脊髓损伤后一氧化氮合酶活性变化的动态观察及其基因表达
作者：赵立 李涛 贾连顺
单位：赵立 李涛(济宁医学院附属医院骨科， 山东济宁 272129)；贾连顺(上海长征医院骨科)
关键词：脊髓损伤；一氧化氮合酶；原位杂交
中国矫形外科杂志001216
摘要 目的：观察一氧化氮合酶在脊髓损伤中的变化及其 机制。方法：用液压致伤装置造成大鼠脊髓中、重度损伤，伤后不同时间分别测量损伤区NO S活性。结果：显示脊髓损伤后早期NOS活性一过性升高，而后又迅速降低，其升高、降低幅 度与损伤严重程度相一致，提示一氧化氮参与继发性脊髓损伤病理过程。NOSmRNA原位杂交 法，发现脊髓中度损伤后30min NOSmRNA的表达水平没有明显变化。结论：提示脊髓损伤早 期NOS活性增高主要由于刺激因素如钙离子等使没有发挥活性的NOS激活，使酶蛋白总量增加 引起的。
, 百拇医药
中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)12-1196-03
The Dynamically Changes of NOS Activity and Gene Expression of NOSm RNA after Different Degree Spinal Cord Injury
ZHAO Li, LI Tao, JIA L ian-shun
(Departhment of Orthopaedics, Afilliated Hospital of Jinning Medical Co llege Shandong province,272129)
Abstract Objective: Observe the change mechanism of Nit ric Oxide synthase (NOS) enzyme during spinal cord injury. Methods: Fluid -perc ussion model produced close spinal cord(T9) modest、 severe injury. During dif ferent time after spinal cord injury, NOS activity and the gene expression of NO SmRNA was measured. Results: The results indicated NOS activity increased signif icantly ten minutes after SCI, maximized at thirty minutes, then return to basel ine level quickly, the range of change related to the degree of SCI. It seems th at nitric oxide had role during secondary SCI. To thorough understand the change mechanism of NOS activity, we observed the gene expression of NOSmRNA by in sit u hybridization at 30min after spinal cord modest injury. The result of photomet ric analysis were 0.291±0.019(injuried group), 0.287±0.019(control group) resp ectively. The difference between them were not significant, P>0.05. Conclusion: The result pointed out that during early time of spinal cord injury, there was n ot new NOS protein synthetized, the cause of increasing of NOS activity was some factor activized the NOS which had not activity normally.
, 百拇医药
Key words Spinal cord injury Nitric oxide synthase(NO S) In situ hybridization
在中枢神经系统损伤中NO发挥着重要作用。作为血管舒张因子，可增加血流，改善血供，对 损伤组织产生保护作用。介导兴奋性氨基酸神经毒性，与氧自由基反应生成过氧化硝基阴离 子和羟自由基等又可破坏组织[1，2]。本文观察脊髓损伤后不同时间点NOS活性 变化的规律及其与脊髓损伤严重程度之间的关系，探讨NO在继发性脊髓损伤中的作用及意义 。并用原位杂交的方法对脊髓损伤后NOSmRNA表达情况进行分析。
1 材料与方法
1.1脊髓损伤模型的制备
健康雄性SD大鼠116只，体重(270±20)g。腹腔麻醉后，行颈动脉插管(PE-50)，固定在江 湾2型立体定位仪上。切除T9椎板，骨窗修剪成近圆形(直径0.4cm)，不损伤硬脊膜，连 接液压损伤装置，使椎管处于密闭状态，分别以1.5atm，2.3atm的冲击力量，造成脊髓中、 重度损伤。实验对照组仅切除椎板，暴露硬膜。
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1.2 动物分组
A部分(测酶活性)实验动物随机分组，每组8只，酶活性测定平行进行。
1组 对照组，暴露脊髓，不损伤。
2组 损伤后10min测酶活性。
3组 损伤后30min测酶活性。
4组 损伤后1h测酶活性。
5组 损伤后4h测酶活性。
6组 损伤后8h测酶活性。
7组 损伤后24h测酶活性。
B部分(NOSmRNA原位杂交)每组6只大鼠。
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1组 暴露脊髓，未损伤组。
2组 脊髓中度损伤后30min检查组。
1.3 动脉血气分析
根据测酶时间，于损伤后相应时间点，从颈动脉插管处抽取动脉血，检测血PO2、PCO 2、pH值，保持肛温稳定(37±1)℃。
1.4 NOS活性测定
脊髓不同程度损伤后10、30min、1、4、8、24h分别采用Bredt、Snyder方法[3]测 量损伤区NOS活性，取损伤区脊髓组织50mg，迅速置入含1mM EDTA,pH7.4的冰冻HEPES缓冲液 中(50mM，500μL)，超声震碎，匀浆，低温离心机(2?500rpm，4℃)离心5min，取上清液25μL加入100μL复合反应液中。复合反应液含HEPES(50mM)、EDTA(1mM)、β-NADPH(1mM)、C aCl2(1mM)、25μL 100mM[3H]L-arginine(1mCi)、1mMdithiothreitol、1 0μg钙调蛋白。37℃水浴箱内孵育15min，加入2ml反应液终止液(20mM HEPES，pH5.5，2mM EDTA)，将孵育液置入Dowex AG50X8(Na+型)离子交换树脂层析柱，以除去[3] H精氨酸，2ml蒸馏水洗脱，将流出液及洗脱液加入闪烁液中，用液体闪烁分光光度计(BECKM AN LS5?000CE)定量测出洗脱液中[3]H L-胍氨酸量。NOS活性以nmoL 胍氨 酸/mg蛋白/hr表示。蛋白质定量采用Bradford方法。
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1.5 NOS核酸分子原位杂交检查
大鼠腹腔麻醉后，开胸，4%多聚甲醛左心室灌注，取损伤段脊髓组织，4%多聚甲醛固定24h 后，置入含20%蔗糖的0.1MPBS中，待组织块下沉后捞出，流水冲洗30min，按常规作石蜡包 埋定位，切片厚3μm.NOScDNA探针采用随机引物法标记。将NOScDNA探针(2μg)离心→加 去离子水15μL→加六聚核苷酸混和物(dUTP2μL)+随机引物2μL+去离子水～19μL+聚合酶1 μL(dNTP labelingmixture)其反应体积20μL→37℃过夜→加2μL?0.2MEDTA(pH8.0)+2.5 μL?4MLiel+75μL预冷无水乙醇(-20℃)→过夜→离心12?000转/min×10min→去 上清液→加40μL?70%预冷乙醇(-20℃)30min→离心12?000转/min×10min→去上清液，37 ℃吹干(无菌)+50μL?TE)(Triton-EDTA)溶解→4℃保存备用。组织片预处理后，杂交液(2 5μL/张)放入50%甲酰胺湿盒中，置于37℃杂交过夜(cDNA-RNA)，洗涤及显色，阴性对照， 省去标记探针或加未标记的探针作阴性对照。
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随机选各组染色的切片各12张，用真彩色医学图像分析系统，于放大400倍下对各标本进行 定量分析。
1.6 统计学处理
实验组间、实验组与对照组间分析采用t检验。
2 结 果
2.1血气分析
对照组：PO214±2kPa，PCO25±1.2kPa，pH7.35～7.45。中、重度脊髓损伤组各时间 点血气分析结果差异不显著，与对照组基本一致。各损伤组内各不同时间点血气分析结果也 无明显差异。仅重度损伤组，损伤后8hPCO2稍有增高。但差异无统计学意义(见表1)。
表1 损伤后各时间点血气分析结果 时间
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中度损伤组
重度损伤组
pH
PO2(kPa)
P CO2(kPa)
pH
PO2(kPa)
PCO2(kPa)
10min
7.37
13.8
, http://www.100md.com 4.80
7.35
14.2
4.8
30min
7.40
14.2
5.20
7.36
14.5
4.4
60min
7.38
, http://www.100md.com
14.4
4.83
7.35
13.9
5.3
4h
7.34
13.9
4.95
7.41
14.3
5.5
8h
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7.36
14.0
5.15
7.42
14.0
6.0
24h
7.36
14.7
5.27
7.38
15.2
5.2
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2.2 一氧化氮合酶活性变化
伤后不同时间点中、重度损伤组NOS活性变化趋势基本一致，以重度损伤组的变化幅度更为 明显。两组在损伤后10、30min、8h的差异具统计学意义(P<0.05)。损伤后10min 2组NO S活性明显升高，中度损伤组为脊髓未损伤组的1.63倍，重度损伤组为1.90倍，此后继续升 高，30min达高峰，分别为1.93倍、2.49倍，与对照组差异显著(P<0.05)。重度损伤差 异非常显著(P<0.01)。尔后骤然下降，伤后1、4、8h低于正常水平，但与对照组之间差 异不显著(P>0.05)。24h中度损伤组接近正常水平，重度损伤组仍低于正常水平(见图1 )。
实验组(中度损伤后30min)和未损伤组脊髓组织细胞中均有杂交阳性信号，呈蓝黑色，分布 特 点同NOS免疫组织化学所见相近似，主要集中在中央管周围及背角浅层，阴性对照为免疫反 应阴性，图像分析结果示实验组光密度值为0.291±0.019，对照组光密度值0.287±0.019， 二者间差异不显著(P>0.05)。
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图1 脊髓损伤后一氧化氮合酶活 性变化(倍)
□中度损伤组 ■重度损伤组
3 讨 论
根据功能NOS分为原生型(cNOS)和诱生型(iNOS)。生理条件下，cNOS存在于多种细胞内，产 生 微量NO，cNOS依赖钙、钙调蛋白。细胞内Ca++浓度稍有增高，尤其NMDA受体兴奋引起 的钙内流，可使其活性提高。在免疫刺激，细胞因子，创伤缺血等条件下，巨噬细胞、中性 粒细胞、神经胶质细胞及神经元等可表达iNOS，后者不依赖钙、钙调蛋白，一旦产生，便可 持续大量生成NO[4]。由于iNOS形成需历经cDNA转录、翻译、新蛋白合成等一系列 复杂过程，所以一般认为脊髓损伤早期NOS活性改变主要由cNOS引起。本实验观察到，脊髓 损伤后10min，NOS活性明显增高，30min达高峰。然后迅速下降，伤后1、4h持续低于正常水 平。其中以重度损伤组升高或降低的幅度更为明显。这是由于脊髓损伤后，兴奋性氨基酸( 尤其是谷氨酸)大量释放[5]，过度刺激N-甲基门冬氨酸(NMDA)受体，使受体依赖 Ca++通道开放，同时由于损伤后神经元广泛去极化，电压依赖钙通道亦开放，导致钙 离子大量流入细胞内，使细胞内钙离子浓度骤然增高，增加钙/钙调蛋结合，激活NOS。另外 ，由于局部组织破坏，血供减少，能量代谢阻碍，ATP生成减少，可使NOS去磷酸化，恢复活 性。因此，在损伤后短时间内导致NOS活性增加，NO爆发生成。然而过量生成的NO，不仅可 使NOS上巯基氧化，使酶失活，亦可作用于NMDA受体巯基氧化还原调定部位，致受体活性下 降，钙内流减少，同时损伤区一些激活的肽酶如细胞内蛋白激酶c、钙/钙调蛋白依赖性蛋白 激酶，cGMP依赖性蛋白酶等，可使NOS磷酸化，抑制其活性。此外，NOS发挥活性，需大量还 原性辅因子(如NADPH等)，其反应产物NO，又具高氧化特性，故随着大量NO生成，还原性辅 因子大量消耗，也使NOS活性下降。所以在脊髓损伤后早期出现一过性NOS活性骤然增加、骤 然降低，NO短时间内大量生成这一病理现象。有的学者发现脊髓缺血损伤后8h，损伤区有iN OS表达，而我们的测试体系仅是针对原生型NOS设计的，不能反映iNOS活性。重度损伤组1h 后各时间点NOS活性均低于正常，可能与组织破坏严重有关。本实验采用NOSmRNA原位杂交技 术，发现脊髓中度损伤前、后NOSmRNA表达强度没有明显变化，提示脊髓损伤30min，NOS活 性明显增高的机理可能主要是由于损伤而致的一些刺激因素，如细胞内钙离子浓度增高等， 使生理状态下，没有活性的酶蛋白激活，而不是通过基因表达增强，酶蛋白合成增加这一途 径。
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实验结果显示随着脊髓损伤程度加重，损伤早期NOS活性相应增加，提示NO可能与脊髓损伤 后的继发性损害有着密切关系。NO在正常大鼠脊髓血液循环调节中具有重要作用，而脊髓遭 受损伤后，常引起局部组织缺血，故脊髓损伤后早期NO的大量生成，可看作是机体的一种自 我保护反应。因NO可松驰血管平滑肌、抑制血小板聚集与粘附、增加损伤区及其周围血供、 对抗损伤所致的血管和痉挛、血流下降，从而起到组织保护作用，但短时间内过量NO生成， 又 可介导兴奋性氨基酸神经毒性，与超氧阴离子(O-2)反应，形成毒性很强的过氧化硝基 阴离子(OONO-)和羟自由基(OH-)引起广泛的脂质过氧化及蛋白质酪氨酸硝基化反应，与 细胞内许多酶的铁硫中心结合，破坏线粒体电子传递体系和柠檬酸循环，抑制靶细胞氧化呼 吸，干扰DNA双链，影响其转录翻译等，促使细胞死亡，产生组织损害[6]。
本课题获山东省卫生厅青年科技基金资助
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作者简介：赵立(1966-)，男，山东济宁市人，医学 博士。研究方向：脊柱脊髓损伤。电话：(0537)2903003 E-mail:Zhaoliwz@public.jiptt .sd.cn
参考文献：
〔1〕 Zhang J, Snydr SH.Nitric oxide in the nervous system[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol,1995,35:213～233.
〔2〕 Toda N, Okamura T.Role of nitric oxide in neurally induced cerebroarterial relaxation[J]. J Pharmacol Exp Ther,1991,258:1?027～1?032.
〔3〕 Bredt DS, Snyder SH.Isolation of nitric oxide synthase, a c almodulin-requiring enzyme[M]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87:682～685.
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〔4〕 Induction of Cu/Zn superoxide dismutas-and nitric oxide sy nthase-like immunoreactivities in rabbit spinal cord after transient ischemia[ M]. Brain Research, 1996,732:69～74.
〔5〕 Dawson VL, Dawson TM, London ED, et al. Nitric oxide mediat es glutamate neurotoxicity in primary cortical culture[M]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:6?368～6?371.
〔6〕 Zhang J, Dawon VL, Dawon TM, et al. Nitric oxide activation of poly(ADP-ribose) synthetase in neurotoxicity[M]. Science, 1994,263:687～ 689.
(收稿：2000-02-22 修回：2000-04-25), 百拇医药
单位：赵立 李涛(济宁医学院附属医院骨科， 山东济宁 272129)；贾连顺(上海长征医院骨科)
关键词：脊髓损伤；一氧化氮合酶；原位杂交
中国矫形外科杂志001216
摘要 目的：观察一氧化氮合酶在脊髓损伤中的变化及其 机制。方法：用液压致伤装置造成大鼠脊髓中、重度损伤，伤后不同时间分别测量损伤区NO S活性。结果：显示脊髓损伤后早期NOS活性一过性升高，而后又迅速降低，其升高、降低幅 度与损伤严重程度相一致，提示一氧化氮参与继发性脊髓损伤病理过程。NOSmRNA原位杂交 法，发现脊髓中度损伤后30min NOSmRNA的表达水平没有明显变化。结论：提示脊髓损伤早 期NOS活性增高主要由于刺激因素如钙离子等使没有发挥活性的NOS激活，使酶蛋白总量增加 引起的。
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中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)12-1196-03
The Dynamically Changes of NOS Activity and Gene Expression of NOSm RNA after Different Degree Spinal Cord Injury
ZHAO Li, LI Tao, JIA L ian-shun
(Departhment of Orthopaedics, Afilliated Hospital of Jinning Medical Co llege Shandong province,272129)
Abstract Objective: Observe the change mechanism of Nit ric Oxide synthase (NOS) enzyme during spinal cord injury. Methods: Fluid -perc ussion model produced close spinal cord(T9) modest、 severe injury. During dif ferent time after spinal cord injury, NOS activity and the gene expression of NO SmRNA was measured. Results: The results indicated NOS activity increased signif icantly ten minutes after SCI, maximized at thirty minutes, then return to basel ine level quickly, the range of change related to the degree of SCI. It seems th at nitric oxide had role during secondary SCI. To thorough understand the change mechanism of NOS activity, we observed the gene expression of NOSmRNA by in sit u hybridization at 30min after spinal cord modest injury. The result of photomet ric analysis were 0.291±0.019(injuried group), 0.287±0.019(control group) resp ectively. The difference between them were not significant, P>0.05. Conclusion: The result pointed out that during early time of spinal cord injury, there was n ot new NOS protein synthetized, the cause of increasing of NOS activity was some factor activized the NOS which had not activity normally.
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Key words Spinal cord injury Nitric oxide synthase(NO S) In situ hybridization
在中枢神经系统损伤中NO发挥着重要作用。作为血管舒张因子，可增加血流，改善血供，对 损伤组织产生保护作用。介导兴奋性氨基酸神经毒性，与氧自由基反应生成过氧化硝基阴离 子和羟自由基等又可破坏组织[1，2]。本文观察脊髓损伤后不同时间点NOS活性 变化的规律及其与脊髓损伤严重程度之间的关系，探讨NO在继发性脊髓损伤中的作用及意义 。并用原位杂交的方法对脊髓损伤后NOSmRNA表达情况进行分析。
1 材料与方法
1.1脊髓损伤模型的制备
健康雄性SD大鼠116只，体重(270±20)g。腹腔麻醉后，行颈动脉插管(PE-50)，固定在江 湾2型立体定位仪上。切除T9椎板，骨窗修剪成近圆形(直径0.4cm)，不损伤硬脊膜，连 接液压损伤装置，使椎管处于密闭状态，分别以1.5atm，2.3atm的冲击力量，造成脊髓中、 重度损伤。实验对照组仅切除椎板，暴露硬膜。
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1.2 动物分组
A部分(测酶活性)实验动物随机分组，每组8只，酶活性测定平行进行。
1组 对照组，暴露脊髓，不损伤。
2组 损伤后10min测酶活性。
3组 损伤后30min测酶活性。
4组 损伤后1h测酶活性。
5组 损伤后4h测酶活性。
6组 损伤后8h测酶活性。
7组 损伤后24h测酶活性。
B部分(NOSmRNA原位杂交)每组6只大鼠。
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1组 暴露脊髓，未损伤组。
2组 脊髓中度损伤后30min检查组。
1.3 动脉血气分析
根据测酶时间，于损伤后相应时间点，从颈动脉插管处抽取动脉血，检测血PO2、PCO 2、pH值，保持肛温稳定(37±1)℃。
1.4 NOS活性测定
脊髓不同程度损伤后10、30min、1、4、8、24h分别采用Bredt、Snyder方法[3]测 量损伤区NOS活性，取损伤区脊髓组织50mg，迅速置入含1mM EDTA,pH7.4的冰冻HEPES缓冲液 中(50mM，500μL)，超声震碎，匀浆，低温离心机(2?500rpm，4℃)离心5min，取上清液25μL加入100μL复合反应液中。复合反应液含HEPES(50mM)、EDTA(1mM)、β-NADPH(1mM)、C aCl2(1mM)、25μL 100mM[3H]L-arginine(1mCi)、1mMdithiothreitol、1 0μg钙调蛋白。37℃水浴箱内孵育15min，加入2ml反应液终止液(20mM HEPES，pH5.5，2mM EDTA)，将孵育液置入Dowex AG50X8(Na+型)离子交换树脂层析柱，以除去[3] H精氨酸，2ml蒸馏水洗脱，将流出液及洗脱液加入闪烁液中，用液体闪烁分光光度计(BECKM AN LS5?000CE)定量测出洗脱液中[3]H L-胍氨酸量。NOS活性以nmoL 胍氨 酸/mg蛋白/hr表示。蛋白质定量采用Bradford方法。
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1.5 NOS核酸分子原位杂交检查
大鼠腹腔麻醉后，开胸，4%多聚甲醛左心室灌注，取损伤段脊髓组织，4%多聚甲醛固定24h 后，置入含20%蔗糖的0.1MPBS中，待组织块下沉后捞出，流水冲洗30min，按常规作石蜡包 埋定位，切片厚3μm.NOScDNA探针采用随机引物法标记。将NOScDNA探针(2μg)离心→加 去离子水15μL→加六聚核苷酸混和物(dUTP2μL)+随机引物2μL+去离子水～19μL+聚合酶1 μL(dNTP labelingmixture)其反应体积20μL→37℃过夜→加2μL?0.2MEDTA(pH8.0)+2.5 μL?4MLiel+75μL预冷无水乙醇(-20℃)→过夜→离心12?000转/min×10min→去 上清液→加40μL?70%预冷乙醇(-20℃)30min→离心12?000转/min×10min→去上清液，37 ℃吹干(无菌)+50μL?TE)(Triton-EDTA)溶解→4℃保存备用。组织片预处理后，杂交液(2 5μL/张)放入50%甲酰胺湿盒中，置于37℃杂交过夜(cDNA-RNA)，洗涤及显色，阴性对照， 省去标记探针或加未标记的探针作阴性对照。
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随机选各组染色的切片各12张，用真彩色医学图像分析系统，于放大400倍下对各标本进行 定量分析。
1.6 统计学处理
实验组间、实验组与对照组间分析采用t检验。
2 结 果
2.1血气分析
对照组：PO214±2kPa，PCO25±1.2kPa，pH7.35～7.45。中、重度脊髓损伤组各时间 点血气分析结果差异不显著，与对照组基本一致。各损伤组内各不同时间点血气分析结果也 无明显差异。仅重度损伤组，损伤后8hPCO2稍有增高。但差异无统计学意义(见表1)。
表1 损伤后各时间点血气分析结果 时间
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中度损伤组
重度损伤组
pH
PO2(kPa)
P CO2(kPa)
pH
PO2(kPa)
PCO2(kPa)
10min
7.37
13.8
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7.35
14.2
4.8
30min
7.40
14.2
5.20
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14.5
4.4
60min
7.38
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14.4
4.83
7.35
13.9
5.3
4h
7.34
13.9
4.95
7.41
14.3
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14.0
5.15
7.42
14.0
6.0
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7.36
14.7
5.27
7.38
15.2
5.2
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2.2 一氧化氮合酶活性变化
伤后不同时间点中、重度损伤组NOS活性变化趋势基本一致，以重度损伤组的变化幅度更为 明显。两组在损伤后10、30min、8h的差异具统计学意义(P<0.05)。损伤后10min 2组NO S活性明显升高，中度损伤组为脊髓未损伤组的1.63倍，重度损伤组为1.90倍，此后继续升 高，30min达高峰，分别为1.93倍、2.49倍，与对照组差异显著(P<0.05)。重度损伤差 异非常显著(P<0.01)。尔后骤然下降，伤后1、4、8h低于正常水平，但与对照组之间差 异不显著(P>0.05)。24h中度损伤组接近正常水平，重度损伤组仍低于正常水平(见图1 )。
实验组(中度损伤后30min)和未损伤组脊髓组织细胞中均有杂交阳性信号，呈蓝黑色，分布 特 点同NOS免疫组织化学所见相近似，主要集中在中央管周围及背角浅层，阴性对照为免疫反 应阴性，图像分析结果示实验组光密度值为0.291±0.019，对照组光密度值0.287±0.019， 二者间差异不显著(P>0.05)。
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图1 脊髓损伤后一氧化氮合酶活 性变化(倍)
□中度损伤组 ■重度损伤组
3 讨 论
根据功能NOS分为原生型(cNOS)和诱生型(iNOS)。生理条件下，cNOS存在于多种细胞内，产 生 微量NO，cNOS依赖钙、钙调蛋白。细胞内Ca++浓度稍有增高，尤其NMDA受体兴奋引起 的钙内流，可使其活性提高。在免疫刺激，细胞因子，创伤缺血等条件下，巨噬细胞、中性 粒细胞、神经胶质细胞及神经元等可表达iNOS，后者不依赖钙、钙调蛋白，一旦产生，便可 持续大量生成NO[4]。由于iNOS形成需历经cDNA转录、翻译、新蛋白合成等一系列 复杂过程，所以一般认为脊髓损伤早期NOS活性改变主要由cNOS引起。本实验观察到，脊髓 损伤后10min，NOS活性明显增高，30min达高峰。然后迅速下降，伤后1、4h持续低于正常水 平。其中以重度损伤组升高或降低的幅度更为明显。这是由于脊髓损伤后，兴奋性氨基酸( 尤其是谷氨酸)大量释放[5]，过度刺激N-甲基门冬氨酸(NMDA)受体，使受体依赖 Ca++通道开放，同时由于损伤后神经元广泛去极化，电压依赖钙通道亦开放，导致钙 离子大量流入细胞内，使细胞内钙离子浓度骤然增高，增加钙/钙调蛋结合，激活NOS。另外 ，由于局部组织破坏，血供减少，能量代谢阻碍，ATP生成减少，可使NOS去磷酸化，恢复活 性。因此，在损伤后短时间内导致NOS活性增加，NO爆发生成。然而过量生成的NO，不仅可 使NOS上巯基氧化，使酶失活，亦可作用于NMDA受体巯基氧化还原调定部位，致受体活性下 降，钙内流减少，同时损伤区一些激活的肽酶如细胞内蛋白激酶c、钙/钙调蛋白依赖性蛋白 激酶，cGMP依赖性蛋白酶等，可使NOS磷酸化，抑制其活性。此外，NOS发挥活性，需大量还 原性辅因子(如NADPH等)，其反应产物NO，又具高氧化特性，故随着大量NO生成，还原性辅 因子大量消耗，也使NOS活性下降。所以在脊髓损伤后早期出现一过性NOS活性骤然增加、骤 然降低，NO短时间内大量生成这一病理现象。有的学者发现脊髓缺血损伤后8h，损伤区有iN OS表达，而我们的测试体系仅是针对原生型NOS设计的，不能反映iNOS活性。重度损伤组1h 后各时间点NOS活性均低于正常，可能与组织破坏严重有关。本实验采用NOSmRNA原位杂交技 术，发现脊髓中度损伤前、后NOSmRNA表达强度没有明显变化，提示脊髓损伤30min，NOS活 性明显增高的机理可能主要是由于损伤而致的一些刺激因素，如细胞内钙离子浓度增高等， 使生理状态下，没有活性的酶蛋白激活，而不是通过基因表达增强，酶蛋白合成增加这一途 径。
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实验结果显示随着脊髓损伤程度加重，损伤早期NOS活性相应增加，提示NO可能与脊髓损伤 后的继发性损害有着密切关系。NO在正常大鼠脊髓血液循环调节中具有重要作用，而脊髓遭 受损伤后，常引起局部组织缺血，故脊髓损伤后早期NO的大量生成，可看作是机体的一种自 我保护反应。因NO可松驰血管平滑肌、抑制血小板聚集与粘附、增加损伤区及其周围血供、 对抗损伤所致的血管和痉挛、血流下降，从而起到组织保护作用，但短时间内过量NO生成， 又 可介导兴奋性氨基酸神经毒性，与超氧阴离子(O-2)反应，形成毒性很强的过氧化硝基 阴离子(OONO-)和羟自由基(OH-)引起广泛的脂质过氧化及蛋白质酪氨酸硝基化反应，与 细胞内许多酶的铁硫中心结合，破坏线粒体电子传递体系和柠檬酸循环，抑制靶细胞氧化呼 吸，干扰DNA双链，影响其转录翻译等，促使细胞死亡，产生组织损害[6]。
本课题获山东省卫生厅青年科技基金资助
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作者简介：赵立(1966-)，男，山东济宁市人，医学 博士。研究方向：脊柱脊髓损伤。电话：(0537)2903003 E-mail:Zhaoliwz@public.jiptt .sd.cn
参考文献：
〔1〕 Zhang J, Snydr SH.Nitric oxide in the nervous system[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol,1995,35:213～233.
〔2〕 Toda N, Okamura T.Role of nitric oxide in neurally induced cerebroarterial relaxation[J]. J Pharmacol Exp Ther,1991,258:1?027～1?032.
〔3〕 Bredt DS, Snyder SH.Isolation of nitric oxide synthase, a c almodulin-requiring enzyme[M]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87:682～685.
, http://www.100md.com
〔4〕 Induction of Cu/Zn superoxide dismutas-and nitric oxide sy nthase-like immunoreactivities in rabbit spinal cord after transient ischemia[ M]. Brain Research, 1996,732:69～74.
〔5〕 Dawson VL, Dawson TM, London ED, et al. Nitric oxide mediat es glutamate neurotoxicity in primary cortical culture[M]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:6?368～6?371.
〔6〕 Zhang J, Dawon VL, Dawon TM, et al. Nitric oxide activation of poly(ADP-ribose) synthetase in neurotoxicity[M]. Science, 1994,263:687～ 689.
(收稿：2000-02-22 修回：2000-04-25), 百拇医药