经元数目增加，因为感觉和运动神经元的再生被由于 衰老而引起的轴突病变所打乱，在此过程中起作用的一个机制是衰老改变了神经营养因子的 信号传导。Bergman最近(1999)发现，在30月老龄大鼠脊髓运动神经元及初级感觉神经元中G FRα(GDNF家族受体)mRNA和类GFRα1蛋白的免疫活性增加，明确GDNF/DGRα1信号传导机制 是通过与c-ret原癌基因编码的酪胺酸激酶结合；此外老年大鼠神经元中c-ret mRNA表达 亦增加[21]。
2.3 GDNF在神经靶组织的表达
在许多神经靶组织、器官中也检测到GDNF的表达，有些表达甚至超过神经组织。在胚胎的肢 芽组织、肾脏、肺、睾丸、趾、胃和皮肤以及成体的肺、肝脏和卵巢均有较高水平的表达； 发育中的骨骼肌、肺、卵巢及肾上腺也呈低水平表达，在骨组织、心、脾及血液内也观察到 GDNFmRNA的存在[17，19，24]。Suzuki研究表明(Northern blot)，GDNFmRNA在人 体肌肉比大鼠肌肉有更高的表达，在肌浆膜附近、特别是在神经、肌肉接头区域表达最高， 在周围神经轴突及其包绕雪旺细胞的周围也可见其表达；RT-PCR结果还表明GDNFmRNA 表达 仅在肌肉，并不在人脊髓前角细胞。这些结果提示，GDNF是在肌肉中产生，在神经末梢被吸 收并沿轴突逆行转运，肌肉内GDNF可以作为靶源性神经营养因子被用来促进运动神经元存活 [25]。
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3 GDNF在肌萎缩侧索硬化(ALS)中表达
Yamamoto发现，在ALS病人中，腰髓GDNF mRNA与对照组相比明显增加；而在肌肉中则明 显降 低。脊髓中GDNF mRNA的增加，主要反映在病变严重的脊髓前角、前柱及侧柱，后柱及后角 病变较轻，增加也较少。GDNF mRNA在脊髓及肌肉表达趋势，与病理变化反映相一致[ 26]。Mitsuma对ALS病人脊髓中RET及GDNFα受体 mRNA数量进行研究，半定量RT-PCR结 果显示，RETmRNA在ALS病人脊髓前角运动神经元中减少至正常的1/5，而GDNFRα?mRNA却未 见变化；ISH结果表明，RETmRNA表达在脊髓前角运动神经元，而GDNFRα mRNA则广泛表达在脊 髓神经元及胶质细胞。用CCD图像分析系统检测各神经元RETmRNA水平，发现ALS病人脊髓神 经 元实际上都表达RETmRNA，只是表达的程度不同。在某一群萎缩的神经元中，可能发现相当 高水平的RETmRNA；而另一方面，ALS病人运动神经元GDNFRα mRNA水平与对照组却差别不大 。此外，RET蛋白在个体ALS病人运动神经元中也得到很好表达。结果提示，在ALS病人退神 经元中，GDNF受体表达持续在mRNA及蛋白水平，GDNF是治疗ALS的有效替代途径[27] 。
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4 GDNF及其受体表达的差异及其意义
最近发现，GDNF是通过一个多亚单位受体来传递信号、调制其功能，它由一个组合配体亚单 位(GDNFRα)和一个传导信号的酪胺酸酶亚单位Ret组成。ISH方法观察大鼠CNS中GDNF受体mR NA的表达部位，发现GDNFRα和c-ret mRNA表达在黑质及腹部tegmental区域和DA神经元以 及 脊髓前角和脑干核神经元。表达区域包括脊髓腹角的α神经元及舌下、三叉、外展神经核的 神经元；在黑质喙突c-ret mRNA不表达，而GDNFRα则在许多脑部结构中表达(包括海马、 皮层、膝状节和松果体)。结果说明，c-ret及GDNFRα mRNA在神经元内的表达使GDNF作为 靶源性神经营养因子对运动神经元提供进一步营养支持；而GDNFRα mRNA在检测不到c-ret mRNA的脑内区域表达，表明只有GDNFRα利用信号传递分子或其它类GDNF配体利用GDNFRα 作为受体而发挥作用[28]。Naveilhan观察了成年大鼠GDNF及其受体的表达，在无 神经损伤的大鼠中，GDNFmRNA表达在神经、GDNFRα?mRNA表达在神经和脊髓；而Ret却只限 制 在脊髓运动神经元表达。坐骨神经损伤后，在损伤部位远端GDNF mRNA表达快速增加，而后 肌肉表达增加；而GDNFRα?mRNA仅在断面的远端轻度上调，但其近端及脊髓无变化。坐 骨神 经切断也导致Ret mRNA表达快速增加，但增加仅发现在脊髓运动神经元和背根节神经元。表 明GDNF对成年大鼠运动神经元再生起重要作用[29]。Ret和GFRα受体(包括GFRα1 、GFRα2和新近发现的GFRα3)可以存在于相同组织内或分别单独表达在投射区及靶组织， 提示在体内Ret和α受体之间存在两种不同模式的相互作用。首先，Ret可能与表达在同一细 胞的α受体相互作用(“in cis”)，例如在黑质、背根节、脊髓、肾脏和肠的神经元；第二 ，Ret可以与位于靶神经元内的α受体起作用(横向作用)；另外还发现体外GFRα1能调节Ret 活性。这些发现证明，GDNF及其相关因子(Neurturin)促进不同神经元的存活依赖于Ret和α 受体之间多机制的相互作用[30]。
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作者简介：宋海涛(1964-)，男，主治医师，医学硕士。研究 方向：脊柱脊髓损伤。电话：(0535)6531424-33348
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(收稿：2000-05-19 修回：2000-09-02), 百拇医药
单位：宋海涛(解放军第107中心医院骨科，山东烟台 264002)；沈强 贾连顺(第二军医大学附属长征医院)；王成海(第二军医大学神经科学研究所)
关键词：
中国矫形外科杂志001217 中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)12-1199-03
[ CX2〗近二十年的研究表明，中枢神经损伤后具有可塑性，也能再生；并且在神经营养因子(NTFs) 作用下再生速度及质量都有显著增强[1～3]，因而NTFs与神经系统损伤修复的研 究已 成为神经科学研究领域的一个“热点”。胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell linederi ved neurotrophic factor,GDNF)是新近(1993)发现并已克隆其基因的一种蛋白质，由于它 的氨基酸残基的构象与转化生长因子(TGF-β)超家族成员相同，而且其序列中有近20%的同 源性，从结构上看属于TGF-β超家族远亲[4]。
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通过分子杂交、RNase保护分析及RT-PCR等方法，研究GDNF在体内的表达趋势，发现GDNF神 经损伤后其靶器官及损伤区域GDNF表达增加，提示损伤神经元对GDNF的需求增加，可能是损 伤神经元自我保护的一种形式。由于外源性NTFs对运动神经元损伤及疾病可能有重要的治疗 作用，因而它倍受神经生物学家与神经伤病学家的重视。
1 GDNF的生物学功能
最早发现GDNF的功能是使体外培养的鼠胚中脑腹侧DA能神经元存活延长[4]，是目 前特异性最强的多巴胺(DA)能NTF，对离体、在体交感、感觉神经元的存活起促进作用。对 离体培养的运动神经元助存活的50%有效浓度(EC50)为BDNF的1/75、CNTF的1/650及 白细胞抑制因子(LIF)的1/2?500[7]。在新生鼠面神经损伤模型中，损伤后使用N TFs可提高运动神经元的存活率，CNTF由19%增加到76%，BDNF由13%增至47%，NT-3从13%增 至28%，NT-4/5则从28%增至70%，而GDNF却由6%增至100%[8，9]。实验表明，GDNF 对运动神经元的损伤有显著的修复功能：切断稚鸡面神经，可使脑核团中90%运动神经元死 亡，少数存活的神经元也萎缩；若在断端加入GDNF，则可使几乎全部运动神经元存活[ 10]。Oppenheim的实验还表明，切断新生鼠脊髓运动神经元，可使脊髓中40%～50%相应 运动神经元死亡，存活者也呈现萎缩；在断端加入GDNF则可有效阻止神经元死亡和萎缩，存 活神经元胞体还有一定程度增大[11]。GDNF对外周神经元的影响有限，不能促进三 叉感觉或交感神经元的存活；但用GDNF处理胚胎发育期的交感神经元，可以增加交感神经节 内神经元的数目，说明GDNF能保护这些神经元免遭细胞程序化死亡[10]。
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2 GDNF的表达及神经损伤对表达的影响
2.1GDNF在中枢神经系统的表达及损伤对表达的影响
对大鼠不同发育阶段GDNFmRNA分布的检测发现，许多接受GDNF营养作用的神经元的靶组织一 般都表达GDNFmRNA。在鼠胚发育过程中，纹状体表达GDNFmRNA是中枢神经系统中最高的，脊 髓也呈高水平表达(在Clarke柱及脊髓背侧角)；小脑原基、丘脑、间脑、端脑及脑干低表达 ；出生后中枢神经系统GDNFmRNA表达显著下降，成年大鼠则表达甚微。Pochon观察GDNF在成 年大鼠脑内表达，发现GDNFmRNA主要表达在神经元，大多数多巴胺能神经元表达GDNF，它还 广泛表达在皮质、海马、纹状体、黑质、丘脑、小脑及脊髓，但表达量各区域差异较大，这 提示在应用GDNF治疗Parkinson病时，需被限制在病变区域以避免可能的副作用[21] 。Holstege研究明确GDNF在腰髓背角初级传入神经元的表达部位，发现GDNF高表达在Ⅰ和 Ⅱ层神经纤维及末梢，其它层中表达强度渐弱，一些神经节细胞也表达GDNF；背根切断之后 ，GDNF从背角消失；背根结扎后GDNF集聚在结扎侧神经节表面[14]。
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2.2 GDNF在周围神经的表达及损伤对表达的影响
在含有感觉神经元的背根及颈前神经节、坐骨神经的髓鞘中也有GDNFmRNA的表达，说明神经 元所处的局部也有GDNF生成，它们可能通过自泌或旁泌的方式作用于这些神经元。Bar首次 观察到在损伤的周围神经及从脊髓撕脱损伤的背根节中，GDNF及其受体Ret表达的数量及分 布。发现切断大鼠坐骨神经后，损伤神经远端较近端或未损伤神经表达明显高的GDNF水平； 在雪旺氏细胞及DRG神经元，特别是在小型及中型神经元中发现GDNFmRNA表达明显增加。背 根撕脱后表达GDNFmRNA的中型感觉神经元数量也明显增多，Ret表达被限制在DRG神经元及轴 突，而DRG细胞总数目无明显变化。结果提示GDNF在损伤神经和感觉神经节(特别是在中型感 觉神经元)生物活动中起重要作用[22]。Jongen研究表明，切断一侧坐骨神经，使G DNF在脊髓背角表达较健侧5d后减少40%，10d后减少超过80%，并持续100d。这种快速而强烈 的下降提示，GDNF表达主动的下调是由周围神经切断引起的[12]。Nosrat研究证实 ，GDNF在发育期骨骼肌的表达与对α运动神经元的营养活性有关[23]。
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衰老往往伴随有神经肌肉和感觉功能的衰退。普遍认为衰老的肌肉萎缩是神经源性的，同时 感觉的阈值增加，但罕见运动及感觉神经元数目增加，因为感觉和运动神经元的再生被由于 衰老而引起的轴突病变所打乱，在此过程中起作用的一个机制是衰老改变了神经营养因子的 信号传导。Bergman最近(1999)发现，在30月老龄大鼠脊髓运动神经元及初级感觉神经元中G FRα(GDNF家族受体)mRNA和类GFRα1蛋白的免疫活性增加，明确GDNF/DGRα1信号传导机制 是通过与c-ret原癌基因编码的酪胺酸激酶结合；此外老年大鼠神经元中c-ret mRNA表达 亦增加[21]。
2.3 GDNF在神经靶组织的表达
在许多神经靶组织、器官中也检测到GDNF的表达，有些表达甚至超过神经组织。在胚胎的肢 芽组织、肾脏、肺、睾丸、趾、胃和皮肤以及成体的肺、肝脏和卵巢均有较高水平的表达； 发育中的骨骼肌、肺、卵巢及肾上腺也呈低水平表达，在骨组织、心、脾及血液内也观察到 GDNFmRNA的存在[17，19，24]。Suzuki研究表明(Northern blot)，GDNFmRNA在人 体肌肉比大鼠肌肉有更高的表达，在肌浆膜附近、特别是在神经、肌肉接头区域表达最高， 在周围神经轴突及其包绕雪旺细胞的周围也可见其表达；RT-PCR结果还表明GDNFmRNA 表达 仅在肌肉，并不在人脊髓前角细胞。这些结果提示，GDNF是在肌肉中产生，在神经末梢被吸 收并沿轴突逆行转运，肌肉内GDNF可以作为靶源性神经营养因子被用来促进运动神经元存活 [25]。
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3 GDNF在肌萎缩侧索硬化(ALS)中表达
Yamamoto发现，在ALS病人中，腰髓GDNF mRNA与对照组相比明显增加；而在肌肉中则明 显降 低。脊髓中GDNF mRNA的增加，主要反映在病变严重的脊髓前角、前柱及侧柱，后柱及后角 病变较轻，增加也较少。GDNF mRNA在脊髓及肌肉表达趋势，与病理变化反映相一致[ 26]。Mitsuma对ALS病人脊髓中RET及GDNFα受体 mRNA数量进行研究，半定量RT-PCR结 果显示，RETmRNA在ALS病人脊髓前角运动神经元中减少至正常的1/5，而GDNFRα?mRNA却未 见变化；ISH结果表明，RETmRNA表达在脊髓前角运动神经元，而GDNFRα mRNA则广泛表达在脊 髓神经元及胶质细胞。用CCD图像分析系统检测各神经元RETmRNA水平，发现ALS病人脊髓神 经 元实际上都表达RETmRNA，只是表达的程度不同。在某一群萎缩的神经元中，可能发现相当 高水平的RETmRNA；而另一方面，ALS病人运动神经元GDNFRα mRNA水平与对照组却差别不大 。此外，RET蛋白在个体ALS病人运动神经元中也得到很好表达。结果提示，在ALS病人退神 经元中，GDNF受体表达持续在mRNA及蛋白水平，GDNF是治疗ALS的有效替代途径[27] 。
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4 GDNF及其受体表达的差异及其意义
最近发现，GDNF是通过一个多亚单位受体来传递信号、调制其功能，它由一个组合配体亚单 位(GDNFRα)和一个传导信号的酪胺酸酶亚单位Ret组成。ISH方法观察大鼠CNS中GDNF受体mR NA的表达部位，发现GDNFRα和c-ret mRNA表达在黑质及腹部tegmental区域和DA神经元以 及 脊髓前角和脑干核神经元。表达区域包括脊髓腹角的α神经元及舌下、三叉、外展神经核的 神经元；在黑质喙突c-ret mRNA不表达，而GDNFRα则在许多脑部结构中表达(包括海马、 皮层、膝状节和松果体)。结果说明，c-ret及GDNFRα mRNA在神经元内的表达使GDNF作为 靶源性神经营养因子对运动神经元提供进一步营养支持；而GDNFRα mRNA在检测不到c-ret mRNA的脑内区域表达，表明只有GDNFRα利用信号传递分子或其它类GDNF配体利用GDNFRα 作为受体而发挥作用[28]。Naveilhan观察了成年大鼠GDNF及其受体的表达，在无 神经损伤的大鼠中，GDNFmRNA表达在神经、GDNFRα?mRNA表达在神经和脊髓；而Ret却只限 制 在脊髓运动神经元表达。坐骨神经损伤后，在损伤部位远端GDNF mRNA表达快速增加，而后 肌肉表达增加；而GDNFRα?mRNA仅在断面的远端轻度上调，但其近端及脊髓无变化。坐 骨神 经切断也导致Ret mRNA表达快速增加，但增加仅发现在脊髓运动神经元和背根节神经元。表 明GDNF对成年大鼠运动神经元再生起重要作用[29]。Ret和GFRα受体(包括GFRα1 、GFRα2和新近发现的GFRα3)可以存在于相同组织内或分别单独表达在投射区及靶组织， 提示在体内Ret和α受体之间存在两种不同模式的相互作用。首先，Ret可能与表达在同一细 胞的α受体相互作用(“in cis”)，例如在黑质、背根节、脊髓、肾脏和肠的神经元；第二 ，Ret可以与位于靶神经元内的α受体起作用(横向作用)；另外还发现体外GFRα1能调节Ret 活性。这些发现证明，GDNF及其相关因子(Neurturin)促进不同神经元的存活依赖于Ret和α 受体之间多机制的相互作用[30]。
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作者简介：宋海涛(1964-)，男，主治医师，医学硕士。研究 方向：脊柱脊髓损伤。电话：(0535)6531424-33348
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(收稿：2000-05-19 修回：2000-09-02), 百拇医药